番泻苷B通过Wnt_β-catenin通路抑制视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞增殖、凋亡和侵袭.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(2):141-145 J Med Mol Biol,2024,21(2):141-145DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.02.008资助项目:河北省重点研发计划项目(No.223777105D),保定市科技计划项目(No.2041ZF240)通讯作者:崔博坤(电话:[phone],E-mail:491196488 )This work was supported by grants from the Key R&D Plan Projects in Hebei Province(No.223777105D)and Baoding Science and Technology PlanProject(No.2041ZF240)Corresponding author:CUI Bokun(Tel:[phone],E-mail:491196488 )番泻苷 B 通过 Wnt/-catenin 通路抑制视网膜母细胞瘤 HXO-Rb44细胞增殖、凋亡和侵袭孙蒙蒙1,崔博坤1,贾梦1,冉柳1,王丹荣1,冯素婷1,张虎2,郝建章21保定市第一医院手术室 河北省保定市,0710002保定市第一医院眼科 河北省保定市,071000【摘要】目的 探究番泻苷 B 对视网膜母细胞瘤 HXO-Rb44 细胞增殖、凋亡、侵袭及 Wnt/-catenin 信号通路的影响。方法 通过采用不同剂量(0、5、10、20 mol/L)番泻苷 B 处理 HXO-Rb44 细胞,将细胞随机分为 4 组:Control 组,番泻苷 B 5、10、20 mol/L 组。MTT 法检测细胞活力;克隆形成实验检测克隆形成率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Transwell 检测侵袭细胞数;细胞成球实验检测细胞成球直径和细胞成球数目;蛋白质印迹检测 cleaved caspase-3、caspase-3、MMP-2、MMP-9、SOX2、OCT4、CD44、Wnt1、-catenin 蛋白表达。结果 与 Control 组比较,番泻苷 B 10、20 mol/L 组细胞活力、克隆形成率显著降低(P0.05),细胞凋亡率和 cleaved caspase-3/caspase-3 表达显著升高(P 0.05),侵袭细胞数和 MMP-2、MMP-9 蛋白表达显著降低(P0.05),细胞成球直径、细胞成球数目和 SOX2、OCT4、CD44 蛋白表达显著降低(P0.05),Wnt1、-catenin 蛋白表达显著降低(P0.05)。结论 番泻苷 B 可抑制视网膜母细胞瘤HXO-Rb44 细胞增殖、侵袭和干细胞样特性,诱导细胞凋亡,抑制 Wnt/-catenin 信号通路的活化。【关键词】视网膜母细胞瘤;番泻苷 B;干细胞样特性;Wnt/-catenin 信号通路【中图分类号】R739.7Sennoside B Inhibits the Proliferation,Apoptosis and Invasion of Ret-inoblastoma HXO-Rb44 Cells via Wnt/-catenin PathwaySUN Mengmeng1,CUI Bokun1,JIA Meng1,RAN Liu1,WANG Danrong1,FENG Suting1,ZHANG Hu2,HAO Jianzhang21Operating Room,Baoding First Hospital,Baoding,Hebei,071000,China2Department of Ophthalmology,Baoding First Hospital,Baoding,Hebei,071000,China【Abstract】Objective To investigate the effect of sennoside B on proliferation,apoptosis,in-vasion and Wnt/-catenin signaling pathway of retinoblastoma HXO-Rb44 cells.MethodsHXO-RB44 cells were treated with different doses(0,5,10 and 20 mol/L)of sennoside B,and thecells were randomly divided into four groups:Control group,sennoside B 5 mol/L group,senno-side B 10 mol/L group and sennoside B 20 mol/L group.Cell viability was detected by MTT as-say.Colony formation assay was used to detect the colony formation rate.Cell apoptosis rate was de-tected by flow cytometry.Cell invasion were detected by Transwell assay.Cell pellet-forming experi-ment was used to detect the diameters and numbers of