DB53∕T 1167.1-2023 异种移植医用供体猪 第1部分：遗传质量控制.pdf

ICS 65.020.30 CCS B43 53 云南省地方标准 DB53/T 1167.12023 异种移植医用供体猪 第 1 部分：遗传质量控制 2023-04-25 发布 2023-07-25 实施 云南省市场监督管理局 发 布 DB53/T 1167.12023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是DB53/T 1167-2023异种移植医用供体猪的第1部分。DB53/T 1167-2023已经发布了以下部分：第 1 部分：遗传质量控制；第 2 部分：微生物学和寄生虫学等级及监测；第 3 部分：病理学诊断规范；第 4 部分：环境及设施。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南农业大学提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。本文件起草单位：云南农业大学。本文件主要起草人：魏红江、王配、赵红业、成文敏、贾宝瑜、徐凯祥、李鸿辉、角德灵。DB53/T 1167.12023 III 引言“异种器官移植”即将人类以外物种的器官移植到人体内，延续人的生命，被认为是解决人类器官短缺最为有效的方法之一。异种移植医用供体猪与人类器官结构大小、生理生化、解剖特征接近，生长周期较短，繁殖能力高，涉及伦理学障碍相对较少，易于利用基因编辑技术克服异种器官移植免疫排斥反应，可被大规模生产等优点，自上世纪90年代开始被认为是异种器官移植最理想的供体。为了对异种移植医用供体猪生产进行指导和规范化生产，编制并发布DB53/T 1167异种移植医用供体猪地方标准，从遗传质量控制、微生物学和寄生虫学等级及监测、病理学诊断规范、环境及设施等环节指导和规范异种移植医用供体猪生产，可让从事异种移植医用供体猪生产相关人员按标准化和规范化程序开展异种移植医用供体猪养殖，带动异种移植医用供体猪规范化、标准化和产业化发展，利于大健康产业创新发展和惠及末期器官衰竭患者。DB53/T 1167由四个部分构成。第1部分：遗传质量控制。目的在于确立异种移植医用供体猪的命名、繁殖和遗传质量监测。第2部分：微生物学和寄生虫学等级及监测。目的在于确立异种移植医用供体猪微生物学和寄生虫学的等级分类、检测规则、检测程序和指标、检测方法、结果判定和判定结论等技术要求。第3部分：病理学诊断规范。目的在于确立异种移植医用供体猪的病理学检查的内容和方法，包括括检查规则、检查程序、临床病理学检查、解剖病理学检查、病理学诊断报告和检查结论等方面的技术要求。第4部分：环境及设施。目的在于确立异种移植医用供体猪对设施、环境条件的技术要求，环境条件及设施设计、施工、工程验收及经常性监督管理，同时规定了对饮水和笼具的要求。DB53/T 1167.12023 1 异种移植医用供体猪 第 1 部分：遗传质量控制 1 范围 本部分规定了异种移植医用供体猪的命名、繁殖和遗传质量监测。本部分适用于异种移植医用供体猪的遗传质量控制。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 14923 实验动物 遗传质量控制 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。异种移植医用供体猪 Medical grade donor pig for xenotransplantation 选择遗传背景明确的人工培育的实验猪只，利用基因编辑技术，针对异种移植后移植物在受体体内不同阶段的免疫排斥反应，选择可以引起超急性/急性免疫排斥，以及参与调节补体系统、凝血功能，控制感染等的关键基因（以下简称“异种移植关键基因”）加以修饰，制备适合不同细胞、组织和器官的异种移植医用供体猪，用于医用异种移植供体、科学研究、教学、生产和质量控制鉴定以及其他科学实验的基因编辑猪。4 命名 按照GB 14923中遗传修饰动物命名规则执行。5 繁殖 原则 保持异种移植医用供体猪基因修饰的稳定性以及在后代的稳定遗传。引种 作为繁殖用种猪的异种移植医用供体猪必须遗传背景明确或来源清楚，有完整的遗传背景档案（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特征等），不携带世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指定供体动物应排除的潜在感染或条件致病和感染性人畜共患病病原，且所修饰的异种移植关键基因稳定。