核桃饼粕蛋白最佳酶解条件研究.doc

云南中医学院
2023届攻读学士学位本科生毕业论文(设计)

核桃饼粕蛋白酶解工艺的初步研究

学 院 中 药 学 院
学生姓名 程 祥 云
专 业 食品科学与工程
实习单位 功能食品教研室
导师姓名 赵声兰（专家）

六月十六号
目 录
摘 要 3
1.引言 3
2.仪器与试剂 4
2.1 仪器 4
2.2 试剂 4
3.方法 4
3.1 核桃蛋白酶解工艺优化 4
3.1.1 酶解工艺流程 4
3.1.2总蛋白质含量的测定—凯氏定氮法 5
3.1.2.1原理： 5
3.1.2.2方法： 5
3.1.3 酸溶蛋白氮含量的测定： 5
3.1.4 游离氨基酸态氮（AN)的测定—甲醛滴定法 6
3.1.4.1原理 6
3.1.4.2方法 6
4.结果与讨论 6
4.1 核桃蛋白酶解工艺的拟定 6
4.1.1单因素分析 6
4.1.1.1 超声时间对核桃水解作用的影响 6
4.1.1.2 最佳酶的选择 7
4.1.1.3 pH对酶解反映的影响 7
4.1.1.4 加酶量对酶解反映的影响 8
4.1.1.5 酶解温度对酶解反映的影响 9
4.1.1.6 酶解时间对酶解反映的影响 9
4.1.2正交实验拟定最佳酶解条件 10
5.讨论 12
致 谢 14

核桃蛋白酶解工艺的初步研究
实习学生：陈 菱（2023级食品科学与工程班)
指导教师：赵声兰（专家、云南中医学院）
摘 要：目的：研究超声时间对核桃蛋白提取的影响和核桃蛋白酶解的适宜工艺条件，为以后的核桃蛋白多肽的开发运用提供依据。方法：酶解工艺研究采用单因素法和正交实验法，游离氨基酸的测定采用甲醛滴定法，蛋白质的含量测定采用凯氏定氮法。结果：中性蛋白酶水解核桃蛋白的最适反映条件是：温度45℃，pH为8，加酶量为6500 u/g，底物浓度为1/20，反映时间为2h。结论：与普通提取法相比，超声波提取法对核桃蛋白的溶出率有一定提高，水解度与多肽含量影响不大；酶解法的效果比较明显，酶解法核桃蛋白的溶出率，水解度和多肽含量都有大幅度提高。所以核桃蛋白的水解方法以酶解法较好。
关键词：酶解工艺；优化;核桃饼粕蛋白；多肽；游离氨基酸。

1.引言
核桃又名胡桃，羌桃，万岁子，系胡桃科核桃属植物，其使用部位为果实的仁，它与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果。中国是世界上核桃产量最高的国家，2023年核桃栽培年产量达26万t［1］.核桃仁具有丰富的蛋白质，不饱和脂肪酸，维生素E和微量元素等，现代医学证明，核桃对各种不同年龄的人均有不同的医疗保健作用，因此，核桃是一种对人体有补气养血，温肠补肾，润肺止咳，乌发健脑作用的优良干果仁食物。核桃仁中的重要营养物质分为脂肪和蛋白质，8种人体必需脂肪酸构成合理，其中异亮氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸接近或超过WHO/FAO规定的氨基酸类人体必须量的标准值［2-4］。近来来科学研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非重要以氨基酸形式吸取，而是以肽的形式吸取［5］。某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时具有防病治病、调节人体机能等多种生理功能，有些原蛋白质或其组成氨基酸所没有的独特的生理机能，但水解为多肽后会具有活性，这也是生物活性肽引起当今食品学界广泛重视的重要因素。特别是活性肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸，这就为人类更为充足运用蛋白质资源，特别是那些原本认为生物价不高的蛋白质资源生产能更好满足人类健康需要的基料，提供了新的机遇［6］。目前国内对核桃蛋白质的研究很多，但是对多肽的进一步研究是少之又少。本文综合考虑蛋白质溶出率，水解度和多肽含量三个指标，研究核桃蛋白质的降解工艺，为核桃的进一步开发运用奠定基础。
2.仪器与试剂
2.1 仪器
电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），雷磁pHS-3C型pH计（上海精密科学仪器有限公司），KDY-12型消化炉（北京强盛分析仪器制造中心凯氏定氮仪），QSY系列凯氏定氮仪 （北京强盛分析仪器制造中心凯氏定氮仪），L-550型低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器系统有限公司），电热恒温水浴锅 （上海医疗器械五厂），超声仪（SK3300LH,上海科导超声仪器有限公司）79-2磁力加热搅拌器（常州国华电器有限公司），电烘箱（上海实验仪器厂有限公司）。
2.2 试剂
硫酸（汕头市达濠区精细化学品有限公司），硫酸钾（北京化工厂），硫酸铜（成都化学试剂厂），硼酸（上海试剂四赫维化工有限公司），甲醛溶液（天津市致远化学试剂有限公司），30%过氧化氢（天津市申泰化学试剂有限公司），三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（天津致远化学试剂有限公司），无水碳酸钠（上海虹光化工厂），以上试剂均为分析纯。实验中所用水均为纯净水。
甲基红（天津市化学试剂六厂三分厂），溴甲酚绿指示剂(上海试剂总厂第三分厂），酚酞指示剂（天津化学试剂厂），工作基准剂邻苯二甲酸氢钾（中国医药集团上海化学试剂公司）。
中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶均为5万u/g，纤维素酶为1500u/g。
3 方法
3.1 核桃蛋白酶解工艺优化
3.1.1 酶解工艺流程［7］
核桃仁 → 去皮（碱液去皮法［8］） → 磨浆 → 调pH → 酶解 → 灭酶 →（3mol/L柠檬酸，调pH4.0~4.5) → 离心（3500r/min,20min） → 除去沉淀与乳化层 → 清液。

