干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究论文.doc

西南林业大学

本科毕业（设计）论文
（2023届）

题 目:干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究
Preliminary study of several legume rhizobia purification and physiological and biochemical characteristics in dry-hot valley

教学院系: 保护生物学学院

专 业: 植物保护06级

学生姓名: 代志浩

指导教师: 张东华（讲师）

评 阅 人: 刘丽（实验师）

2023年 6 月 8日

干热河谷地区几种豆科植物根瘤
菌纯培养及生理生化的初步研究
代志浩
（西南林业大学 保护生物学学院 昆明 650224）

摘要: 本实验对采自云南元谋和元江干热河谷地区的10种豆科植物根瘤样品进行了分离纯化培养，共纯化出34株菌，其中具有根瘤菌特性的的有4个菌株，对其进行耐酸碱性、耐盐性、生长温度范围3种生理生化的初步分析测定，所测4个菌株均表现出耐酸碱性和耐盐性的性状，在短时间的低温和高温下解决后，仍能保持活性，表现出良好的生长势。并对分离出来的10株革兰氏阴性菌进行回接实验，选择沙土、蛭石、营养液等不同的培养载体，并选择台湾相思作为回接豆科植物，以拟定供试豆科植物与所分离培养菌种之间的共生结瘤关系、获得并保存高效优良的根瘤菌菌株。

关键词: 干热河谷 根瘤菌 分离纯化 回接实验 生理生化

Preliminary study of several legume rhizobia purification and physiological and biochemical characteristics in dry-hot valley
Dai Zhihao
(Faculty of conservation biology ,Southwest Forestry University, Kunming,650224)

Abstract: This study taken ten kinds of legume rhizobia for purified culture from theYuanmou and Yuanjiang dry-hot valley, and 34 strains were purified, which has the characteristics of Rhizobia strains,4. Determined by the preliminary analysis, 4 strains showed acid and salt tolerance traits, in short low and high temperature treatment, remain active and showing good growth potential. On the isolated 10 strains of Gram-negative bacteria to-back experiments, selected the sand, vermiculite and nutrient solution such as different training vectors, and select Acacia legumes as back then, to determine the tested legumes and The strains were isolated and cultured relations between the symbiotic nodulation, acquire and save the high quality of the Rhizobium stra.
Key words: dry-hot valley, rhizobium, purification, inoculating test,
physiological and biochemical.

目录
1 研究背景 1
1.1 干热河谷概况 1
1.2 生物固氮 1
1.3 豆科植物的根瘤菌 2
1.4 干热河谷根瘤菌国内外研究进展 3
1.4.1 根瘤菌耐旱性研究进展 3
1.4.2 温度对根瘤菌的影响研究进展 4
1.5 该实验的目的意义 5
2 材料 6
2.1 实验试剂及药品 6
2.2 实验仪器 6
2.3 实验材料 6
3 研究区域概况及研究方法 8
3.1 研究区域概况 8
3.2 样品采集 9
3.3 菌株的分离纯化与保存 12
3.3.1 根瘤的表面消毒 12
3.3.2 根瘤菌的分离纯化 12
3.3.3 革兰氏染色 14
3.3.4 菌种的保存 14
3.4 菌株的回接结瘤实验 15
3.4.1 种子催芽 15
3.4.2 回接无氮营养液 15
3.4.3 培养载体准备 15
3.4.4 接种及培养条件 16
3.5 生理生化实验 16
3.5.1 根瘤菌耐酸碱性测定 16
3.5.2 根瘤菌耐盐性测定 17
3.5.3 根瘤菌生长温度范围测定 17
4 结果 18
4.1 所采集的豆科植物根瘤菌分离纯化 18
4.2 根瘤菌耐酸碱性测定 21
4.3 根瘤菌耐盐性测定 21
4.4 根瘤菌生长温度范围测定 22
4.5 回接接瘤 22
5 结论与讨论 23
5.1 所采集的豆科植物根瘤菌分离纯化 23
5.2 根瘤菌耐酸碱性测定 23
5.3 根瘤菌耐盐性测定 23
5.4 根瘤菌生长温度范围测定 24
5.5 回接实验 24
参考文献 25
指导教师简介 28
致谢 29
附录 30

