化妆品用透明质酸钠的质量标准及检验方法研究（学位论文）.pdf

分类号:密级:单位代码：10422学 号：201122107919 01/SHANDONG UNIVERSITY硕士学位论文Thesis for Ma st er Degree（专业学位）论文题目：化妆品用透明质酸钠的质量标准及检验方 法研究Study on the Quality Standards and Test Methods of Cosmetic Use of Sodium Hyaluronate 山东大学硕士学位论文目录摘要.ABSTRACT.V第一章前言.11.1 HA的分布状况、结构、性质和生理功能.21.1.1 HA的分布状况.21.1.2 HA的结构.21.1.3 HA的性质.21.1.4 HA的生理功能.41.2 HA在化妆品中的应用网.61.2.1 保湿作用在化妆品中的应用.61.2.2 营养作用在化妆品中的应用.61.2.3 皮肤损伤的修复和防晒作用.6124润滑性及成膜性.71.2.5 增稠作用.71.2.6 来源.7第二章化妆品用透明质酸钠质量标准的确定及内容.92.1 化妆品用透明质酸钠质量标准的确定.92.2 化妆品用透明质酸钠质量标准的内容.92.2.1 透明质酸钠的化学名称、国际名称、中文名称、分子式、分子量及化学结构式.92.2.2 化妆品用透明质酸钠的理化卫生质量标准应符合表2-1要求。.10第三章化妆品用透明质酸钠理化卫生质量指标的检测.153.1 检验样品.153.2 外观.153.3 鉴别.153.3.1 鉴别(1)红外光吸收图谱(Infra red Absorpt ion).153.3.2 鉴别Q)钠盐的火焰鉴别.173.4 pH 值.173.4.1 仪器及用具.173.4.2 试剂.173.4.3 称量.173.4.4 溶解.17山东大学硕士学位论文3.4.5 测定.183.4.6 记录和结果报告.183.5 干燥失重.183.5.1 定义及测定方法.183.5.2 仪器与用具.183.53 干燥剂.193.5.4操作方法.193.6 特性黏度、分子量.213.6.1 仪器设备.223.6.2 试剂及样品.223.6.3 测定SH的特性黏度.223.7 透光率.253.7.1 仪器：.253.7.2 检测条件：.253.7.3 测定：.253.7.4 测定结果见表3-7.263.7.5 结论.263.8 蛋白质.263.8.1 仪器.263.8.2 Folin-酚法网.263.8.3 考马斯亮蓝法冲叫.28384两种方法测定结果的比较.303.8.5 讨论.303.9 重金属冈.313.9.1 仪器.313.9.2 试剂与试液制备.313.9.3 SH供试液的制备.323.9.4 对照管溶液的制备.323.9.5 检测.333.9.6 结果判断.333.9.7 讨论.333.10 透明质酸钠的含量测定.333.10.1 仪器.34山东大学硕士学位论文3.10.2 试剂及试液.343.10.3 标准对照品.343.10.4 标准对照品溶液制备.343.10.5 供试液制备.353.10.6 标准曲线的制备.353.10.7 样品测定.353.10.8 计算.353.10.9 结果.363.10.10 讨论.363.10.11 透明质酸钠含量测定方法验证.363.11 微生物检验网.403.11.1 仪器设备及用具.403.11.2 培养基、试液、试剂及菌种.413.11.3 阳性菌悬液制备.423.11.4 细菌数、霉菌及酵母菌数检测.423.11.5 控制菌检查.443.11.6 最终结果判断.493.11.7 讨论.49总结.51参考文献.52致谢.55iii山东大学硕士学位论文化妆品用透明质酸钠的质量标准及检验方法研究研究生：曲建全 指导教师：王禄山教授摘要透明质酸(hya luronic a cid.HA),又名玻璃酸，是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨 基葡糖双糖重复单位通过0-(1-4)糖苜键和。-(1-3)糖苗键构成的无分支的糖胺聚 糖，广泛存在于动物组织的细胞间质和某些细菌的夹膜中。其相对分子质量(Mr)一般为lx l051x1()7d,分子中两种单糖的摩尔比为1：。HA常用的制备方法有 动物组织提取法和细菌发酵法。由于HA具有良好的保湿作用、营养作用、皮肤损伤的修复和预防作用、增稠 性等，其在化妆品领域的应用也日益广泛。商品HA一般为其钠盐，即透明质酸钠(Sod ium Hya lurona t e,SH)。本课题重点研究了化妆品用透明质酸钠的理化、卫 生质量标准及相关检验方法。1、外观性状目测观察SH样品应为白色或类白色颗粒或粉末。2、鉴别1)SH样品供试片的红外光吸收图谱(4000cm“400cm)应与SH红外 光吸收对照图谱(红外光谱集第四卷夕73图)一致,即在3400cm“、1610cm、1400cm/、1040cm“附近有特征吸收。2)SH供试液显钠盐的火焰鉴别反应，在无色火焰上燃烧应显鲜黄色。3、pH值为6.08.0。用pH计测定Img/ml的SH供试液,其pH值应为6.08.0。