质粒DNA生产工艺的研究进展.doc

综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展一、质粒DNA细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子1，质粒DNA分子可以连续稳定地处在染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代2，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒重要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中3。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA；开环型（OC）质粒DNA和线性（L）质粒DNA分子4。用于基因工程改造的质粒载体通常涉及复制子、选择标记和目的基因和启动子5，为了获得高稳定性、高产量的质粒DNA，在构建质粒DNA时，需仔细从以下几个方面着手考虑。1. 质粒复制子的选择Prazeres6报道到2023年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450亿美元，质粒DNA的需求不断加大。因此，无论从科学还是经济角度出发，在构建DNA疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常关键，目前，绝大多数学者选择拷贝数高且仅需宿主编码蛋白的ColE1复制子7。在携带ColE1复制子的质粒中，RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物，此外，由质粒编码的一种Rop/Rom蛋白可提高RNAI与RNAII结合的效率，增强RNAI的负调控作用，因此，Rop/Rom基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高3至4倍8。Yavachev 和 Wang 9-10研究报道非荷载的转移RNA的二氢尿嘧啶环、反义环和CCA序列可与RNA I或RNAII的环有高度的同源性，从而会影响到质粒DNA的复制，但是其具体机制尚有待进一步的研究。据Minton11报道，pUC19系列载体同样被缺失了rop基因，但其与其他缺失rop基因的质粒在拷贝数上的表现却不尽相同，这是由于pUC质粒在RNAII序列上带有一个G到A的点突变，可依温度的不同而改变正向调节分子RNAII的二级结构，Chambers S &Yanisch-Perron C等研究表白在42或者45下，RNAII似乎折叠成抗RNAI克制的构型，于是DNA合成的起始加强，结果拷贝数特别高12-14。尽管构建DNA疫苗时普遍使用ColE1类型复制子，但Uhlin B & Remaut E报道的一种由低拷贝发展而来的由温度控制的“失控型”复制子同样具有巨大的应用前景，这种失控的质粒可使质粒DNA大量积聚在大肠杆菌中，其拷贝数可以高达100015-16，Ansorge M和Chao Y证实这种拷贝数已成功地应用来表达大量的重组蛋白17-18，尽管“失控型”复制子的优势非常明显，但还没有使用这个类型复制子来构建DNA疫苗的成功例子，至今不清楚什么是导致此种复制子未得到开发的具体因素19。2. 抗性基因的选择在选择抗生素抗性基因时，由于很少量即可引起部分人群强烈的过敏反映，一方面应避免-内酰胺类抗生素的使用，而应考虑氨基糖苷类的新霉素和卡那霉素20，由于这些氨基糖苷类的抗生素在临床上很少使用，且无耳毒性、肾毒性等副作用，所以更为合适19。3. 其他元件的考虑设计、构建DNA疫苗和基因治疗质粒载体的策略已经十分明显，它除了必须涉及一个能使质粒在大肠杆菌中维持、分裂的元件；一个能促使目的基因在机体内表达的元件和选择标记外，还涉及其他一些调控元件，以促使转基因的表达和质粒的稳定21，这些元件涉及真核启动子、终止子及其终止信号等，启动子是外源基因在动物细胞内获得表达的必要前提，常见的有CMVI/E、SV40、EF-1及UbC和MHCI等，CMV比SV4022和UbC23等更为有效，其中内含子A更能提高CMVI/E的表达水平22，CMV现已被广泛使用在商品化载体上，这对商业开发DNA疫苗来说是十分有帮助的。