DB53/T 1167.12023 2 建系 5.3.1 同一基因修饰类型的纯合子异种移植医用供体猪公母个体进行交配，获得相同基因修饰的异种移植医用供体猪群体。5.3.2 或将基因修饰的异种移植医用供体猪与野生型猪交配，筛选 F1 代中基因修饰的杂合子进行交配获得 F2 代，获得 F2 代中与亲代相同基因修饰的个体，进行组群建系。5.3.3 或不同基因修饰类型的异种移植医用供体猪公母个体进行交配，获得不同基因修饰的异种移植医用供体猪群体，并根据异种移植需求设计新的不同基因修饰组合。方法 具体繁殖方法按照GB 14923执行。6 遗传质量监测 抽样 6.1.1 按表 1 要求随机抽取异种移植医用供体猪进行检测。6.1.2 异种移植医用供体猪在开展异种移植手术前均应进行检测。表1 异种移植医用供体猪遗传检测抽样要求 群体规模（N头）抽样数量（N头）N100 5 100N500 10 N500 20 检测方法 通过PCR、测序、流式细胞术、免疫组化和免疫印迹等检测方法对所修饰的异种移植关键基因进行检测，以确认修饰基因在异种移植医用供体猪的表达。具体检测方法可参见附录A和附录B。结果判定 见表2。表2 异种移植医用供体猪遗传质量检测结果判定 检测结果 判 定 在个体基因组中，所修饰的异种移植关键基因与预期的插入或缺失基因型一致，且达到预期表达水平 未发生遗传变异 在个体基因组中，所修饰的异种移植关键基因与预期的插入或缺失基因型不一致；或所修饰的异种移植关键基因与预期的插入或缺失基因型一致，但是未能达到预期表达水平 发生遗传变异 判定结论 所有样品检测的基因都符合预期所修饰基因的遗传质量检测标准，则判定该异种移植医用供体猪合格。否则判为不合格。DB53/T 1167.12023 3 A A 附录A （资料性）异种移植医用供体猪敲除基因的鉴定 A.1 原理 猪 1,3半乳糖基转移酶（GGTA1）是合成猪血管内皮细胞上的 半乳糖（-Gal）抗原的酶，-Gal抗原是人天然抗体的靶位点，是引起异种器官移植超急性/急性排斥反应的重大障碍。一般来说，异种移植医用供体猪都需敲除该基因。因此，我们以猪GGTA1基因敲除如何鉴定为例，介绍异种移植医用供体猪基因敲除的检测方法。检测方法主要有PCR法和间接法。A.2 PCR 法 提取GGTA1基因敲除猪的基因组DNA，设计引物，对目的片段进行PCR扩增后，电泳鉴定。以野生型猪作为阴性对照，评价扩增出的目的条带是否为预期长度，进行克隆测序确定有无敲除、单敲还是双敲。A.3 间接法-Gal抗原是GGTA1的作用产物，对-Gal抗原的检测可以间接地反映GGTA1基因编码GGTA1酶的表达水平。也可以检测GGTA1蛋白表达来推断GGTA1基因是否敲除成功。对-Gal表位或GGTA1蛋白进行检测的方法有荧光显微镜观察或流式细胞技术、免疫组化分析（IHC）和免疫印迹方法（WB）。A.4 材料与方法 A.4.1 样品类型 耳组织样品、血样或脏器组织等。A.4.2 猪耳组织成纤维细胞的分离 异种移植医用供体猪出生后，挑选耳组织上血管较细少的部位，用酒精擦拭消毒，取1块约0.5 cm2猪耳皮肤组织，置于含青霉素-链霉素的PBS中，在超净工作台上将组织块清洗3遍，再放入不含青霉素-链霉素的PBS中清洗3遍，去毛、充分剪碎。组织块放入细胞培养瓶中，加入胶原酶溶液（79%DMEM，20%FBS，1%双抗，0.1%胶原蛋白酶），放入培养箱中消化培养2 h4 h后离心去除胶原酶，收集细胞，加入培养液（89%DMEM，10%FBS，1%双抗），于37、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。A.4.3 方法 A.4.3.1 基因组 DNA 提取 用眼科剪沿猪耳朵的边缘，剪下小块耳组织，对应编号，按照基因组提取试剂盒的操作说明提取DNA，使用紫外分光光度计检测提取到的基因组DNA浓度和纯度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。A.4.3.2 PCR 扩增 根据NCBI上公布的猪GGTA1基因序列及设计的敲除质粒的对靶序列，在距离靶序列上下游100 bp400 bp，使用引物设计软件Primer Premier5设计基因敲除检测引物。以提取的异种移植医用供体猪基因组DNA为模板，经PCR扩增目的片段。GGTA1敲除鉴定引物序列为F:TGAATGACTGAATGGTGGAGAG,R:GTGGGTTTGTTGAGAAGGAAATAC。