1 研究背景
1.1 干热河谷概况
干热河谷涉及干旱和半干旱、热带和亚热带的河谷，是河流流域地形深陷封闭、气候炎热干燥生境条件下的特殊河谷盆地，是横断山脉地区最突出的自然景观之一，干热是其特点，重要分布在横断山脉地区金沙江、怒江、澜沧江、元江、雅砻江、岷江、大渡河、安宁河等及其支流的河的部分地段，垂直幅度200—1 000m,干旱河谷总长4 105km，总面积11 230km[1].干热河谷是干旱河谷的一种亚类型，只分布在怒江海拔1200m 以下、元江海拔 1 000m－1 400m 以下、澜沧江海拔1 000m 以下不间断河谷、金沙江800m—1 200m 以下河谷、此外在南盘江局部地区1 000m 以下的河谷，这些地区重要涉及攀枝花的部分地区、元谋、东川、巧家、怒江、元江、红河、开远等[1.2]。干热河谷地区年平均降水< 800mm ,年平均气温> 17.5 ℃,最冷月日平均温度≥ 10 ℃，全年积温　≥6 000 ℃, ≥10 ℃天数> 30d ,月均最低温> 0 ℃,全年平均气候干燥度≥1.5[3]；干旱河谷现存植被均为耐旱乔木、灌丛、草丛,一些地段已呈半荒漠化景观,大部分地段盖度大多在20～30 % ,个别植被较好的地段可达60 % ,群落层次结构单一,所有种类基本上都是阳性的,呈现多毛、具刺、叶小、质厚、低矮或匍匐生长等典型旱生植被特性。除在横断山区南段的一些干热河谷有一些耐旱乔木如木棉等零星分布外,随着积温等的逐渐减少,北段河谷只有落叶低矮小灌丛、草丛分布。土壤类型有燥红土、褐红壤、赤红壤、紫色土等,有典型的干热生物气候特性。
1.2 生物固氮
空气中约 80%的氮气不能被植物直接运用, 而有一些生物可以直接吸取空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氨，再转化为氨基酸和蛋白质，这就叫生物固氮。当今由生物固定的氮已达2.0 亿t/a , 占地表化合态氮的65%～70% ,而根瘤菌豆科植物共生体固定的氮又占生物固氮量的65% 。生物固氮是自然生态系统中氮的重要来源，全球生物固氮的量是巨大的，海洋生态系统每年生物固氮量在4×1013～2×1014 g，陆地生态系统生物固氮量在9×1013～1.3×1014 g，而工业固氮量在20 世纪90 年代中期每年约为1.4×1014 g。可见，生物固氮在农、林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大。我国农民运用豆科植物固氮肥田历史悠长，直至现在仍保存着豆科植物和非豆科植物轮作、套作和间作等耕作制度。国外也十分重视固氮生物在农业中的作用[4.5],豆科植物等，其根部长有许多小球，它是由根瘤菌共生形成的根瘤，就具有固氮作用,根瘤菌—豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率很高的一个体系，该体系广泛分布于地面各处。据估计，其年固氮量约占各种生物固氮体系总量的50%，大大超过世界化工合成氨产量的总和(约4000 万吨)，成为农业生产的重要氮源[6]。又如稻田中的水生蕨类植物满江红(俗称红萍)，由于叶腔中有固氮鱼腥藻共生而能吸取和运用大气中的氮；以上两种形式称为共生生物固氮.生物固氮的形式除共生生物固氮外，尚有细菌自生固氮联合固氮.联合固氮（又称为半共生固氮） 它又分为内生联合固氮和外部联合固氮. 目前已发现有固氮能力的微生物有60 多属约数百种，涉及细菌、放线菌、蓝绿藻等。
1.3 豆科植物的根瘤菌
根瘤菌 (rhizobia)是一类能与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气，为植物生长提供氮素营养的革兰氏阴性细菌[7]。1888 年，荷兰学者Beijerinck 从豆科植物根瘤中分离出固氮细菌，命名为根瘤菌。1895 年Nobbe 和Hiltner 将根瘤菌接种剂第一次用于实验室，并在英美申请豆科植物接种剂专利。从此，各国科学家对生物固氮产生了浓厚的爱好，并进行了大量的研究。通过不断的探索与实践，豆科植物固氮已在生产实践中取得了很大的成功。目前已知可以与豆科植物结瘤的细菌约40个种，均为革兰氏阴性细菌,属于细菌域( Bacteria) 、变形杆菌门( Proteobacteria)[8]。自从Deley于1978年初次采用根瘤菌分类系统分类方法以来，特别是自根瘤菌多相分类系统被广泛应用以来，随着大规模资源调查的展开，到目前为止,已发表的根瘤菌已由本来1984年的2属4种增长到2023年的9属43种[9、10]。