此外，一些抗原基因自身来源的启动子也可用来构建DNA疫苗，但对于想同时表达多个抗原基因的质粒而言，此种启动子的效果不明显；常用的转录终止子及终止信号涉及牛生长激素（BGH）、SV40及人-珠蛋白。此外，在构建DNA疫苗时，可运用非甲基化的细菌DNA-CpG寡脱氧核苷酸来优化整个质粒，提高DNA疫苗的免疫原性，这是由于真核生物CpG的概率只有原核生物的1/16左右24，这种频率上的差异使得其与模式辨认受体TLR-9的互相作用，提高了免疫应答水平25。4. 目的基因在选择和构建质粒DNA时，一方面应考虑的是质粒DNA可否整合入宿主基因组，因此，在选择目的基因时，须严格避免目的基因同人类基因组之间具有长片断的同源序列；启动子和终止子同样须认真筛选以严格控制其生物学活性；此外所有构建质粒DNA的过程需要有具体的记录，且附有基因的序列，宿主菌的表型和基因型鉴定26-32。5. 质粒的稳定性质粒DNA导入宿主细胞后，必将引起宿主菌生理发生改变33，质粒的复制增长了宿主菌的承担，引起宿主菌生长速率下降，使得重组工程菌的发酵过程比非重组菌的发酵过程复杂化，进而有也许减少质粒DNA的稳定性；同时，外源基因的插入也会干扰到质粒自身的稳定性，在以大肠杆菌为宿主的发酵过程，还必须考虑到宿主菌的遗传特性34-36，鉴定其是否存在可以降解重组DNA，或者产生引起重组DNA的不稳定性的蛋白酶或其他一些蛋白分子。5.1 质粒不稳定性的概念质粒不稳定性，是指工程菌在生长过程中重组质粒发生变化，结果不呈现原有的表型特性。质粒不稳定可分为两类：分离不稳定性和结构不稳定性37。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分派引起部分或所有质粒的丢失；结构不稳定则是由于重组质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒的分派不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒产量和质量。假如发生质粒分离不稳定，由于部分重组质粒的丢失，工程菌的发酵过程事实上是工程菌和不具有质粒的宿主菌的混合培养，Imanaka38证实在非选择性条件下，具有重组质粒的工程菌的比生长速率（+）往往小于宿主细胞的比生长速率(-)，通过25代后，培养液中几乎都是无质粒的细胞。5.2 质粒拷贝数质粒拷贝数是体现质粒稳定性的一个重要特性，拷贝数一方面决定于自身的遗传特性，同时也受到宿主菌生理状况及生长环境的影响，Enberg & Nordstorm39研究认为宿主菌生长速率增大，质粒的拷贝数下降，这也许是高比生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降。此外，Koizumi40的研究同样证实了营养物质的限制或缺少也会导致质粒拷贝数的下降。一般来讲，质粒拷贝数对质粒稳定性的影响因质粒的不同而不同，Futcher & Cox41对几种质粒的稳定性进行了研究，发现质粒稳定性随着拷贝数的增大而增长，但当质粒拷贝数太高时，质粒也往往不稳定，因多次复制，增长了出差错的机会。5.3 培养方式对质粒稳定性的影响培养基对质粒的稳定性也起着非常重要的作用，Caulcott 42研究表白质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养基。低温往往有助于重组质粒稳定地遗传，而当温度高于50时，重组质粒在分批培养的对数后期和连续培养时均呈现遗传不稳定状态43。5.4 解决办法在重组基因工程菌发酵过程中，克服质粒丢失的最广泛使用也是最有效的方法就是添加针对抗性基因的抗生素。FDA规定不管在生产还是管理上都应用卡那霉素代替氨苄青霉素，其因素是考虑到内酰胺类抗生素是一种强烈的过敏原；此外，用抗生素添加法来消除质粒脱落性的不稳定性在大规模生产时并不可取，由于这种选择压力只能维持一段时间，要从主线上解决这个问题，需要研究影响质粒稳定性的各个过程（质粒的复制、质粒的转移及质粒在子代细胞中的分派等）44；此外，质粒的平衡致死系统有也许为彻底摒弃抗生素的使用奠定基础45。二、菌种库的建立对转化大肠杆菌的条件进行优化。建立原始种子库。分析种子库的遗传稳定性，要明确该种子库可以传代的次数。