3.1.2 分析方法［9］核桃蛋白质溶出率液相中蛋白质的质量

多肽含量=（酸溶蛋白质含量-游离氨基酸含量）×6.25
3.1.2.1总蛋白质含量的测定—凯氏定氮法［10-12］
3.1.2.1.1原理：
样品加入浓硫酸消化，其中的氮素与硫酸反映生成硫酸铵，加碱蒸馏，用硼酸溶液吸取蒸馏出的氨气，硫酸滴定蒸馏中得到的硼酸铵。根据硫酸的消耗量计算待测样品的蛋白质含量。化学反映试如下：
2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4  → (NH4)2SO4 +6CO2 + 12SO2 + 16H2O

(NH4)2SO4 + 2NaOH  → 2NH3 + 2H2O + Na2SO4

2NH3 + 4H3BO3  →  (NH4)2B4O7 + 5H2O

(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O  → (NH4)2SO4＋4H3BO4
3.1.2.1.2环节：
取10ml清夜于洁净消化管中，加入0.10g硫酸铜，0.50g硫酸钾和10ml浓硫酸，于消化炉上消化至样液澄清透亮，取出，自然冷却，于凯氏定氮仪上蒸馏，用0.05mol/L的硫酸溶液滴定至终点，据硫酸标准溶液的消耗量，计算蛋白质含量。
计算公式：
X—为样品中蛋白质的含量; V1—为样品消耗盐酸标准液的体积;
C —为盐酸标准液的浓度; V2—为试剂空白消耗盐酸标准液的体积;
MN—为氮的摩尔质量，14; W—为样品的质量;
K—为氮换算为蛋白质的系数，6.25。
3.1.2.2 酸溶蛋白氮含量的测定：
取清夜10ml，加入10%TCA（三氯乙酸）溶液10ml，混合均匀，静置3分钟。立即用滤纸过滤，直到滤液完全透明。取10ml滤液测定蛋白氮的含量，乘以2即为原液酸溶蛋白氮的含量。
3.1.2.3 游离氨基酸态氮（AN)的测定—甲醛滴定法［13］
3.1.2.3.1原理：
氨基酸为两性电解质。在接近中性的水溶液中，所有解离为双极离子。当甲醛溶液加入后，与中性的氨基酸中的非解离型氨基反映，生成单羟甲基和二羟甲基诱导体，此反映完全定量进行。此时放出氢离子可用标准碱液滴定，根据碱液的消耗量，计算出氨基态氮的含量。
3.1.2.3.2环节：
（1）将酸度计接通电源，预热30min后，用pH6.86的 缓冲溶液矫正pH计。
（2）吸取试样10ml于烧杯中，加5滴30%过氧化氢，将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入烧杯内试样中适当位置。如需要加适量蒸馏水。
（3）开动磁力搅拌器，先用0.1mol/L氢氧化钠溶液慢慢中和试样中的有机酸。当pH达成7.5左右时，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液调至pH8.1，并保持1min不变。然后慢慢加入10ml的中性甲醛溶液，1min后用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH8.1。记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。
（4）测定结果表达如下公式：