cell pellets.The protein expression levels ofCleaved Caspase-3,Caspase-3,MMP-2,MMP-9,SOX2,OCT4,CD44,Wnt1,-cateninwere detected by Western blotting.ResultsThe cell viabilities and colony formation rates in thesennoside B 10 and 20 mol/L groups were significantly decreased when compared with those in theControl group(P 0.05),the cell apoptosis rates and cleaved Caspase-3/Caspase-3 expressionlevels were significantly increased when compared with those in the Control group(P0.05).Thenumbers of invaded cells and the protein expression levels of MMP-2 and MMP-9 were significantlydecreased in the sennoside B 10 and 20 mol/L groups(P0.05),the cell pellet diameters,thecell pellet numbers and the protein expression levels of SOX2,OCT4 and CD44 were significantlydecreased(P0.05),and the protein expression levels of Wnt1 and-catenin were significantlydecreased in the sennoside B 10 and 20 mol/L groups when compared with those in the Controlgroup(P0.05).Conclusion Sennoside B can induce apoptosis,inhibit the proliferation,inva-sion and stem-like characteristics of retinoblastoma HXO-Rb44 cells,and inhibit the activation ofWnt/-catenin signaling pathway.【Key words】retinoblastoma;sennoside B;stem cell-like properties;Wnt/-catenin signalingpathway 视网膜母细胞瘤是儿童期最常见的原发性眼内肿瘤,占所有儿童期肿瘤的3%,它也是第二常见的眼内恶性肿瘤1。其治疗在过去 10 年中发生了巨大变化,局部药物输送的里程碑式发展,即玻璃体内化疗注射和眼动脉化学手术的安全技术,使全身化疗或外照射放射治疗无法实现的眼球抢救得以成功2。尽管应用了各种治疗策略组合,但由于患者预后不良,尤其是在发展中国家,视网膜母细胞瘤的临床管理仍不令人满意且极具挑战性3。因此,仍需要发现并改进视网膜母细胞瘤的治疗方式以满足临床需求。番泻苷 B 是番泻叶的提取物,被广泛用作刺激性泻药,其安全性和有效性已得到证实4。大量实验研究表明,番泻苷 B 具有抗炎5、抗肿瘤等药物活性。据报道,番泻苷 B 可以通过失活 STAT3 和 ERK1/2 抑制鼻咽癌细胞生长、侵袭及裸鼠成瘤4。此外,番泻苷 B 能抑制胃癌细胞生长、干样特性以及诱 导 肿 瘤 细 胞 凋亡6。但番泻苷 B 在视网膜母细胞瘤的作用未见报道。本文研究了番泻苷 B 对视网膜母细胞瘤 HXO-Rb44 细胞增殖、凋亡、侵袭、干细胞样特性及作用机制。1 材料和方法1.1 试验药物和主要试剂人视网膜母细胞瘤细胞 HXO-Rb44 来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;番泻苷 B购自成都瑞芬思生物科技有限公司;RPMI 1640 培养基、胎牛血清、青-链霉素、胰蛋白酶和 F12 培养基购自上海晶风生物科技有限公司;ANNEXINV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、羊抗兔 IgG-辣根过氧化物酶(horserad-ish peroxidase,HRP)购自北京索莱宝科技有限公司;Transwell 购自美国赛默飞世尔公司;兔抗单克隆 抗 体 cleavedCaspase-3、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、SOX2、OCT4、CD44、Wnt1、-catenin 和-actin 购自英国 Abcam 公司。1.2 细胞培养标准培养条件下,在含有10%胎牛血清 RPMI1640 培养基中培养所有细胞,在 37 含 5%CO2和 95%的湿空气中孵育。1.3 细胞分组及处理将 HXO-Rb44 细胞接种于 12 孔板中,随机分为 4 组:Control 组,番泻苷 B 5、10、20 mol/L组。分别用 0、5、10、20 mol/L 番泻苷 B 处理HXO-Rb44 细胞 24 h。1.4 MTT 法检测细胞增殖能力在 96 孔板加入 HXO-Rb44 细胞 100 L/孔,按方法 1.3 处理分组细胞,每孔加入 MTT 溶液(50 L/孔),孵育 4 h,吸出上清液,每孔加 150L DMSO,用平板摇床摇匀,用酶标仪测定。