在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类细胞库没有噬菌体和其它外源因子的污染；并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景涉及基因型、表型未发生改变；应检测细菌的形态学，保证细菌的均一性；应检测导入基因的存在状态。并对工作细胞库的规模、保存条件、扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量）、允许的传代次数等进行研究。三、含重组质粒基因工程菌的发酵影响质粒 DNA 产量的因素最重要的是宿主菌株的遗传背景和质粒分子自身的拷贝数，除此之外，在工业发酵中宿主菌株的生长条件和培养基类型也是不可忽视的条件。一般建议使用 endA 基因发生突变的（endA1）大肠杆菌宿主菌株，例如 DH5，JM109，以及 XL1-Blue 等，由于 endA 基因突变的结果，使得大肠杆菌宿主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶的能力，从而增进了所含质粒 DNA 分子的稳定性46。在典型的分子生物学实验中，质粒是由大肠杆菌在摇瓶中发酵生产的，温度、转速和培养基是唯一可控制的因素47。一般培养物的质粒产量在 1-10mg 之间；在高密度培养的发酵罐中，诸如培养基组成、温度、pH 值、溶解氧、积累的代谢产物，搅拌速度等影响细菌及质粒产量的因素都能得到监测和控制，质粒产量可达摇瓶的10到50倍48，Lahijani R49的研究数据显示每升培养基可以产出220mg质粒DNA，Schmidt T50也表白质粒产量可达225mg/L。高密度培养技术的出现，不仅能增长产率，并且也为减少发酵罐容积、减轻分离纯化、减少污水、减少能耗和成本带来好处。3.1 培养基的组成大肠杆菌可以在营养丰富或贫乏的培养基中生长，但是营养物的种类及来源对质粒DNA的质量和数量都产生重大影响51。由于可生产高的细胞密度，丰富的、复合培养物，如酵母膏和/或蛋白水解物很受欢迎，肉膏由于也许具有疯牛病等动物病毒而成为潜在的污染源被排除在外。除了丰富营养物，还需加入葡萄糖或甘油等碳源物质，Korz52研究表白，以甘油为基础的碳源培养基的生长速度较慢，几乎不产生乙酸，终产物也比以葡萄糖为碳源的培养基多，但当它们超过一定的范围时都会阻止细胞的生长，这就解释了为什么在间歇发酵中增长营养物的浓度并不能得到高细胞密度的因素。目前，常用的有三种形式的培养基：限制性培养基、半限制性培养基和复合培养基，其可反复性依次减少。OKennedy53的研究结果表白，半限制性培养基生产质粒pSV的产量为9.12g/mg干菌，比复合培养基的4-6g/mg干菌高一些。同时， OKennedy54还证实了用于质粒生产培养基最佳的CN为2.781，最大比例不要超过121，由于在此范围内，细菌膜上的肽聚糖的成分没有发生改变，不会影响到化学裂解的特性，在实验过程中，OKennedy还发现添加氨基酸后的限制性培养基SDCAS，无论在提高质粒超螺旋的比例上还是在减少质粒的丢失率上都比LB培养基的效果好，且SDCAS经碱裂解后产生的宿主基因组DNA也明显减少。3.2 发酵方式的选择发酵一般以分批或者流加的方式进行55。在这两种方式中，流加发酵可以提高细胞密度，并因此也许改变质粒的质量，Matsui56报道在发酵过程中添加固体葡萄糖，可以使DCW(dry cell weight)达成134g/L，质粒在细胞中一般呈现负超螺旋结构，但据了解，宿主菌的生长条件，溶解氧及温度等的改变都可以改变超螺旋质粒的密度57。D.J.Korz58研究证实，溶氧局限性或CO2过剩都会促进乙酸形成，促使细胞衰老和死亡，减少质粒DNA的产量和质量。Lahijani59 探讨了温度和流加操作对质粒产量的影响，培养物在连续流加操作中保持 37直至 OD600达成某个数值后，升温至 42或 45，这样可大大提高质粒的产量，补料过程中，可尽量使用氨水来调节pH，这样可以补充氮源。也有实验指出质粒的生产由于质粒自身而异，相同发酵条件下不同的质粒产量会有很大差异；但多数研究者认为，控制细菌较低的比生长速率，对质粒的复制有很大的好处，由于，宿主菌过快的直接后果是质粒复制跟不上细菌的生长，导致拷贝数下降或者质粒丢失。抱负的质粒收获阶段应当是在细菌生长进入生长对数后期或静止期前期，此时RNA转录，蛋白质翻译的水平处在最低，质粒的复制达成最高水平。