4、溶液的透光率(0.5%,A550nm)299.0%以纯化水作空白，在550nm波长处测定5mg/mlSH溶液的透光率应之99.0%。5、干燥失重310.0%本研究对5批SH样品用烘箱干燥法测得干燥失重为：6.40、6.44、6.35、6.23、6.30；恒温减压干燥法测得为：6.38、6.43、6.30、6.17.6.22；卤素水分测定仪测 得为：6.42、6.48、6.3K 6.19、6.26.三种方法得出的结果基本一致，但前两种方 法所需的时间较长，用卤素水分测定仪在110C、15分钟即可完成干燥失重测定。6、平均相对分子量本研究对5批SH样品用多点法测得的特性粘度分别为：27.32、24.64、22.56、山东大学硕士学位论文16.18 13.42；用一点法测定同分别为：27.54、22.57、23.62、16.85、14.27,一 点法与多点法所测得SH的用非常接近，在保证丁。大于100s,且看伍=1.301.50时，可用一点法代替多点法测定SH的川。再由公式计算SH平均相对分子量。7、透明质酸钠含量（以干品计）92.0%本研究以Bit t er和Muir改良的咔理法首先测定SH样品的葡萄糖醛酸的含量，再乘以2.0675（401.3/194.1=2.0675）,即得。并进行了含量测定方法验证。准确度试验：采用标准加入法测定对照品的平均回收率为98.7%（回收率要求 为98.0102.0%）,符合验证要求。精密度试验：采用重复测定6份供试品含量结果的相对标准偏差来表示，测定 结果的相对标准偏差为1.15%,符合相对标准偏差不得大于2.0%的验证要求。线性和范围试验：方法适用范围为葡萄糖醛酸的浓度为050pg/ml；在此范 围内，以葡萄糖醛酸浓度和吸光度计算回归方程，相关系数为0.9998,符合相关系 数不得小于0.990的要求。耐用性试验：本研究主要考察反应时间对测定结果的影响。经试验，第一步 水解加热时间大于8分钟后测定结果恒定，为保证水解反应，最终确定第一步水解 加热时间为10分钟：第二步显色反应水浴加热时间为15分钟，在试验中应严格控 制。专属性：本法适用于含葡萄糖醛酸分子在酸性条件下水解的多糖类化合物，专属性不强。但欧洲药典和国家药品标准中均用该法作为含量测定的法定方法。8、蛋白质含量（以干品计）0.1%本研究对5批SH样品用Folin-酚法测得的蛋白质含量（）为：0.17.0.2k 0.18、0.23、0.19；考马斯亮蓝法测得的蛋白质含量（%）为：0.0095、0.014、0.021、0,017.0.030.前者测定结果明显高于后者。考马斯亮蓝法灵敏度高，更适用于蛋 白质为少量成分的SH样品。9、重金属含量（以Pb计）20ppm本研究将1.0g SH经过一系列化学处理后制成25 ml供试液；同时制备25 ml 含标准铅20ppm的对照液。在对照液管和供试液管中分别加入硫代乙酰胺试液2 ml,显色后，供试液管显出的颜色不得更深于标准对照管。10、细菌数SlOOcfWg；霉菌及酵母菌数W50ciWg；每克供试品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪大肠菌群均不得检出。山东大学硕士学位论文本研究用营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基分别测定SH的细菌数、霉菌及酵母 菌数。同时，用营养肉汤增菌后划线接种于甘露醇氯化钠琼脂的平板上以及血浆 凝固酶试验来检测金黄色葡萄球菌。另外，用胆盐乳糖增菌后划线接种于澳化十 六烷基三甲钱琼脂的平板上以及氧化酶试验、绿脓菌素试验来检测铜绿假单胞菌；用双倍乳糖胆盐培养基在44c45c培养是否产酸产气、伊红美蓝琼脂平板及靛 基质试验来检测粪大肠菌群。关键词：化妆品用透明质酸钠；理化卫生质量标准；检验方法III山东大学硕士学位论文Study on the Quality Standards and Test Methods ofCosmetic Use of Sodium HyaluronatePostgraduate：Qu Jianquan Supervisors：Professor Wang LushanAbstractHyaluronic acid(HA).a nonbranched polysaccharide,is composed of regularly alternating units of D-giueuronic acid and N-acetyl glueosamine linked by*13)and p-(l4)glycosidic bonds.The weight average molecular weight range of natural HA is within lx)O51xO7D,and the molar ratio of the two monosaccharides in the molecular structure is 1:1.HA is generally prepared by extraction from animal tissues or by bacteria fermentation.Because HA has a good moisturizing