1.4 干热河谷根瘤菌国内外研究进展
自1888年，荷兰学者Beijerinck MW从豌豆根瘤中第一次成功分离出根瘤菌菌，并将其命名为Bacillus radicicda。1989年建议将可在豆科植物上结瘤的细菌属改名为根瘤菌属（Rhizobium），并沿用至今。至1984年新属不断建立，发展到7属36种。90年代后，新的根瘤菌属种不断被发现。近年来，随着16SrRNA序列分析技术的应用，使根瘤菌系统发育的研究有了重大突破。随着分子生物技术的发展，传统的根瘤菌分类已经被以系统发育为主的多相分类所取代。目前，根瘤菌新属新种不断涌现，已确立的有12属，51种。
我国在20世纪50年代使用大豆根瘤开始了生物固氮在农业生产中的应用，至80年代，我国一方面从分子水平进一步研究根瘤菌在豆科植物的固氮机理，一方面通过人工诱发非豆科植物根部根瘤，试图使非豆科植物也能共生固氮。其中相继对水稻、小麦、玉米和高粱等作物的联合固氮进行进一步研究，并成功分离出一批具有高效固氮功能的联合菌株。
同其他生物同样,根瘤菌的生存及其共生固氮过程往往受到外界不良环境条件的影响,而土壤的干旱和高盐是重要的限制因子[11]。近年来,不少学者对根瘤菌抗旱性及其机制进行了研究,初步了解了根瘤菌的抗旱机制,并分离出与耐旱性有关的调节基因,从而构建出相应的具有抗性的细菌和植物,为根瘤菌的进一步研究提供了理论依据,也为运用该类微生物在干热河谷等受干热高温条件影响的地区植被状况改善,及农业生产能力提高提供新的方法
1.4.1 根瘤菌耐旱性研究进展
干旱是干热河谷的重要特性之一，也是根瘤菌—豆科植物共生结瘤固氮的限制因素。在干燥土壤中，由于缺少正常根毛，而使感染受到限制。缺水导致固氮作用钝化，失水假如不超过根瘤鲜重的20%，浇水后活性可以恢复。如失水更多，就会导致根瘤构造的永久性损伤—根瘤脱落[12]。当土壤水分从5.5%下降到3.5%时，会明显的减少根毛侵染线的形成并完全限制根瘤的形成[13]。不同品系的根瘤菌，对高温和干旱的反映不同。Shoushtari 和Pepper [14]发现分离自沙漠中的Prosopis(牧豆树属)根瘤菌可以在沙漠土壤中存活一个月。水分胁迫对紫苜蓿M. sativa [15]、落花生 (Arachis hypogaea)[16]、扭曲山蚂蝗（Cyamopsis tetragonoloba）[17]和一些热带豆科植物瓜尔豆（Desmodium intortum )[18]的共生固氮影响很小。绿豆（Vigna radiata）[19]和白花三叶草（Trifolium repens ）[20]在干旱胁迫下产生了基因型变异，来适应干旱的条件。黄明勇等[21]对花生根瘤菌的抗旱性研究发现，花生根瘤菌在不同的土壤水分条件下其存活数量不同，且所研究的花生根瘤菌中存在其抗旱性较强的菌株。曾小红等[22]研究干热河谷根瘤菌的耐干热性，发现分离自干热河谷的根瘤菌均具有较好的耐高温抗干旱的特性。