1989年，Reinikainen 60研究小组得出结论，pH值介于6.2-6.8之间和30的培养温度有助于ColE1类型复制子质粒产量的提高，此外，添加氯霉素61，氨基酸饥饿62，添加痕量维生素63等都可以提高质粒DNA的产量。四、质粒的分离和纯化在质粒的最终产物中，宿主基因组片段、高分子量的RNA特别是核糖体RNA和质粒的异构体不利于质粒的基因转染，因此，如何有效消除这些杂质尤为关键。由于质粒DNA的这种带负电荷的多形结构使得它的电荷性和亲水性可以与许多分子如内毒素和杂蛋白相结合，加大了其纯化的难度，虽然目前有很多种方法可用来纯化质粒DNA，但迄今并没有一个相关的标准。在实验室未优化的条件下，质粒产量通常较低，且提取和制备的质粒DNA损失严重，不符合FDA等相关组织机构的条例。除此之外，质粒的大规模提取要考虑到如何减少生产成本，并按照生物制品评价和研究中心（Center for Biologics Evaluation and Rrsearch, CBER）下属的疫苗研究和管理办公室已有的章程严格执行 64。如前所述，质粒纯化时，重要考虑四种杂质：gDNA，RNA，蛋白质和内毒素。质粒的工业化大规模生产除了要除去这些杂质之外，还应当避免使用有毒，有机、易燃试剂和动物源性的酶试剂65。在保证产率和纯度合格的情况下应选择省时、省成本、省纯化工艺的操作流程。所有的操作都应当可以放大到每批生产克级甚至公斤级的质粒。最重要的是，所有过程要有反复性，这样才干使生产出的质粒一直符合产品规格。一般的，质粒的大规模纯化涉及下面几个或所有环节：细胞裂解，沉淀，酶消化，柱层析（一步或多步），脱盐或着改变缓冲液，以及无菌过滤。质粒的大规模生产纯化的大体流程如下图所示66：4.1 细胞收集细胞培养结束后，必须通过连续流或者微过滤67对培养菌体进行浓缩，这不仅仅是要对菌体进行浓缩，并且是为了去除对接下来的纯化有影响的培养基成分。4.2 细胞裂解细菌细胞裂解是纯化流程中的关键一步。可以通过多种手段来完毕细胞的破碎：机械破碎（珠磨法、渗透压冲击等），酶解法，热裂解和碱裂解法。4.2.1 机械裂解关于机械破碎裂解大肠杆菌以释放质粒的研究表白只有微流体化和珠磨法能获得完整的质粒分子。当用微流化器破碎细胞达65时，质粒最多可以回收35，而用玻璃珠研磨破碎细胞达50时质粒分子最多可以回收达74，用微流化和玻璃珠研磨破碎细胞后，超螺旋质粒在总释放质粒中分别为80和94，增长细胞破碎频率将使超螺旋质粒减少至10以下68，绝大多数质粒呈现“smear”形状，为获得相对产量较高的超螺旋质粒必须减少细胞破碎率，因此，在规模化生产上，这些破碎方法并不合用。4.2.2 热裂解Zhijun Wang69等研究认为热裂解具有不需完全破裂细胞、价格低廉、操作简便快捷等诸多优点，其所需设备一般有蠕动泵、去污剂和循环热水浴等，但是我们的热裂解实验结果表白：靠蠕动泵将悬浮在Triton、EDTA中的菌液循环于沸水浴一段时间后，得到的菌液粘度太大，不易下一步操作，且具有的宿主基因组DNA太多，因此我们放弃了进一步的尝试。4.2.3 碱裂解目前最受欢迎的细胞裂解法是由 Birnboim & Doly70提出的碱裂解法，它重要是靠0.2M NaOH、 1%SDS和pH4.8的KAC来完毕的，它的整个环节涉及我们常说的SolutionI、SolutionII、SolutionIII三步，一方面是将菌体悬浮在SolutionI中，其中的EDTA比较关键，它起着两个作用：（1）鰲合细胞膜和骨架上的Ca2+、Mg2+，从而使细胞更易破碎（2）鰲合Mg2+，使得内源性DNase没有Mg2+不能发挥作用，保持质粒DNA的稳定性，此外SolutionI中的Tris起着稳定pH的作用，葡萄糖起着缓冲防止gDNA断裂的作用。SolutionII是非常关键的一步，SDS破坏胞膜，释放菌体内容物，同时也能使绝大多数的蛋白质和脂肪变性并溶解，NaOH使质粒DNA和基因组DNA都变性，而质粒DNA由于有特有的拓扑超螺旋结构，可以在下一步中自然复性，而基因组DNA则永久变性，在这一步中注意事项是在混匀过程中动作必须轻柔，因素是防止局部pH大于13而导致质粒DNA不可逆变性和粗暴操作导致的基因组断裂，局部高浓度的SDS也会形成鬼带（ghoast band）71。接下来的是用SolutionIII进行中和，使质粒DNA复性，同时高浓度的KAC也起到了盐析的作用，最终形成的SDS-gDNA-蛋白不可溶复合物而被去除，这一步使得变性的蛋白质和脂质变成不溶的，凝乳状的沉淀，同时一部分染色体 DNA也沉淀出来，而质粒 DNA 仍然呈溶解状态。