effect,nutrition,skin damage repair and preventive effect,thickening,etc.,its application in the field of cosmetics are increasingly widespread.HA general merchandise to its sodium salt,ie sodium hyaluronate.This topic focuses on the cosmetic use of sodium hyaluronate physical and chemical,microbiological quality standards and related test methods.1.Appearance SH visually observed for the test should be white or white granules or powder.2.IdentificationI)SH samples fbr test pieces of the infrared absorption spectrum(4000cm-1 400cm-1)should be controlled with the SH infrared absorption spectrum(1R set Volume I V 1173 figure)consistent,That is,near 3400cm1,1610cm1,1400cm1,1040cm1 is present the characteristic absoqition.2)Sodium hyaluronate sodium flame test solution fbr differential response,in a colorless flame burning bright yellow should be significantly.3.pH 6.0 to 8.0.Measured with a pH meter tor the test solution I mg/ml in SH,the pH should be 6.0 to 8.0.4.light transmittance of the solution(0.5%,A550nm)99.0%The purified water as a blank,measured at a wavelength of 550nm light transmittance 5mg/mlSH solution should be 99.0%.山东大学硕士学位论文S.loss on dryingI n this study,five batches of SH samples measured by oven drying loss on drying is:6.40,6.44,6.35,6.23,6.30;heated drying under reduced pressure measured as:6.38,6.43,6.30,6.17,6.22;Halogen Moisture Analyzer Measurement was as follows:6.42,6.48,6.31,6.19,6.26.The results of three methods are basically the same,but the first two methods required for a long time,with a halogen moisture analyzer at 110 C 15 minutes to complete the determination of loss on drying.6.average relative molecular weight.I n this study,samples of five batches SH measured by multi-point intrinsic viscosity t respectively:27.32,24.64,22.56,16.18,13.42;point detennined by#were:27.54,22.57,23.62,16.85,14.27.Point method with multi-point method measured the SH 川 is very close,in ensuring Ti and TO are greater than 100s,and T/To=l.3Ol.5O,can be used instead of multi-point method determination of SH q.Then calculated by the equation SH average relative molecular weight.7.sodium hyaluronate content(on dry basis)92.0%I n this study,Bitter and Muir modified carbazole