1.5 克隆形成实验将方法 1.3 处理后的 HXO-Rb44 细胞接种至 6孔板,培养 2 3 周,当出现肉眼可见的克隆时,4%多聚甲醛固定后用吉姆萨染液染色 30 min,拍照并观察。1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡将方法 1.3 处理后的 HXO-Rb44 细胞用胰酶消化后收集,严格按照 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书上机分析。1.7 细胞成球实验将 HXO-Rb44 细胞计数后铺至超低黏附 96 孔板,按方法 1.3 处理分组细胞。每孔加入 100 LF12 成球培养基,含 10 个活细胞,各铺 10 个复孔。静置培养 14 d 后倒置显微镜下观察球体直径和成球数量。1.8 蛋白质印迹检测 cleaved Caspase-3、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、SOX2、OCT4、CD44 和 Wnt1 蛋白表达 将方法 1.3 处理后的 HXO-Rb44 细胞加入细胞裂解液后提取总蛋白,BCA 试剂盒检测蛋白含量。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜,加 入 一 抗 cleaved Caspase-3(1 1 000)、Caspase-3(11 000)、MMP-2(1 1 000)、MMP-9(11 000)、SOX2(1 1 000)、OCT4(1 1 000)、CD44(1 1 000)、Wnt1(1 1 000)、-catenin241孙蒙蒙,等.番泻苷 B 通过 Wnt/-catenin 通路抑制视网膜母细胞瘤 HXO-Rb44 细胞增殖、凋亡和侵袭(11 000)和-actin(1 1 000)4 孵育过夜,TBST 洗膜,加入二抗 HRP-IgG(110 000),室温孵育 1 h,TBST 洗膜。通过 Image LabTM软件行灰度值分析。1.9 统计学分析本研究所有对比数据用 GraphPad Prism 5 统计软件进行分析,计量资料数据采用 x s 表示,各组间进行比较采用方差分析法。2 结果2.1 番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞活力和克隆形成率的影响与 Control 组比较,番泻苷 B 10、20 mol/L组 HXO-Rb44 细胞细胞活力、克隆形成率显著降低(P0.05)(图 1)。A:MTT 法检测 HXO-Rb44 细胞活力;B、C:克隆形成实验检测 HXO-Rb44 细胞克隆形成率(200)。1:Con-trol 组;2 4:分别为番泻苷 B 5、10、20 mol/L 组。与 Control 组比较,P0.05。图 1 不同剂量番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞活力和克隆形成率的影响2.2 番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞细胞凋亡率和 Caspase-3蛋白表达的影响 与 Control 组比较,番泻苷 B 10、20 mol/L组 HXO-Rb44 细胞细胞凋亡率和 cleaved caspase-3/caspase-3 表达显著升高(P0.05)(图 2)。2.3 番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞侵袭细胞数和 MMP-2、MMP-9 蛋白表达的影响 与 Control 组比较,番泻苷 B 10、20 mol/L组 HXO-Rb44 细胞侵袭细胞数和 MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P0.05)(图 3)。A、B:流式细胞仪检测 HXO-Rb44 细胞细胞凋亡率;C、D:蛋白质检测 HXO-Rb44 细胞中裂解的 Caspase-3 表达。1:Control 组;2 4:分别为番泻苷 B 5、10、20 mol/L 组。与 Control 组比较,P0.05。图 2 不同剂量番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞细胞凋亡率和 Caspase-3 蛋白表达的影响2.4 番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞成球直径、细胞成球数目和 SOX2、OCT4、CD44 蛋白表达的影响 与 Control 组比较,番泻苷 B 10、20 mol/L组 HXO-Rb44 细胞成球直径、细胞成球数目和SOX2、OCT4、CD44 蛋 白 表 达 显 著 降 低(P 0.05)(图 4)。341医学分子生物学杂志,2024,21(2):141-145 J Med Mol Biol,2024,21(2):141-145A、B:Transwell 检测 HXO-Rb44 细胞侵袭细胞数(100);C、D:蛋白质印迹检测 HXO-Rb44 细胞中 MMP-2、MMP-9 蛋白表达。1:Control 组;2 4:分别为番泻苷 B 5、10、20 mol/L 组。与 Control 组比较,P0.05。图 3 不同剂量番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞侵袭细胞数和 MMP-2、MMP-9 蛋白表达的影响A、B:细胞成球实验检测 HXO-Rb44 细胞成球直径和细胞成球数目;C、D:蛋白质印迹检测 HXO-Rb44 细胞中 SOX2、OCT4、CD44 蛋白表达。