这是由于染色体 DNA 和一些蛋白质及脂质是部分相连的，而质粒通常没有这种连接状态。在最终的沉淀环节，考虑到质粒DNA双螺旋结构是由两条带磷酸基的骨架构成，存在着互相排斥的也许性，所有可以在其中加入一些NaCl和NaAC等使得DNA更易沉淀，天气炎热时还可减少温度，以抵消布朗运动效应带来的质粒不易沉淀的后果。由于SolutionIII中KAC的成本非常昂贵，为了减少生产成本，我们根据溶液III的原理，摸索了许多种新配方，同样也能达成相似的效果，成本却大大减少，为大规模生产质粒DNA提供了有力的保证。4.2.4 苯酚、氯仿直接抽提法1999年，Jun Song72等人报道了用苯酚和氯仿直接抽提培养菌液来获得质粒DNA的技术，这项技术可以大大节约质粒提取的时间，特别体现在通量筛选重组克隆时优势明显，但其不能去除宿主基因组DNA。4.3 质粒制备液的净化和浓缩在实验室水平上，去除细胞碎片、变性蛋白和核酸沉淀物的办法通常是离心。然而，这并不合用于质粒DNA 的工业化生产。在工业操作中，这应当由被证明是产生剪切力低的操作来完毕。这是由于：第一，应避免将染色体 DNA 剪切成片段，否则染色体 DNA 将从沉淀中释放并污染质粒；第二，质粒在分离过程中也要受到剪切，假如质粒分子较大，则也许发生分子链的断裂。工业上的离心机通常采用连续流加方式操作以达成高的解决量。进入离心机的流体所产生的离心加速度也许导致剪切，从而打散已经沉淀的物质和 gDNA。因此，过滤成为比较抱负的操作，但是如何防止粘稠的沉淀复合物不堵住过滤孔还是一个复杂的技术难题。 质粒 DNA在大肠杆菌裂解液中只占总核酸的 1%(w/w)73，裂解后，仍然存在大量的 RNA 和蛋白质，这些都必须在随后的环节中被去除，同时应当减少溶液的体积以便于后续操作。通常的解决方法是过柱法，涉及离子互换74、分子排阻75、疏水层析76、三链DNA亲和层析77；或者通过加入无水乙醇、异丙醇来达成浓缩质粒DNA的目的，但无论是前者还是后者都存在着局限性，过柱的速度通常较慢，且质粒DNA的电荷性和疏水性与杂质RNA、内毒素、宿主蛋白都很相似，不易掌握具体的pH和盐浓度；醇类的浓缩需要的体积很大，无疑增长了成本，并且有背于不能使用易燃、易爆物品的原则。因此，其他的浓缩方法应运而生，这涉及分子切向流法80,小分子类物质如精胺79、十六烷基三甲基溴化铵80、聚电解质81等，此外芳香化合物82和MnCL283等都有报道。4.4 宿主细胞中核酸和其他内容物的组成正常生理状况下，大肠杆菌宿主细胞具有水、核酸、蛋白质、内毒素和小分子和一些离子，其占有含量和种类各不相同，分子量也差异很大，如Atkinson84所述，见表。种类总量（W/W）种类/个细胞平均分子量水70118核酸基因组0.51a2.8106转移RNA4.84028核糖体RNA0.93500-1000信使RNA0.3400-800660-990质粒DNA113300b蛋白质1511008-200内毒素510小分子和离子3800-2001a快速生长的大肠杆菌细胞中具有4个基因组分子。b质粒分子大小为5kb。4.4.1 RNA粗制的质粒DNA中，RNA的含量是质粒DNA含量的20倍左右78，因此，如何有效地消除RNA特别是大分子量的核糖RNA和信使RNA十分重要。现今，绝大多数的纯化方法都使用了牛源性的RNase A，这有违于严禁使用动物源性酶制剂的相关条例85。2023年，Cooke86有使用表达RNase A基因的宿主菌来制备质粒DNA的成功报道，本实验室也有使用大肠杆菌分泌表达的重组牛RNase A来消除RNase A的成功经验（未发表）。David87 的实验结果表白在碱性条件下长时间孵育也可以很好地消除RNA，但是根据我们的实验数据，超螺旋质粒DNA的比列严重下降，损害了质粒DNA的质量。此外，37运用内源性RNase A也可去除40的RNA88，2M的氯化钙89、5M氯化锂5等都可成功消除RNA。4.4.2 蛋白质粗制质粒中杂蛋白的含量也相称可观，一定数量的杂蛋白除了减少质粒DNA的转染效率外，可引起机体的异源免疫反映，它的去除一直依赖于对人体和环境有污染和腐蚀的苯酚、氯仿。考虑到蛋白的分子量远远比质粒DNA小，Teeters认为可以运用分子量上的巨大差异来去除蛋白质92。Russel J 80和 Wahlund81报道运用CTAB或聚电解质与DNA双螺旋大小沟特异结合的特性可以选择性沉淀DNA，而将杂蛋白留在上清中，通过离心就达成去除蛋白的目的。