detennination SH sample glucuronic acid content,multiply by 2.0675,that is,too.And make a determination method validation.Accuracy test:reference standard addition method,the average recovery was 98.7%(recovery of 98.0102.0%should)meet certification requirements.Precision test:6 copies of repealed measurements using the test content and the relative standard deviation expressed as relative standard deviation of measurement results was 1.15%,in line with the relative standard deviation of not more than 2.0%of the validation requirements.Linearity and range test:This method is applicable range of glucuronic acid concentration of 050HgzmI;within this range,glucuronic acid concentration and absorbance calculate the regression equation,correlation coefficient of 0.9998.in line with the correlation coefficient of not less than 0.990 requirements.Durability test:This study investigated the reaction time on the determination results.After testing,the hydrolysis step is more than 8 minutes after the heating time constant measurement results,in order to ensure the hydrolysis reaction,the hydrolysis step finalize heated for 10 minutes;step chromogenic reaction water bath fbr 15 minutes,the test should be strictly control.Specificity:This method applies to molecules containing glucuronic acid hydrolysis under acidic conditions polysaccharide compounds,specificity is not strong.But the European VI山东大学硕士学位论文Pharmacopoeia and the national drug standards were used in the determination of the law as a legal method.8.Protein content(on dry basis)0.1%I n this study,five batches of SH samples measured by Fol in-phenol protein content(%)is:0.17,0.21,0.18,0.23,0.19;measured by Coomassie blue protein content(%)is:0.0095,0.014,0.021,0.017,0.030.The former measurement results significantly higher than the latter.Coomassie blue method of high sensitivity,more suitable for the small proportion of protein SH sample.9.Heavy metals(as Pb)20ppmI n this study,1.0g SH is made through a series of chemical treatment 25 ml of the test solution;simultaneously preparing 25 ml of lead 20ppm with standard control solution.I n the control tube and pipe for the test solution were added thioacetamide solution 2 ml,after