1:Control 组;2 4:分别为番泻苷 B 5、10、20 mol/L 组。与 Control 组比较,P0.05。图 4 不同剂量番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞成球直径、细胞成球数目和 SOX2、OCT4、CD44 蛋白表达的影响2.5 番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞 Wnt1、-catenin 蛋白表达的影响 与 Control 组比较,番泻苷 B 10、20 mol/L组 HXO-Rb44 细胞 Wnt1、-catenin 蛋白表达显著降低(P0.05)(图 5)。番泻苷 5 mol/L 组无显著性差异。A、B:蛋白质印迹检测 HXO-Rb44 细胞 Wnt1、-catenin 蛋白表达。1:Control 组;2 4:分别为番泻苷 B 5、10、20 mol/L 组。与 Control 组比较,P0.05。图 5 不同剂量番泻苷 B 对 HXO-Rb44 细胞 Wnt1、-catenin 蛋白表达的影响441孙蒙蒙,等.番泻苷 B 通过 Wnt/-catenin 通路抑制视网膜母细胞瘤 HXO-Rb44 细胞增殖、凋亡和侵袭3 讨论视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的原发性眼内恶性肿瘤,尽管视网膜母细胞瘤的治疗取得了一些进展,但一些主要问题仍未解决,包括继发性恶性肿瘤7。考虑到全身化疗对靶肿瘤的疗效,局部抗癌药物给药有利于提高局部药物浓度,最大限度地减少化疗的副作用。番泻苷 B 是一种植物提取物,在抗肿瘤方面表现出抑制细胞生长、转移等特性4,6。因此,本研究首次探讨了番泻苷 B 在视网膜母细胞瘤中的抗肿瘤作用。恶性肿瘤的特征是不受控制的增殖和失调的细胞凋亡8。细胞凋亡是一种由基因控制的维持内环境稳定的自主程序性细胞死亡,诱导肿瘤细胞凋亡是许多靶向药物抗癌的关键机制9。本研究结果表明,番泻苷 B 以剂量依赖的方式抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长,并诱导其凋亡,这与番泻苷B 在其他肿瘤中的研究结果一致4,6。此外,蛋白质印迹结果进一步表明番泻苷 B 调节 Caspase-3 和Caspase-9 蛋白抑制视网膜母细胞瘤细胞生长。转移性扩散发生是癌症恶性进展的重要特征10,目前缺乏阻断视网膜母细胞瘤转移的特异性疗法。因此,有效抑制 RB 细胞的侵袭对于改善RB 患者的预后具有重要意义。研究发现,基质金属蛋白酶(mtrix metalloproteinases,MMPs)通过降解细胞外基质降低其迁移活性,在生理和病理学中发挥重要作用11。MMP-2 和 MMP-9 已被证明可调节肿瘤细胞的迁移和侵袭12。本研究结果表明,随着番泻苷 B 浓度的增加,细胞侵袭能力显著降低,细胞内 MMP-2 和 MMP-9 蛋白的表达水平显著降低。此外,肿瘤干细胞具有无限增殖和更新的能力,与肿瘤的生长和复发密切相关13,因此,消除肿瘤干细胞是药物靶向治疗的重要途径。SOX2、OCT、CD44 是肿瘤干细胞的重要标志物,其高表达与肿瘤侵袭转移相关14。本研究中,随着番泻苷 B 浓度的增加,细胞成球直径降低,细胞成球数目减少,细胞内 SOX2、OCT4、CD44 蛋白表达显著降低。这些结果表明番泻苷 B 抗肿瘤作用明显,抑制肿瘤细胞的自我更新、分化及侵袭,从而缓解视网膜母细胞瘤的发生发展。越来越多的证据表明,Wnt/-catenin 通路的过度激活可能导致细胞增殖失控,从而导致生长相关疾病,如癌症15-16。Wnt/-catenin 通路可能改变各种 T 细胞的抗肿瘤作用,调节 Wnt/-catenin通路激活的效应物和抑制剂可作为人类癌症的治疗靶点17。本研究通过蛋白质印迹实验发现,随着番泻苷 B 浓度的增加,细胞内 Wnt1、-catenin 蛋白的表达水平显著降低,表明番泻苷 B 通过失活Wnt/-catenin 信号通路抑制视网膜母细胞瘤的恶性发展。综上所述,番泻苷 B 可抑制视网膜母细胞瘤HXO-Rb44 细胞增殖、侵袭和干细胞样特性,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制 Wnt/-catenin 信号通路的活化有关。因此,番泻苷 B 为临床治疗视网膜母细胞瘤提供了理论依据。参考文献1 洪博,崔蓓,田春雨,等.miR-495-3p/WIF1/Wnt 信号通路轴调节视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭J.医学分子生物学杂志,2022,19(3):192-199.2ALLAMAN-PILLET N,SCHORDERET D F.Piperlongu-mine promotes death of retinoblastoma cancer cellsJ.Oncotarget,2021,12(9):907-916.3 LIU S,WEN C.miR-141-3p promotes retinoblastoma pro-gression via inhibiting sushi domain-containing protein 2J.Bioengineered,2022,13(3):7410-7424.4魏璐璐,吉文伟,黄维平.番泻苷 B 抑制 STAT3 和ERK1/2 活化对鼻咽癌 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