PCR反应体系为2Premix Taq 15 L，提取的基因组1 L，F 0.5M，R 0.5 M，ddH2O 补足至30 L。PCR产物送测序公司测序，若测序结果为双峰，要求测序公司返回PCR回收纯DB53/T 1167.12023 4 化产物，连接到pMD-18T载体，16 连接3 h后经转化，涂板，37 培养12 h左右后，将细菌培养皿送测序公司，挑取10个克隆以通用M13引物测序鉴定GGTA1基因突变类型。A.4.3.3 流式细胞技术检测-Gal 抗原 以293T细胞作为阴性对照，未编辑GGTA1的猪成纤维细胞作为阳性对照，取GTKO猪的成纤维细胞用于流式细胞分析。消化收集细胞，用PBS重悬清洗细胞3次，用FITC-GS-IB4凝集素在37 下染色，用PBS清洗两次并重新悬浮在PBS中，用流式细胞仪进行分析，计算基因敲除细胞的比率。A.4.3.4 荧光显微镜检测-Gal 抗原 将成纤维细胞（GTKO）、阴性对照细胞（293T）和阳性对照细胞在盖玻片上培养24 h，用4%的多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次。将细胞在室温下用Triton X-100孵育，并用PBS清洗。然后用1%的牛血清白蛋白（BSA）在室温下封闭1 h，PBS清洗3次。使用切片封闭液稀释的FITC-GS-IB4 lectin，4孵育过夜。PBS清洗载玻片，用DAPI对细胞核进行染色。PBS清洗3遍。80%甘油封片，在荧光显微镜下观察。A.4.3.5 IHC 采集敲除猪及野生型对照猪的同月龄的脏器组织，将脏器切片置于模具中，并加入少量的OCT以覆盖该组织。冷冻块在-80 下保存，直到使用。将组织平衡到低温恒温器的温度（-20），并切割成所需的厚度（通常为5 m）。将组织切片用4%的多聚甲醛固定，PBS清洗三次。将玻片在3%的H2O2和甲醇溶液中孵育，PBS洗3次，干燥。室温下，将玻片用5%的BSA封闭。然后将组织切片与抗gal抗体在4 下孵育过夜。PBS清洗后，将组织切片与IHC试剂盒中的生物素化抗体孵育，并用DAB（3,3-二氨基联苯胺）进行染色。染色后清洗并用中性树胶固定，显微镜下观察并采集图像。A.4.3.6 WB 分别取敲除猪只与野生猪只脏器组织样本研磨成细粉状，加入适量RIPA裂解液，冰上裂解，收集裂解液，冷冻高速离心，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，添加上样缓冲液，100 水浴中进行蛋白质变性。利用合适浓度的SDS-PAGE胶分离蛋白，转PVDF膜，在4 下与GGTA1和-肌动蛋白一抗反应过夜。孵育后，洗净膜并与二抗孵化。用ECL发光液孵育，用成像系统进行可视化。A.5 结果判定 A.5.1 PCR结果判定 按照设计的反应体系和扩增条件，扩增出猪GGTA1长度为752 bp，经克隆测序后，读峰图，与原序列比对，确定具体序列敲除情况，判定发生单敲、同源双敲或者异源双敲。图A.1示例了单敲和双敲的测序序列比对结果以及异源双敲的测序峰图。只有双敲的GGTA1异种移植医用供体猪才能判定成功敲除。DB53/T 1167.12023 5 图A.1 GGTA1 基因敲除猪的 PCR 鉴定 A.5.2 流式分析结果判定 从GGTA1 KO猪分离PEFs，并用FITC-GS-IB4染色经流式细胞分析检测，需显示细胞表面的Gal蛋白完全缺失，才能敲除成功。图A.2示例了GGTA1基因敲除小猪的流式细胞分析鉴定图。图A.2 GGTA1 基因敲除猪的流式细胞分析鉴定 DB53/T 1167.12023 6 A.5.3 荧光显微镜检测-Gal抗原结果判定 取GGTA1 KO猪的PEFs，经GS-IB4染色，荧光显微下观察，阳性对照有绿色荧光，而GGTA1 KO猪的PEFs细胞膜表面需无绿色荧光，即未检测到Gal表达才能判定敲除成功。图A.3示例了3头小猪GGTA1基因敲除的荧光显微镜检测-Gal抗原结果图。注：BMI为阳性对照 图 A.3 GGTA1 基因敲除猪的荧光显微镜分析鉴定 A.5.4 IHC分析判定 GTKO猪的主要器官制作为切片，以抗gal抗体为一抗，经IHC分析染色分析观察，阳性对照有染色，而GGTA1 KO猪的组织细胞表面需无染色，即未检测到Gal表达才能判定敲除成功。图A.4示例了GGTA1基因敲除的猪心脏、肝脏、肾脏和胰腺检测-Gal抗原结果图。图 A.4 GGTA1 基因敲除猪的 IHC 分析鉴定 DB53/T 1167.12023 7 A.5.5 WB分析判定 使用抗GGTA1单克隆抗体为一抗，提取GGTA1-KO猪只脏器蛋白，利用Western blot检测该蛋白。