the color,the color of the test solution tube showing no deeper in the standard control tube.lO.Bacterial count lOOcfu/g;mold and yeast count 92.0平均相对分子量（黏度法）实测值（标示值的80%120%）蛋白质含量/%（以干品计）99.0干燥失重/%10.0pH值（lmg/ml的水溶液，室温）6.0 8.0重金属/（以铅（Pb）来计）20ppm细菌菌落数/（cfu/g）100霉菌和酵母菌菌落数/（cfu/g）100秒2）（/70=1.3.53）计算按下面公式计算特性黏度电：,2侏一 1）-1 嗫特性黏度川=-c-其中：C供试液的浓度，g/100mL（以SH干品计）：7o溶剂的流出时间，秒；7供试液的流出时间，秒。再按下面公式计算出供试品的平均相对分子量：平均相对分子量=（吗丫“3623山东大学顼士学位论文4)5批SH样品的切,测定结果见表3-4表3S多点法与一点法测定的的比较 特性黏度/lOOmLgSH样品多点法一点法1273227.54224.6425.77322.5623.62416.1816.85513.4214.275)由表3-4可知，多点法与一点法所测得SH的特性黏度是非常相近的，所以 在保证供试液和溶剂的流出时间大于100秒，且7。=1.301.50时，就可以用一 点法代替多点法来测定SH的特性黏度。3.63.4翦度计毛细管内径对多点法测定特性黏度的影响分别用毛细管内径为0.53mm和0.60mm的乌式黏度计按照6.3.2项下的多点 法测定了5个SH样品的特性黏度，结果见表3-5。表3-5内径不同测定的SH的特性黏度 特性黏度/lOOmLg”内径/mm内径/mmSH样品0.530.60127.3221.30224.6418.51322.5617.92416.1814.48513.4211.23由表3-5可知，同一SH样品用不同毛细管内径的乌式黏度计所测得的特性熟度 相差比较大，毛细管内径内径越大，所测得的特性黏度值就越小。24山东大学硕士学位论文363.5由表3Y中一点法所测得的特性黏度，根据公式计算平均相对分子量，5 个SH样品的平均相对分子量见表3-6表3-6 5个SH样品的平均相对分子量 平均相对分子量(*106)样品 1 2345一点法 1.82 1.68 1.50 0.97 0.793.63.6讨论用多点法测定特性黏度需要花费较多的时间，为了简化操作，缩短时间，提 高检测的效率，本人对一点法测定SH的特性黏度进行了研究，试验结果表明，在 满足溶剂和供试品溶液的流出时间均大于100秒，并且7。=1.301.50时，可用一 点法代替多点法来进行SH的特性黏度测定。另外，在用多点法测定SH的特性黏度 时，黏度计毛细管的内径对测定值影响比较大，应引起足够的重视。因为SH的溶 液是非牛顿流体，其切变速率越大，粘度反而越低。如粘度计毛细管的内径越大，SH供试液的流速和切变速率就越大，所测得的黏度就越低。所以在选择乌式黏度 计和制备样品溶液时，应对黏度计的内径范围、流出时间及相对黏度等进行限定，这样测定出来的数值才具有可比性。3.7透光率3.7.1 仪器：紫外-可见分光光度计，UV-2550型，SHIMADZU CORPORATION；电子天平(精度 0.01g)，PL602-S 型，METTLER TOLEDO03.7.2 检涌条件：波长：550nm3.7.3 测定：称取SH样品0.50g加至盛有100ml纯化水的锥形瓶中，在冰箱中冷藏放置过 夜，溶解后即得5mg/ml的溶液。然后以水作空白对照，用紫外-可见分光光度计 在550nm波长处测定溶液的透光率。25山东大学硕士学位论文3.7.4 漓定结果见表3-7。表3-7 5批SH样品溶液的透光率测定结果透光率（）样品 1 2 34599.8 99.9 99.999.999.9检验标准：99.0%3.7.5 结论通过对5批SH样品溶液的透光率进行测定，结果均大于99.0%,符合规定。3.8蛋白质3.8.1 仪器紫外-可见分光光度计，UV-2550,SHIMADZU CORPORATION：电子天平（精 度 0.1 mg 以上和 0.01g）,AL204,METTLER TOLENDO；漩涡混合器，XW-80A,上海精科实业有限公司；秒表；具塞试管；刻度吸管；移液器；超声波；计算器。3.8.2 Folin-酚法网3.8.2.1 试剂及试液配制1）硫酸铜，分析纯，天津大茂化学试剂厂；酒石酸钾钠，分析纯，北京益利化 学试剂有限公司；无水碳酸钠，分析纯，天津大茂化学试剂厂；氢氧化钠，分析 纯，北京益利化学试剂有限公司；钙酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；铝酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；盐酸，分析纯，莱阳市康德化工 有限公司；硫酸锂，分析纯，天津大茂化学试剂厂；牛血清白蛋白（BSA），国药 集团化学试剂有限公司。2）碱性酒石酸铜试液配制：用天平称取无水碳酸钠10g.