关桂兰[23]等对新疆干旱地区根瘤菌资源研究发现，新疆地区根瘤菌的生长繁殖及对寄主植物侵染结瘤和固氮作用明显不同于其他的生态区，它不仅能在干旱、高温、盐碱等不利条件下很好的生长繁殖，并且还能侵染寄主并使之结瘤固氮，表现出对环境的良好适应性。可以看出，根瘤菌的这种对干热环境出现出来的不同反映，不仅与其自身对干热条件的耐受力和寄主的抗干热能力有关，也与生活环境有关，是一种协同进化。
1.4.2 温度对根瘤菌的影响研究进展
温度的高低是影响一切生物生长发育的因素之一，同样温度也是影响根瘤菌生长发育的限制因素之一。一般认为，根瘤菌的最适生长温度为25~30℃，但也一些根瘤菌表现出耐热和耐低温的多样性。张慧等[24]从广西分离的相思树根瘤菌菌株中，有3个耐高温的菌株，表白在相思树根瘤菌中普遍存在着耐高温菌株。黄宝灵等研究了15个分离自不同生态环境的相思树种根瘤菌菌株对温度的耐受性，结果表白，相思树种的根瘤菌能在高温（39℃）下生长良好的菌株S09号。万晓红等[25]对陕西杨陵某实验田的22个紫花苜蓿品种的新鲜根瘤分离纯化后得到的52株根瘤菌株进行了耐低温耐高温的研究报道，发现供试菌株在低温4℃时停止生长，在高温40℃时均能生长，50℃时均停住生长，60℃解决10min后在28℃培养，所有菌株正常生长，根瘤菌株能瞬间耐高温。李兴芳[26]等在对相思根瘤菌的抗逆性初步研究中，把21株相思根瘤菌和2 株大豆根瘤菌菌株直接置于气温为8℃、28℃、37℃、43℃的环境下培养生长和在55℃下解决20min和65℃下解决10min后在适宜条件下培养生长[27]，发现所有能在37℃条件下生长，经55℃下解决20min在28℃条件下培养生长，快生大豆根瘤菌USDA205和8株相思根瘤菌可以较好的生长，有4株薄弱生长；经65℃下解决10min后有快生大豆根瘤菌USDA205和5株相思根瘤菌可以生长，说明有的菌株耐热性较高[28]。但谷俊等[29]发现中国北方地区甘草根瘤菌对低温（4℃）具有很强的耐受性。
而关桂兰等研究表白，在高温、干旱地区根瘤菌的生长繁殖以及寄主植物侵染和结瘤固氮作用均有别于一般生态地区，并且还表现出与干旱地区相适应的耐高温耐盐的特点[23]和温度对干旱地区豆科植物根瘤的形成和固氮活性不是限制性因子[28]。因此在干热河谷地区也应当存在适应当地区的恶劣环境的耐高温干旱的根瘤菌资源，这也是干旱地区植物对干旱环境适应的表现。
1.5 该实验的目的意义
本实验对采自云南干热河谷地区（元江和元谋）的部份豆科植物根瘤菌进行分离纯化，生理生化特性分析和回接结瘤实验，以系统获得该地区根瘤菌的耐盐性、抗性等重要生理生化指标的特性；同时通过回接结瘤实验，以拟定供试豆科植物与所分离培养菌种之间的共生结瘤关系、获得并保存高效优良的根瘤菌菌株，为干热河谷地区可连续发展农、林、牧业提供相关的理论基础.