此外，用离子互换层析91和亲和层析柱92等技术都可以除去蛋白质，达成纯化质粒DNA的目的，并取得了很好的纯化效果。4.4.3 内毒素细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜上的特有结构，在细菌生长、死亡的过程中被释放出来，在质粒制备过程当中，细胞破碎后，大量的内毒素都释放到溶液中93。由于内毒素具有极强的热源性，少量的LPS就可以引起发热、血液循环障碍甚至休克死亡，因此它的去除显得十分地重要94。由于内毒素经常形成囊状结构，其分子量与质粒大小相似，并且电荷性与疏水性都与质粒DNA相似，给质粒DNA的纯化带来了很大的麻烦。目前，内毒素的去除方法重要分为三大类：一是非选择性去除，涉及活性炭吸附和萃取95，运用分子量差异进行的超滤96和pH值差异进行的离子互换色谱97，这几种方法没有考虑到LPS结构方面的特殊性质，去除效率较低；二是选择性去除，重要是指亲和色谱法，找出适当的配基，将其固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，即可成为一种高效能、高选择性的LPS吸附剂，这些涉及组胺、组胺酸类98；多粘菌素B99；聚阳离子配基如PEI100，聚-L-赖氨酸101；荷正电聚合物-甲基-L-谷氨酸酯102等；三是特异性去除法，这是根据LPS结合蛋白（LBP）的结构和功能，提出的一种内毒素去除的特异性配体。4.4.4 基因组DNA符合药物动力学质粒中的宿主基因组DNA的含量必须小于10ng/g质粒DNA，在发酵至纯化的过程中，由于酶解和机械剪切力的作用，宿主基因组非常易断，而现行的离子互换等各层析法纯化质粒DNA涉及了其不能有效去除宿主基因组DNA和内毒素的缺陷，在消除基因组DNA的实验中，以Levy103 和 Winters104的硝酸纤维膜和硅酸钙最为有效。4.5 质粒纯化策略氯化铯密度梯度超速离心是质粒纯化的标准分子生物学方法，但此方法耗时，并且难以扩大，并使用了有毒和诱变试剂，不适合用于临床的质粒DNA的生产。虽然目前纯化质粒DNA的技术还很不成熟，但一些方法具有很大的吸引力。从目的上来讲，实验室制备小量的质粒也许更多的从纯度上考虑，但是要大规模生产质粒，除了纯度上的问题，尚有过程的可放大性，重现性，成本等诸多问题需解决。4.5.1 离子互换色谱离子互换色谱（Ion exchange chromatography, IEC）运用离子互换剂为固定相，是根据荷电溶质与离子互换剂之间静电互相作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法。鉴于核酸溶液带有多聚阴离子，可以采用阴离子互换色谱的方法纯化质粒 DNA105。DNA 的双螺旋结构使亲水性和疏水性基团分离，疏水性碱基处在双螺旋的内部，两条螺旋形糖-磷酸链缠绕在双螺旋结构的外侧，从而形成多阴离子、高度水化的亲水表面，Stahlberg 等人106提出一种量化理论，假定带有多电荷的生物分子和离子互换剂表面间的互相作用，可以看作是两个带电荷表面在与缓冲盐溶液接触时的远距离静电作用，固定相表面是带电荷的基团，使其表面和溶液之间产生了静电势差，从而具有吸引那些带有相反电荷的溶质分子来到表面的能力。4.5.2 分子排阻色谱分子排阻色谱，又被称为凝胶过滤，可以用来分离不同大小及具有不同流体力学半径的分子。与阴离子互换树脂不同，用作分子排阻色谱的树脂不和质粒或者其它杂质结合，该树脂包具有具有拟定大小的通道。较小的分子比较大的分子更容易进入这些孔中，并且由此在柱中的流动受到阻碍。既然不用以高浓度的盐或者有机试剂来洗脱质粒，分子排阻色谱的操作显得相对较为简朴。洗脱顺序与分子大小顺序相反，最大的分子最先洗出。分子排阻色谱在将质粒DNA从小的RNA片段及被RNA 酶消化的核酸中分离出来显得特别有效，它也能被用于移除质粒溶液中的盐、缓冲液和其它低分子量的化学试剂。分子排阻色谱也也许将质粒从比它更大的 gDNA 分子中分离出来，并且，分子排阻色谱在移除内毒素方面显得很有成效。但分子排阻色谱有相对较低的分辨率，一般要将两种分子达成完全的分离需要这两种分子大小相差至少两倍。因此，在分子大小上与质粒 DNA 相近的染色体 DNA 以及高分子量的 RNA 片段就很难由分子排阻色谱除掉。该基质的排阻极限对蛋白质是 100106 Da，对线性DNA是20kb，对球状微粒是 400nm。