氢氧化钠2g、酒石酸 钾钠0.25g,加水溶解并定容至500ml,摇匀后作为甲液；称取硫酸铜0.5g,加水 溶解并定容至100ml，摇匀后作为乙液。在临使用前，将甲液用定性滤纸过滤一下，将甲液与乙液按50：1混合，摇匀，并且须在30分钟之内使用。26山东大学硕士学位论文3）福林试液：用天平称取铝酸钠100g、铝酸钠25g,加入水700ml、85%磷酸 50ml及盐酸100ml,置于烧瓶中，缓缓加热回流10小时后，放冷至室温，再加入 硫酸锂150g、水50ml及滨液数滴煮沸大约15分钟，至澳除尽后，再放冷至室温，加入水使成1000mL过滤后将滤液作为贮备液，置于棕色瓶中，于冰箱中28c 冷藏保存。或者直接购买商业用试剂。临使用前，量取贮备液，加入水等量稀释 后，混匀即得。4）0.1mol/L氢氧化钠溶液:用天平称取氢氧化钠4g加水溶解并定容至1000ml,摇匀，即得。3.822牛血清白蛋白标准溶液的制备精密地称取牛血清白蛋白对照品约50mg（M）置于100ml容量瓶中，加入 O.lmol/L氢氧化钠溶液溶解并定容至刻度，摇匀。精密量取5ml置于50ml容量瓶 中，加入O.lmol/L氢氧化钠溶液定容至刻度，摇匀，即制成了每1ml约含50pg 的溶液。3.8.23供试品溶液的制备精密地称取SH供试品约20mg（W）置于具塞试管中，加入0.1mol/L氢氧化钠 溶液1.0ml,加塞，用封口膜封口，间歇超声加速溶解（如需过夜，在冰箱28C 放置），24小时之内测定。供试液平行制备2管。3.824标准曲线的制备精密地量取牛血清白蛋白标准溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL分别置于 具塞试管中，按照下表3-8的量加入01mol/L氢氧化钠溶液，混匀，加入碱性酒 石酸铜试液，混匀，放置10分钟，加入福林试液，混匀，室温放置30分钟，照 分光光度法在750nm波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白的浓度与对应的吸光度 得回归方程及相关系数（要求r 0.980）。根据表3-8加入试剂的量:试管编号空白1#2#3#4#5#BSA标准溶液（V*和）0ml0.1ml0.2ml0.4ml0.6ml0.8mlO.lmol/L氢氧化钠溶液1.0ml0.9ml0.8ml0.6ml0.4ml0.2ml碱性酒石酸铜试液5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml5.0mi福林试液0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml27山东大学项士学位论文标准溶液浓度计算公式：/以频售照品含量x-与警IUU JU I.U式中：M为牛血清白蛋白对照品的称样量，mg；V为牛血清白蛋白标准溶液的量取量，ml。382.5测定取供试液，照标准曲线制备项下自“加入碱性酒石酸铜试液”起依法操作，在 750nm波长处测定吸光度，由回归方程得蛋白质的浓度(C)(pg/ml),根据稀释 倍数计算供试品中蛋白质的含量。3.826计算蛋白质含量(=Gxl.OxlOOWx(100-h)xl06式中：C为供试液中含蛋白质的浓度C,gg/mlW为供试品的称样量，gh(%)为供试品的干燥失重。3.8.2.7偏差要求相对偏差RD=|*|x ioo%,两个平行测定的结果的相对偏差不得超过15%,取两平行结果的平均值报告结果。3.83考马斯亮蓝法四3。13.83.1 试剂及试液配制831.1 考马斯亮蓝(G250),国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白，国药集 团化学试剂有限公司；95%乙醇，国药集团化学试剂有限公司；85%磷酸、国药集 团化学试剂有限公司：电子天平，PL602-S,MEITLERTOLENDOo831.2 考马斯亮蓝试液：取考马斯亮蓝(G250)0.1g,加乙醇50ml溶解后，再加 入85%的磷酸100mL加水稀释至800ml,用定量滤纸滤过，即得。3.83.2牛血清白蛋白标准溶液的制备精密地称取牛血清白蛋白约50mg(M),置于100 ml容量瓶中，加水溶解并 稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前精密量取贮备液5 ml,置于50ml容量瓶 中，加水稀释至刻度，摇匀制成每1 ml中含50 Hg的溶液。按下式计算牛血清白 蛋白标准溶液的浓度。28山东大学硕士学位论文Mx5xl/Cs(ng/ml)=J00 x 50 xZ式中：M为牛血清白蛋白对照品的称样量，g；Z为牛血清白蛋白对照品的含量。3.833供试液制备精密称取SH供试品约10mg（W）,置于具塞试管中，加水1.0mL加塞，用 封口膜封口，间歇超声加速溶解（如需过夜，在冰箱28C放置），24小时之内 测定。供试液平行制备2管。