2 材料
2.1 实验试剂及药品
升汞（1%）、丙三醇、甘露醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、氯化钠、酵母粉、琼脂粉 、氢氧化钠、盐酸 、PH试纸（1-14）、结晶紫、碘液、番红染液、乙醇（75%）
2.2 实验仪器
电子天平（0.0001g，0.001g）、高压灭菌锅、电热恒温培养箱、光照培养箱、超低温冰箱、4℃冰箱、摇床、光学显微镜、超净工作台、移液枪
2.3 实验材料
本次实验共采用所采集样品中的10种豆科植物根瘤作为材料，其中元谋5种（见表2-1），元江5种（见表2-2）
表2-1元谋采集实验用样品一览表
编号
时间
地 点
海拔
（m）
温度
（℃）
湿度
(%)
生 境
宿 主
根瘤特性
M1
2023
9.16

元谋县能禹镇
凤仪村
N25°969617′
E101°85041′
1086
40
30
河滩沙石地中，与芝麻混种，光照强度高，土壤水分含量低
兵豆
Lens culinaris Medic.
近球形
黄色
M3
2023
9.17

元谋县牛街村
N25°76342′
E101°84765′
1078
34
31
公路边大豆田中，光照充足，土壤为砖红壤，水分含量高，周边为番茄田
大豆
Glycine max (L.) Merr.
球形
M4
2023
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76203′
E101°83303′
1060
38
47
河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周边生长有桉树、竹子
响铃豆
Crotalaria albida Heyne
不规则
M6
2023
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1060
34
48
河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周边生长有桉树、竹子
小叶三点金
Desmodium microphyllum (Thunb.) DC
球形黄色

续表2-1
编号
时间
地点
海拔
（m）
温度
（℃）
湿度
（%）
生 境
宿 主
根瘤特性
M8
2023
9.18
元谋县元马镇
沙地村后山
N25°69673′
E101°87396′
1092
32
55
小山丘上的夹杂有按树，竹子的银合欢林中，光照丰富，土壤为红壤，林中有小水沟
银合欢
Leucaena glauca
(L.)Benth.
球形黑色

表2-2元江采集实验用样品一览表
编号
时 间
地 点
海拔
（m）
温度
（℃）
湿度
(%)
生 境
宿 主
根瘤特点
J1
2023
10.21
元江县新村
N23°5914′
E101°9917′
392
27
70
农田边草丛
银合欢
Leucaenaglauca
(L.) Benth.
梭形褐色
J4
2023
10.21
元江县黄秧数村
N23°58318′
E101°98345′
387
31
50
茉莉花地边，光照强度大，土壤为黄壤，水分含量低
山蚂蝗属
Desmodium Desv
椭圆形
褐色
J6
2023
10.21
元江县那整村
N23°58991′
E101°99180′
405
41
30
公路边的草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分少
响铃豆
Crotalaria albida Heyne
球形黄色
J8
2023
10.22
元江县元江河边
N23°60450′
E102°00438′
388
38
46
桂圆林下，光照丰富，紫色土壤，水分含量大
花生
Arachis
Hypogaea linn.
球形褐色

J14
2023
10.22
元江县元江河边
N23°60992′
E102°00173′
382
20
70
河边沙滩上，光照强，土壤沙质，周边为芦苇丛
兵豆
Lens culinaris Medic.
球形黄色