70的回收率中洗下部分几乎是纯的超螺旋质粒 DNA107。4.5.3 疏水色谱大肠杆菌gDNA自身是双链DNA，但经碱裂解之后，绝大多数变成了单链，两条链互相分离并部分断裂，因此疏水碱基暴露，在疏水色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）过程中，质粒分子的疏水碱基隐藏在双螺旋内部，与配基的作用力非常薄弱，另一方面，高浓度的单链核酸，如RNA和变性的gDNA则与配基牢固结合，同样道理，变性的质粒DNA也暴露了疏水碱基，可以通过HIC去除，LPS通过脂基团而与HIC的配体发生作用，并且只有在减少盐离子浓度后方可被洗脱，合成的寡核苷酸进行的实验表白，单链越长，与HIC柱子吸附的时间越长，说明了核酸分子中碱基多少与吸附时间成正相关。Diogo108报道通过此方法可以减少内毒素的含量20倍以上，天津大学的Yuan Li109等人报道使用HIC来纯化质粒pcDNA3.0也获得了良好的效果。4.5.4 亲和色谱亲和层析基于连接在固相支持物上的寡聚核苷和引入目的质粒的特定序列之间形成的三重螺旋结构发展起来110。显然，这些支持物对超螺旋构型的质粒的亲和力比对松弛异构体的亲和力高。回收率可高达62，同时将RNA和gDNA 的含量减少到检测不出的水平。此外，乳糖阻遏蛋白等也能与特殊DNA序列结合的物质小规模纯化质粒。不管是寡聚核苷和质粒结合还是特殊的蛋白和质粒结合，亲和配体和固定相偶联，并同质粒的目的序列互相作用。由于这种结合是依据特定序列的，所以亲和色谱可以高效地将质粒DNA从蛋白质，RNA 和非特定DNA中分离出来。然而，这些方法也只限于小规模的质粒纯化。这重要是由于构建大量的亲和树脂在技术上有困难，同时成本很大。此外， Woodgate111 和 Kostal112 分别研究了使用锌指结构的GST的序列特异性的层析和以温度诱导金属调节蛋白MerR进行质粒纯化的策略，这两项研究可以丛细胞裂解液中直接纯化质粒DNA，规模可以放大，特异性好，成本也较低，为此后的质粒纯化提供了一定的借鉴。4.5.5 芳香层析2023和2023年，Lemmens和Lena M82，113先后报道了在高浓度离液剂或水化盐的情况下，使用芳香硫醚为配基的亲硫层析进行了高质量的质粒纯化，其机制也许是涉及质粒DNA在内的各种核酸分子在高浓度水化盐如硫酸铵的存在下，各分子发生不同限度的浓缩和结构的改变，而恰恰是这种结构的改变促使超螺旋质粒DNA可以通过-作用与配基上的芳香基团结合而被纯化。4.5.6 去污剂CTAB 是一种阳离子表面活性剂，它可以与DNA 分子上带有负电荷的磷酸基团发生强烈的静电互相作用，同时，其碳链也可以和 DNA 分子发生疏水互作用，从而中和带电的 DNA 分子使它们从溶液中沉淀下来。向细胞裂解液缓慢地加入CTAB，一方面，可以选择性地沉淀质粒DNA；另一方面，蛋白质、RNA和脂多糖等杂质保持完全溶解的状态。质粒沉淀后，可以往沉淀中加入浓的氯化钠溶液来去除 CTAB。质粒沉淀物中还具有少量 gDNA，但是假如加入的氯化钠的量控制得很精确，就可以只溶解质粒 DNA，而 gDNA 仍然保持沉淀状态。在使用 CTAB 沉淀纯化质粒 DNA 后，质粒的纯度达成 90，再用盐溶液溶解之后，质粒纯度达成 9980。使用这种方法大规模纯化质粒的关键在于 CTAB 及 NaCl 的加入应当做到精确控制。因此，在线实时检测系统显得必不可少。2023年，*学者Chowdhury报道使用两性去污剂十二烷基二甲酯氨硫璜丙烷和碱来纯化高质量的质粒DNA114，其作用原理也许是去污剂使蛋白分子等杂质随机组装从而形成可见的“软”沉淀，而质粒DNA则通过静电作用被包裹并与杂质形成分离，并由于两性去污剂独特的作用溶解在可溶相中。4.5.7 浓缩沉淀剂常规的质粒DNA纯化方法耗时长、使用了吸附剂、核酶和过滤介质等，限制了质粒DNA的规模化提取。1999年，Jamie115报道了使用浓缩沉淀剂来选择沉淀质粒DNA的原理，该类沉淀剂是小的阳离子分子，可以与双链DNA的大沟和小沟相结合，缩小DNA体积4-6倍，同时还起到包裹DNA的作用，在其浓缩沉淀质粒DNA的过程中，一般都在低的盐离子下进行。当其与大、小沟上的磷酸基团互相作用，周边的DNA分子都发生浓缩时即可发生沉淀，并且，这些分子不仅减少了双螺旋之间的排斥作用，还使其互相连接。