C—氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L;
V1—加入中性甲醛溶液后，消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积，ml;
V2—10ml空白所消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积，ml；
m—样品的质量，g;
14—1ml1N氢氧化钠标准滴定溶液相称于氮的毫克数。
4.结果与讨论
4.1 核桃蛋白酶解工艺的拟定

4.1.1单因素分析
其他固定条件不变，逐个改变pH，加酶量，温度，酶解时间这几个酶解参数进行实验，绘制出相应的酶解反映曲线。
4.1.1.1 超声时间对核桃水解作用的影响
以水解度和蛋白质溶出率为指标，超声不同时间后，在55℃下水解2h，研究不同超声时间对核桃蛋白质水解作用的影响，实验结果如图1。

由图1可知，随着超声时间增长，蛋白质溶出率逐渐增大，但当超生时间到45min后，溶出率增长很缓慢。超声时间的长短对水解度影响不大，都很低。
4.1.1.2 酶的选择
以水解度，蛋白质溶出率与多肽含量为指标，研究中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、碱性蛋白酶在加酶量为1500u/g,酶解时间为1h,温度为40℃，自然pH条件下对核桃蛋白酶解作用，实验结果如图2

由图2可知，四种酶对核桃蛋白水解能力有较大差别，综合溶出率，水解度和多肽含量三个指标，选择中性蛋白酶为以下实验用酶。
4.1.1.3 pH对酶解反映的影响
在底物浓度为1/20，加酶量为5200u/g ,酶解时间为1h , 温度为40℃的条件下，研究不同pH条件下中性蛋白酶对核桃酶解作用的影响，实验结果如图3：

由图3可知，当pH＜9时，随着pH增大，水解度与溶出率逐渐增大；但当pH＞9时，溶出率与水解度呈下降趋势，所以pH为9时为最适pH值。
4.1.1.4加酶量对酶解反映的影响
在底物浓度为1/20,pH值为9.0,酶解时间为1h , 温度为40℃的条件下，研究不同加酶量对核桃酶解反映的影响，实验结果如图4.

由图4可知，当底物浓度保持不变时，随着加酶量的增长，核桃蛋白的溶出率，水解读和多肽含量三个指标均逐渐提高，但当加酶量超过6500 u/g后，三者的增长趋势缓慢，选择6500u/g的加酶量进行以下实验。
4.1.1.5酶解温度对酶解反映的影响
在底物浓度为1/20，加酶量为6500u/g，pH值为9.0,酶解时间为1h的条件下，选择不同的酶解温度，得到的实验结果如图5：

由图5可得，蛋白质溶出率最高的点是55℃；多肽含量随温度的升高不断增大，但逐渐增长缓慢；水解度有呈下降的趋势，但是变化不大；所以选择55℃为最适温度。
4.1.1.6 酶解时间对酶解反映的影响
在底物浓度为1/20，加酶量为6500u/g,pH值为9.0,酶解温度为55℃的条件下，选择不同的酶解时间，实验结果如图6。

由图6可知，蛋白溶出率，水解度和多肽含量三个指标都随着酶解时间的增长而提高，当酶解时间达成2h后，三个指标的增长速度已经很慢，为了节约时间，选择2h为正交实验的反映时间。
4.1.2正交实验拟定最佳酶解条件
正交实验中以水解度为指标研究较适宜的酶解工艺条件。影响酶解反映的几个重要因素pH值，温度，酶量，反映时间，根据以上单因素实验分析，决定采用底物浓度为1/20，反映时间为2h，进行pH值，温度，酶量的三因素三水平的正交实验，正交实验的因素水平选取如表：
表1 正交设计L9(34）
因素
水平
A pH
B 温度（℃）
C 酶量（u/g)
1
8
45
5200
2
9
55
6500
3
10
60
7800