3 研究区域概况及研究方法
3.1 研究区域概况
元谋位于云南中北部，东经101°35′—102°06′,北纬25°23′—26°06′之间。东倚武定，南接禄丰，西邻大姚，北连四川会理；西南与牟定接壤，西北与永仁毗邻。最大纵距82公里、横距42公里，总面积2023．69平方公里。其中，坝区面积占55.7％，山区占44.3％，海拔1087米，。元谋盆地是金沙江干热河谷的典型代表，年平均降雨量613．7 mm，90％ 以上的降雨量集中在雨季(5—1O月份)，年均蒸发量3 426．3 mm，年均相对湿度54％ ，无霜期350～365[30] 属南亚热带干燥气候，年平均气温21.5℃，素有“天然温室”之称。
　 元谋干热河谷区水土流失严重,土壤肥力低,生态环境脆弱,近代不合理的开发运用使本区成为土壤退化严重的地区之一。豆科牧草和灌木是元谋干热河谷的重要自然覆盖植被。豆科牧草具有保持水土,改善土壤结构,增进土壤肥力等作用，对元谋干热河谷植被恢复具有重要作用。
元江干热河谷(23°00′～25°00′E, 100°30′～103°30′N)是中国西南最典型的干热河谷，位于云南高原的中南部,西北至东南走向,河谷深陷,其西南一侧有与大江平行而高大的哀牢山和无量山脉. 重要涉及云南省的元江、红河、石屏等12个县市,其中最典型的是元江坝的干热河谷[31.32] 。 高大山脉的屏障作用阻挡了来自孟加拉湾的西南暖湿气流,在河谷底部形成“焚风效应”. 同时,河谷地形比较闭塞,降雨稀少,晴天较多,太阳辐射强度大,河谷底部受热剧烈,散热不易,导致了河谷区干燥、闷热的气候特性[32]. 另一方面,由于河谷各地的小环境,如土壤、地形以及人为干扰限度不尽相同,河谷区气候条件的局部差异较大,不同坡向、坡度的降雨量和气温存在较大差别.元江干热河谷区的年平均温度2317 ℃,最冷月平均气温1617 ℃,最热月平均气2816 ℃, ≥10 ℃年积温达8 708. 9℃;干湿季节分明,干季为11月～翌年4月,雨季为5月～10月;年平均降水80511 mm,其中81%的降雨集中在雨季[33.34].

3.2 样品采集
2023.9.15～2023.9.18赴元谋干热河谷地区采集，2023.10.20～2023.10.23赴元江干热河谷地区采集豆科树种根瘤样品。在两地共采集到22份根瘤样品，其中元谋8种（见表3-1）、元江14种（见表3-2）。采集方法如下：
用铁铲刨取豆科植物根系（主根或侧根），用枝剪将生长着的根瘤菌剪下，如根瘤紧贴主根生长时，用尖刀将根瘤连同主根组织一起挖下（见附图I）。小心地解开缠绕的部分，同时用纯净水洗去粘在根系上砂粒或土粒，注意不要扭伤根，将根瘤装入充满甘油（50%）的试管中，封口编号。并记录采集时间、地点、生态植被、土壤类型、水分条件等情况。带回实验室后于4℃冰箱保存待用。

表3-1元谋采集样品一览表
编号
时 间
地 点
海拔
（m）
温度
（℃）
湿度
(%)
生 境
宿 主
根瘤特性
M1
2023
9.16
元谋县能禹镇
凤仪村
N25°969617′
E101°85041′
1086
40
30
河滩沙石地中，与芝麻混种，光照强度高，土壤水分含量大
兵豆
Lens
culinaris Medic.
近球形
黄色
M3
2023
9.17
元谋县牛街村
N25°76342′
E101°84765′
1078
34
31
公路边大豆田中，光照充足，土壤为砖红壤，水分含量高，周边为番茄田
大豆
Glycine ax
(Linn.)Merr
球形
M4
2023
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76203′
E101°83303
1060
38
47
河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周边生长有桉树。竹子
响铃豆
Crotalaria albida
Heyne
不规则
M5
2023
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1062
35
48
河边小山坡的草甸上，光照充足，土壤水分含量低
山蚂蝗属
Desmodium Desv
球形黑色
M6
2023
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1060
34
48
河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周边生长有桉树。竹子
小叶三点金
Desmodium microphyllum(Thunb.) DC
球形黄色
M7-1
2023
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1060
38
47
河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周边生长有桉树。竹子
银合欢
Leucaena glauca(L.) Benth.
球形黑色