以WT为阳性对照，GGTA1-KO猪中未检测到GGTA1蛋白才能判定敲除成功。图A.5示例了GGTA1基因敲除的猪WB检测结果图。图 A.5 GGTA1 基因敲除猪的 WB 鉴定 DB53/T 1167.12023 8 附录B （资料性）异种移植医用供体猪敲入基因的鉴定 B.1 原理 猪虽然是异种器官移植的优良供体，但从猪到灵长类的异种器官移植中，会发生免疫排斥反应，这也是异种器官移植研究中亟待解决的重要难题之一。敲除GGTA1基因供体猪的制备，虽然在一定程度上解决了异种器官移植超急性免疫排斥反应，但补体介导的排斥反应，仍是机体排斥外源移植物的主要方式之一。高效表达人补体调节蛋白（human complement regulatory protein，hCRP）基因如hCD55和hCD59等，能有效地降低异种器官移植的免疫排斥反应。因此，我们以hCD55和hCD59基因敲入如何鉴定为例，介绍异种移植供体猪基因敲入的检测方法。检测方法主要有PCR法和间接法。B.2 PCR 法 提取hCD55和hCD59敲入猪只基因组DNA，根据敲入基因hCD55和hCD59设计引物，对目的片段进行PCR扩增后，电泳鉴定。以野生型猪作为阴性对照，评价扩增出的目的条带是否为预期长度，确定敲入是否成功。也可采用绝对定量qPCR技术，以已知的猪单拷贝基因为内参，确定敲入基因的拷贝数。B.3 间接法 B.3.1 材料 B.3.1.1 样品类型 同附录A。B.3.1.2 猪耳组织成纤维细胞的分离 同附录A。B.3.2 方法 B.3.2.1 基因组 DNA 提取 同附录A。B.3.2.2 PCR 扩增 hCD55 和 hCD59 敲 入 鉴 定 引 物 序 列 为 F:GCTGTCTTCTGCCATTCAGGTCATAG,R:TCTGGG TGGACAGGTAGTGGTTATC。PCR反应体系同附录A。B.3.2.3 hCD55 和 hCD59 拷贝数检测 猪pCMV-hCD55-T2A-hCD59-Neo和pMD18-TFRC质粒鉴定的引物分别为5-CGACCACTACCAGCAGAATAC-3（正向），5-CACGAAGCCGAAGTAGATCAT-3（反向）和5-GAGACAGAAACTTTCGAAGC-3（正向），5-GAAGTCTGTGGTATCCAATCC-3（反向）。从hCD55和hCD59敲入猪提取DNA用作qPCR检测的模板。反应体系包括10 L 2TB Green、1L cDNA、1 L正向引物、1 L反向引物和7 L ddH2O，使用荧光定量PCR仪进行qPCR扩增。反应条件为：95 3 DB53/T 1167.12023 9 min，95 5 s，55 30 s，45个循环，熔融曲线：65 至95，5 s升高0.5。hCD55/hCD59拷贝数和TFRC拷贝数用以下方程计算：CthCD55/hCD59=3.653 log（X）+37.869；CtTFRC=3.491 log（X）+38.061。最后以CthCD55/hCD59与CtTFRC的比值作为hCD55/hCD59基因敲入的拷贝数。B.3.2.4 荧光显微镜检测 hCD55 和 hCD59 蛋白表达 步骤同附录A。将4 过夜孵育抗体换为anti-CD55和anti-CD59抗体。B.3.2.5 免疫组化分析 步骤同附录A。将4 过夜孵育抗体换为anti-CD55和anti-CD59抗体。B.3.2.6 免疫印迹分析 步骤同附录A。将4 过夜孵育抗体换为anti-CD55和anti-CD59。B.4 结果判定 B.4.1 PCR结果判定 根据试验设计，预期敲入的hCD55和hCD59片段长度为1591 bp，按照设计的反应体系和扩增条件，如果出现1591 bp的hCD55和hCD59目的片段，判定hCD55、hCD59成功敲入。图B.1示例了hCD55和hCD59基因敲入猪的PCR鉴定胶图。图 B.1 hCD55 和 hCD59 基因敲入猪的 PCR 鉴定 B.4.2 hCD55和hCD59拷贝数检测结果判定 用绝对定量qPCR方法检测hCD55和hCD59基因敲入猪中hCD55和hCD59的拷贝数，若拷贝数大于等于1，判定hCD55、hCD59成功敲入。图B.2示例了hCD55和hCD59基因敲入猪的拷贝数鉴定结果，hCD55和hCD59的拷贝数在脑组织中约为4，在肺组织中约为2个拷贝。