表 2 实验及极差分析
实验号
A
B
C
D（空）
测试指标：水解度（%）
反复I
反复II
Ti
1
1
1
1
1
33.9054
35.4889
69.3943
2
1
2
2
2
37.8713
39.8084
77.6753
3
1
3
3
3
43.3879
44.0024
87.3903
4
2
1
2
3
37.3636
38.1291
75.4927
5
2
2
3
1
45.4111
45.5809
90.992
6
2
3
1
2
28.9736
29.0910
58.0646
7
3
1
3
2
43.5056
43.8952
87.4008
8
3
2
1
3
26.3461
28.7381
55.0842
9
3
3
2
1
36.1484
37.4013
73.5497
T1
234.4599
232.2878
182.5431
233.936
332.913
342.1309
675.0439
T2
224.5493
223.7515
226.7177
223.1407

T3
216.0347
219.0046
265.7831
217.9672

X1
39.0767
38.7146
30.4239
38.9893

X2
37.4249
37.2919
37.7863
37.1901

X3
36.0058
36.5008
44.2972
36.3279

R
3.0709
2.2138
6.5109

表3 方差分析
方差来源
离差平方和
自由度
均方和
F值
显著性
A
28.3448
2
13.3909
6.3751
*
B
15.1024
2
7.5512
3.5950

C
578.1332
2
289.0666
137.6180
* *
e
23.1056
11
2.1005

F0.05(2,11)=3.98, F0.01(2,11)=7.21
由表2和表3可知，影响中性蛋白酶水解核桃蛋白质的主次因素为：加酶量＞pH＞温度，三个因素的最佳反映条件分别为A1,B1,C3,即中性蛋白酶水解核桃蛋白的最适反映条件是：温度45℃，pH为8，加酶量为6500 u/g，底物浓度为1/20，反映时间为2h。在此条件下，核桃蛋白的溶出率约为76%，水解度可达37%左右，多肽含量也可达60mg/g。
5.讨论及结论
5.1 实验采用了凯氏定氮法测定蛋白质，甲醛滴定法测定游离氨基酸发现凯氏定氮法误差较大，且操作过程复杂，花费时间长。甲醛滴定法相对来说比较简朴。
5.2虽然,凯氏定氮法为测定含氮量抽象算蛋白质的方法,测定结果的反复性和重现性都很好。但此法操作繁琐,试剂消耗量大,消化时排放的SO2 ，对人体健康导致直接危害,并且费时、费电、费水。
5.3在蛋白质的消化过程中加入由硫酸铜和硫酸钾组成的加速剂能大大缩短消化时间;加浓硫酸的时候要小心喷出来;消化时温度要逐渐由低到高；滴定的时候要注意观测，不同的指示剂其滴定终点的颜色不同，应选择灵敏的指示剂。
5.4 中性蛋白酶水解核桃蛋白的最适反映条件是：温度45℃，pH为8，加酶量为6500 u/g，底物浓度为1/20，反映时间为2h。

参考文献：
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致 谢
时光飞逝，不知不觉中我的大学生涯已接近尾声，回想起大学四年所经历的点点滴滴，有欢乐也有悲哀，构成了一副丰富多彩的人生画卷。
一方面，我要感谢四年来对我进行言传身教的老师们，正由于您们的关怀和帮助，才使我能顺利的完毕学业，在此一并致以衷心的感谢！特别是在三个多月的实习过程中，赵声兰老师给了我巨大的鼓舞和帮助。导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的崇高师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。导师不仅授我以文，并且教我做人，虽历时三个月，却赋予我终生受益无穷之道。“授人以鱼，不如授之以渔”赵老师正是这样以言传身教来教导着我们。她教会我如何查找文献、阅读文献，教会我基本的科研思维和方法，是赵老师孜孜不倦的教导和细心指导，使我学到了很多从书本上无法学到的知识、生活经验以及实验技巧，让我在大学生活的最后三个月受益匪浅，本论文从选题到完毕，每一步都是在赵声兰老师的指导下完毕的，倾注了导师大量的心血,借此机会，向她表达我真挚的敬意和衷心的感谢，谢谢您——赵老师，您辛劳了！
另一方面，我还要感谢本次论文中给我提供部分实验仪器的陈朝银、赵荣华老师以及给我很大帮助的两位师姐，由于有了她们,我在本次论文的设计中碰到的困难才干得以及时的解决，感谢这三个月来她们对我的爱惜、包容和帮助，在此我向她们致以真挚的敬意和衷心的感谢！ 
最后，感谢各位论文评阅专家和专家在百忙之中抽出时间来评阅我的论文，并给予我了莫大的帮助和指导。

2023级食品科学与工程班
陈菱
2023年5月16日