续表3-1
编号
时间
地点
海拔
（m）
温度
（℃）
湿度
（%）
生 境
宿主
根瘤特性
M7-2
2023
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1060
38
47
河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周边生长有桉树。竹子
金合欢
Acacia farnesiana (Linn.)
Willd
球形
M8
2023
9.18
元谋县元马镇
沙地村后山
N25°69673′
E101°87396′
1092
32
55
小山丘上的夹杂有按树，竹子的银合欢林中，光照丰富，土壤为红壤，林中有小水沟
银合欢
Leucaena glauca(L.) Benth.
球形黑色

表3-2元江采集样品一览表
编号
时间
地 点
海拔（m）
温度
（℃）
湿度
(%)
生 境
宿 主
根瘤特性
J1
2023
10.21
元江县新村
N23°5914′
E101°9917′
392
27
70
农田边草丛
银合欢
Leucaena glauca(L.) Benth.
梭形褐色
J2
2023
10.21
元江县新村
N23°5914′
E101°9917′
392
27
70
农田边草丛中
未鉴定出
球形
J3
2023
10.21
元江县新村
N23°5914′
E101°9917′
392
27
65
农田边草丛中，与银合欢混生
未鉴定出
球形黄色
J4
2023
10.21
元江县黄秧数村
N23°58318′
E101°98345′
387
31
50
茉莉花地边，光照强度大，土壤为黄壤，水分含量低
山蚂蝗属
Desmodium Desv
球形或椭圆形褐色
J5
2023
10.21
元江县黄秧树村
N23°58061′
E101°98363′
400
34
50
豆田中，光照强度高，土壤水分含量大
未鉴定出
球形黄色
J6
2023
10.21
元江县那整村
N23°58991′
E101°99180′
405
41
30
公路边的草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分少
响铃豆
Crotalaria albida Heyne
球形黄色
J7
2023
10.21
元江县那整村
N23°56864′
E101°97992′
437
35
41
农家菜园中，光照强，土壤沙质水分含量大
树豆
Cajanus cajan
球形黄色

续表3-2
编号
时间
地点
海拔
（m）
温度
（℃）
湿度
（%）
生 境
宿 主
根瘤特性
J8
2023
10.22
元江县元江河边
N23°60450′
E102°00438′
388
38
46
桂圆林下，光照丰富，紫色土壤，水分含量大
花生
Arachis
Hypogaea Linn.
球形褐色

J9
2023
10.22
元江县元江河边
N23°69742′
E102°00431′
388
41
35
河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高
未鉴定出
球形
J10
2023
10.22
元江县元江河边
N23°69742′
E102°00431′
388
41
35
河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高
未鉴定出
球形
J11
2023
10.22
元江县元江河边
N23°69742′
E102°00431′
388
41
35
河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高
未鉴定出
球形
J12
2023
10.22
元江县元江河边
N23°69742′
E102°00431′
388
39
40
河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高
未鉴定出
球形黄色
J13
2023
10.22
元江县元江河边
N23°60992′
E102°00173′
382
20
70
河边沙滩上，光照强，土壤沙质，周边为芦苇丛
大豆
Glycine max (L.) Merr.
球形
J14
2023
10.22
元江县元江河边
N23°60992′
E102°00173′
382
20
70
河边沙滩上，光照强，土壤沙质，周边为芦苇丛
兵豆
Lensculinaris Medic.
球形黄色

3.3 菌株的分离纯化与保存
3.3.1 根瘤的表面消毒
根瘤表面消毒流程：
根瘤挑选
↓
蒸馏水冲洗
↓
75%酒精浸泡30s
↓
1%Hgcl浸泡5～8min
↓
蒸馏水冲洗3～4次
↓
转入YMA培养基
↓
28℃培养1天
↓
评价消毒效果
1%升汞中浸泡根瘤时间视根瘤表皮情况而定。
根瘤转入YMA培养基的平板中，用灭菌的镊子滚动平板表面的根瘤，使其每一个面接触培养基。
28℃培养箱培养24小时后观测平板内有无微生物长出，如有表达消毒不成功，需再次消毒或用其他方法消毒。
3.3.2 根瘤菌的分离纯化
表面消毒成功后，在超净工作台内用灭菌的镊子捏碎平板内的根瘤，使根瘤内的液体流到平板，于28℃培养箱培养15天，在此期间不断观测平板内菌落出现的情况。
15天后根据根瘤菌形态特性挑出相似菌落进一步培养，分离出的菌落培养一段时间后进行平板划线，挑取典型的根瘤菌菌落进行再次平板划线，观测并从培养基上挑选由单细胞生成的正常的独立的菌落（见图1、2、3、4），移植到YMW培养基上，再放入恒温箱培养。
移植后还观测记录菌株生长繁殖的速度和菌落的特性。假如菌根异常，则须再次用平板划线法反复分离，直至分离出纯化的菌株为止。