图 B.2 hCD55 和 hCD59 基因敲入猪的拷贝数鉴定 B.4.3 荧光显微镜检测hCD55和hCD59蛋白表达结果判定 DB53/T 1167.12023 10 取hCD55和hCD59基因敲入猪的PEFs，经荧光标记的hCD55和hCD59抗体染色，荧光显微下观察，对照没有荧光，而hCD55和hCD59基因敲入猪的PEFs细胞膜表面需有绿色/红色荧光，即能检测到hCD55和hCD59蛋白表达才能判定敲入成功。图B.3和图B.4分别示例了hCD55和hCD59基因敲入猪的荧光显微镜检测结果图。图 B.3 hCD55 基因敲入猪的荧光显微镜分析鉴定 图 B.4 hCD59 基因敲入猪的荧光显微镜分析鉴定 B.4.4 IHC分析判定 hCD55和hCD59基因敲入猪的主要器官制作为切片，以抗hCD55和hCD59抗体为一抗，经IHC分析染色分析观察，对照无染色，而hCD55和hCD59敲入猪的组织细胞表面有染色，即能检测到hCD55和hCD59蛋白表达才能判定敲入成功。图B.5和图B.6分别示例了hCD55和hCD59基因敲入猪的心脏、肝脏、肾脏和胰腺检测结果图。DB53/T 1167.12023 11 图 B.5 hCD55 基因敲入猪的 IHC 分析鉴定 图 B.6 hCD59 基因敲入猪的 IHC 分析鉴定 B.4.5 WB分析判定 使用抗hCD55和hCD59抗体为一抗，提取hCD55和hCD59敲入猪只脏器蛋白，利用WB检测该蛋白。hCD55和hCD59敲入猪中可检测到hCD55和hCD59蛋白才能判定敲入成功。图B.7示例了hCD55和hCD59敲入猪的WB检测结果图。DB53/T 1167.12023 12 图 B.7 hCD55 和 hCD59 基因敲入猪的 WB 鉴定 DB53/T 1167.12023 13 参考文献 1 Liu FJ,Liu JJ,Yuan ZM,et al.Generation of GTKO Diannan miniature pig expressing human complementary regulator proteins hCD55 and hCD59 via T2A peptide-based Bicistronic vectors and SCNTJ.Molecular biotechnology,2018,60(8):550-562.2 Zhao H,Li YY,Wiriyahdamrong T,et al.Improved production of GTKO/hCD55/hCD59 triple-gene-modified Diannan miniature pigs for xenotransplantation by recloningJ.Transgenic Research,2020,29(3):369-379.3 Cheng WM,Zhao H,Yu HH,et al.Efficient generation of GGTA1-null Diannan miniature pigs using TALENs combined with somatic cell nuclear transferJ.Reproductive Biology and Endocrinology,2016,14(1):1-10.4 Liu FJ,Liu JJ,Yuan ZM,et al.Generation of GTKO Diannan miniature pig expressing human complementary regulator proteins hCD55 and hCD59 via T2A peptide-based Bicistronic vectors and SCNTJ.Molecular biotechnology,2018,60(8):550-562.5 Zhao H,Li YY,Wiriyahdamrong T,et al.Improved production of GTKO/hCD55/hCD59 triple-gene-modified Diannan miniature pigs for xenotransplantation by recloningJ.Transgenic Research,2020,29(3):369-379.6 Xin JG,Yang HQ,Fan NN,et al.Highly Efficient Generation of GGTA1 Biallelic Knockout Inbred Mini-Pigs with TALENsJ.PLoS ONE,2013,8(12):e84250.