这种应用最早是Hoopes和McClure116在用精胺和亚精胺从小分子中沉淀大分子DNA的实验中被证实，最初鲑精DNA，Pbgs19Luxwt（6.0kb）均在低离子浓度下被沉淀，而在600mM的NaCl中未出现沉淀。Mourich79于2023年也有用精胺纯化pTH.HM的报道，并比较了其与QIAGEN公司无内毒素试剂盒纯化质粒的转染效率，成本为3.16美元/毫克质粒。Bloomfield和Shenoy报道的MnCl283与精胺同样，同样可以通过与DNA大小沟结合来分离和纯化质粒DNA。4.5.8 磁性分离法2023年，中国台湾的Chen-Li Chiang117-118连续报道了使用化学方法制备微小颗粒Fe3O4，并用多聚阳离子聚乙烯亚胺（PEI）包裹，将其置于磁场下，通过顺磁性可以从细菌裂解液中直接纯化质粒DNA，这种磁性颗粒在磁场下，具有磁性强和低毒性的特点，在生物领域备受关注，严格来讲，只有在磁场中，它们才呈现磁性，并且这个特性使得其可重新分散和反复运用。金属可以鳌合氨基酸从而来纯化蛋白，现发现，金属同样可以鳌合暴露出的嘌呤碱基而与单链核酸结合而与质粒DNA分离，Balan119等研究证实，用铜载的多聚N异丙基聚丙酰烯胺和乙烯基咪唑，可以从宿主菌裂解液中特异吸附RNA分子，从而达成纯化质粒DNA的目的，先前质粒DNA的纯化大都依靠吸附、密度或结构差异从基因组DNA、RNA和蛋白质中分离质粒，用金属来分离纯化核酸的报道非常少见，鳌合配基如次氮基三乙酸和亚胺酸与二价金属离子偶联，通过-d的轨道重叠，与芳香氮具有高亲和力，从而达成纯化效果。4.5.9 双水相分离质粒DNA1962年，Albertson120是最早运用双相分离法生物分子的研究工作者之一，但是该技术在质粒DNA纯化上的进展缓慢，1978和1991年才由Ohlsson121和Cole122报道了两个研究报道。直至2023年，Ribeiro123系统描述了用PEG/磷酸盐的两相法纯化质粒DNA的报道，并证明用PEG600和PEG1000与磷酸盐组成的两相分离体系的回收率高，杂质少，具有喜人的前景，随后两年，Trindade124 和Kepka125也分别有用两相分离法纯化质粒DNA的报道。4.5.10 分子切向流Tangential flow filtration(TFF)技术重要运用质粒DNA、RNA、基因组DNA等分子的大小不同，滤掉RNA和蛋白质等小分子，而将质粒DNA保存在膜上，使用TFF的重要注意事项是跨膜压、膜孔和缓冲液的传导性。Eon-Duval78使用TFF技术成功地纯化了具有乙肝表面抗原基因的质粒（7.7kb），David使用TFF技术纯化了6种质粒DNA，RNA的去除率达99以上，蛋白质的消除也大于95。除了以上列举的方法之外，尚有许多改善的纯化策略，如使用膜126(membrane)和盘127（monolith）制作的色谱技术，一改以往柱吸附效率低下，不适合规模化生产的缺陷。五、质量控制及检定的规定基于质粒 DNA 的生物药剂是高度化学限定的，因此能用化学，生化和物理试剂对其进行分析。为保证产品符合规格而分析所制备的质粒的安全性、效力及纯度是使整个生产流程得以建立的关键问题。评价用作基因治疗和 DNA 疫苗的 DNA 产品的纯度，安全性及效力的重要标准和推荐试剂如下所示：5.1 产过程中质量监控标准的建立及规定在生产工艺的各个环节和环节中对其产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行。由于各种方法的工艺不同，所制定的监控标准和在何环节进行监控也许不同，但其原则是保证产品的质量、工艺的连续性和稳定性。5.2 产品的质量检定与规定外观检查：根据样品的特性建立外观的质量标准，高纯度的质粒DNA呈现生鱼肉透明状，pH一般为7205。纯度：重要是评价纯化的重组DNA制品中是否具有宿主RNA、DNA、内毒素和蛋白的污染。一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测制品中有无RNA，规定无明显的RNA带型；采用Northernblot或荧光定量PCR的方法检测制品中残留的宿主DNA的含量，在该方法的研究时应建立宿主DNA的标准品，并对该类试剂的敏感性和特异性进行验证。规定DNA制品中残余的宿主DNA含量不超过0.01g/g 质粒。可以二辛可宁酸法检测制品中宿主蛋白的残余量，在该方法的研究过程中应建立宿主蛋白的定量标准，并对检测