图1纯化菌种M3.2.2 图2纯化菌种M8.5.2
图3纯化菌种M4.1 图4纯化菌种J6.1.2

3.3.3 革兰氏染色
根瘤菌 (rhizobia)是一类能与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气，为植物生长提供氮素营养的革兰氏阴性细菌[7]

革兰氏染色环节:
涂片
↓
固定
↓
结晶紫初染1min
↓
碘液媒染1min
↓
95%酒精脱色20～25s
↓
番红复染5min
↓
镜检
镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观测，并判断菌体的革兰氏染色反映性。 在显微镜油镜头下观测，菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌（G+）；菌体显红色的为革兰氏阴性菌（G-）
3.3.4 菌种的保存
分离纯化得到的单菌落在进行研究之前，一方面要进行保藏。本次实验分别采用冷藏法和甘油管保存法。
冷藏法：最常见的是采用斜面保存法。在酵母汁甘露醇琼脂培养基（YMA ）上划线存放在4℃冰箱内，每2个月转接一次。
甘油培养基液体保存方法：将甘油和YMB液体培养基按3:7的比例混合配置成保存液，再接入适量的根瘤菌菌液，放置于-70℃冰箱内保存。
3.4 菌株的回接结瘤实验
3.4.1 种子催芽
回接用豆科植物种子经挑选后（无坏死，腐烂和破损）放入灭菌器内用1%的KMnO4进行消毒，并用无菌水冲洗，之后放入垫有湿润滤纸的培养皿中，置28℃光照培养箱发芽，小粒种子发芽后即可接种并播种，大粒种子根长到3-5cm即可接种。
3.4.2 回接无氮营养液
回接结瘤实验无氮营养液（见表3-3），调节pH至6.8—7.0，而后在121℃，0.1—0.14MPa压力条件下灭菌25min。
表3-3无氮营养液
无氮营养液
微量元素
Ca(NO3)2
0.03g
H2BO3
2.86g
K2HPO4
0.136g
MgSO4
1.18g
KCl
0.075g
ZnSO4
0.22g
MgSO4·7H2O
0.06g
CuSO4.5H2O
0.8g
CaSO4
0.46g
H2MoO4
0.22g
柠檬酸铁
0.075g
蒸馏水
1000ml
微量元素
1ml

蒸馏水
1000ml

3.4.3 培养载体准备
营养液：以无氮营养液作为培养载体，回接采用200×30mm的试管，内置覆有滤纸的牛皮纸（注意牛皮纸条宽度为2.5cm ，长度应为试管长度的2/3，牛皮纸斜插），用纱布条将植物根系绑在牛皮纸的2/3处，绑完后纱布条必须能接触到试管底部，之后在试管中放入无氮营养液，营养液不得超过牛皮纸的1/3高度（见图5）。

图5 营养液培养示意图

蛭石：选用新鲜蛭石，装入200×30mm的试管，蛭石占试管的1/2体积，加入无氮营养液使蛭石饱和高压灭菌15磅2h
3.4.4 接种及培养条件
将通过活化的根瘤菌菌种做成菌悬液倒入培养皿中，将发芽种子在其中泡半个小时后，植入蛭石试管和营养液试管，剩余菌液加入到培养植物的试管中。
种植好的试管放入培养室。培养条件：光照7000-80001x，每昼夜照射12-15h，光下温度21℃-2