3.834标准曲线的制备按下表3-9制备牛血清白蛋白标准溶液系列试管编号空白1#2#3#4#5#标准溶液（V豚灌溶液）0ml0.1 ml0.2ml0.4ml0.8mi1.0ml水1.0ml0.9ml0.8ml0.6ml0.2ml0ml考马斯亮蓝试液4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml分别加入考马斯亮蓝试液后，立刻混匀，5分钟后，照分光光度法，在595nm 波长处分别测定吸光度，以牛血清白蛋白的浓度与吸光度得回归方程及相关系数（要求 0.980）。3.83.5 样品测定取供试液，照标准曲线项下自“加入考马斯亮蓝试液”起依法操作，测定吸光 度，由回归方程得供试液中蛋白质的浓度C（Rg/ml）（当该值为负数时，以零计）,根据稀释倍数计算供试品中蛋白质的含量。3.83.6 计算蛋白质含量 Pr（%）=_Cx!xio。x ioo%WxlO6x（IOO-h）式中：C为由回归方程得到的供试液中蛋白质的浓度，ng/mlW为称取供试品的量，gh（%）为供试品的干燥失重。3.83.7 偏差要求及结果报告相对偏差RD=|器对x ioo%,两个平行测定的结果的相对偏差不得超过15%；29山东大学硕士学位论文取两平行结果的平均值报告结果。3.8.4两 种方法演I定结果的比较Folin-酚法标准曲线的回归方程式为：C=227.78A-0.19,r=0.9996。考马斯亮蓝法标准曲线的回归方程式为：C=113.41 A+0.64,r=0.9995o式中A为 吸光度，C为供试液中含蛋白质的含量(Rg/ml),r为相关系数。根据两种检测方法 的标准曲线的斜率之比可以计算出，考马斯亮蓝法对牛血清白蛋白的显色灵敏度 大约为Folin-酚法的两倍。两种方法所测得SH供试品中的蛋白质含量见表3-10。Folin-酚法测定的结果明显高于考马斯亮蓝法。表3-10两种方法蛋白质含量测定结果蛋白质含量Pr(%)SH样品Folin-酚法考马斯亮蓝法10.170.01020.210.03130.180.01540.230.01750.190.0303.8.5讨 论表3-11:Folin-酚法与考马斯亮蓝法的两种方法的比较明测定方法原理有效范围及灵敏度优点及缺点干扰物质适用供试品Folin-酚法铜离子与肽 键的络合以 及氨基酸对 Folin-酚试剂 的还原10200HgA75O(1%)=3.3灵敏度较低，试 剂及操作较复 杂，蛋白质的种 类对测定结果 有影响酚类、Gly、枸椽酸、硫 酸铉、肽等物质中蛋白 质为主要成 分考马斯亮 蓝法与蛋白质结 合导致了颜 色的改变0.32.5jigA595(l%)=9.0灵敏度较高，试 剂及操作简单、快速，蛋白质的 种类对测定结果有影响一些去污 剂、碱等物质中蛋白质为少量成分考马斯亮蓝(G250)法测定蛋白质的含量是属于染料结合法的一种。考马斯 亮蓝(G250)在游离状态时呈显红色，在稀酸的溶液中，当它与蛋白质结合后颜30山东大学硕士学位论文色变为青色，前者的最大光吸收波长在465nm，而后者则在595nm。在一定的蛋 白质浓度范围内。100四)，蛋白质与色素的结合物在595nm波长处的吸光度与 蛋白质含量成线性关系，所以可用于蛋白质的含量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合后在2分钟左右就达到了平衡，完成反应是 相当迅速的，其结合物在室温条件卜.1小时内保持稳定。该方法快速灵敏、操作 简单、并且干扰物质较少。考马斯亮蓝G250与蛋白质是通过范德华力来结合的，蛋白质的特异性对其影 响较小，除了组蛋白外，其他不同种类的蛋白质染色强度的差异不是很大。考马斯亮蓝法可用来测定微克级的蛋白质含量，是一种较好的蛋白质定量检 测法。但是此方法也存在缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量较高时线性关系反而偏 低，这一点在检测时须引起关注。3.9重金属网重金属通常是指在一定的条件下能与硫代乙酰胺或者硫代钠作用而显色的金 属杂质。工业生产中遇到铅的机会是较多的，而且铅又易在体内积蓄使人体中毒,所以重金属检查时以铅为代表，以铅(Pb)的限量来表示。本文是采用硫代乙酰胺试液作为显色剂，首先将SH供试品灼烧破坏，然后取 其炽灼残渣，经过一定的处理后在酸性溶液中进行显色的重金属限度检查法。3.9.1 仪器天平，AL204,METTLERTOLENDO；电阻炉，SX2-4-10,山东龙口市先科 仪器公司；25ml纳氏比色管：用埸：电炉。3.9.2 试剂与试液制备3.9.2.1 试剂硝酸铅，分析纯，天津大茂化学试剂厂；硝酸，分析纯，国药集团；醋酸钱,分析纯，国药集团：盐酸，分析纯，天津大茂化学试剂厂；硫代乙酰胺，分析纯,国药集团；甘油，分析纯，国药集团；酚St国药集团；氨水，莱阳康德化学试 剂有限公司。31山东大学硕士学位论文392.2标准铅溶液的制备精密地称取硝酸铅0.1599 g,置于1000 ml的量瓶中，加入硝酸5 ml与水50 ml 溶解后，用水稀释定容至刻度，摇匀后，作为贮备液。临使用前，精密地量取贮 备液，加水稀释10倍，摇匀后，即得到每】ml含有相当于10四铅的标准铅溶液。3.9.23醋酸盐缓冲液（pH3.5）用天平称取醋酸铉25 g,加入25 ml水溶解后，加入7 moi/L盐酸溶液38 ml,再用2 mol/L盐酸溶液或者5mol/L氨溶液准确地调节pH值至3.5,最后用水稀释 至100 mL即得。392.4 硫代乙酰胺试液用