免疫组织化学免疫组化技术.doc

免疫组织化学（免疫组化）技术 运用抗原抗体的特异性结合反映来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry IHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。其特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。 第一节 免疫组化的发展史及应用自1941年 Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。如下表 免疫组化的发展过程年代 研究者 事件 1941Coons实用免疫萤光技术1948Fagraeus进一步发展免疫萤光技术1970Sternberger抗体酶标技术1974Taylor证实组织中浆细胞免疫组化1975Kohler Milstein单克隆抗体技术（被成为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞）。1981HsuABC法1990 至今SP法、原位杂交免疫组化技术 由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的鉴定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推动到了基因水平。越来越多的癌基因与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，并且使肿瘤的防止，初期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。在国外，病理诊断免疫组化开始于70年代，80年代发展至高峰，90年代已列入病理技术室常规工作。在国内，免疫组化到90年代才开始在病理诊断中逐渐普及。第二节 免疫组化的基本原理基本原理：众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组织化学正是运用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。反之亦然。由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反映部位显示出来，以期达成对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。如前所述，免疫组化重要涉及免疫学和组织化学的有关理论和技术，其中关键在于制备高效的抗体，后者又重要取决于抗原的质量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。在抗体制备上，经历了从抗血清，纯化IgG到单克隆抗体，甚至发展到应用基因重组技术获得分子量较小的特异性片段。就单克隆抗体而言，它是在 1975年由 Kohler 和 Milstein 建立了杂交瘤技术后才开始问世的，现已被广泛应用于研究中，它具有更好的特异性，大大地提高了免疫组化的技术水平。显示技术的发展也相称迅猛，初期只是简朴的将标记物结合在抗体上，以后则发展到将标记物结合在抗抗体上或与抗体具有特异亲和性的分子上，用于标记的物质有很多种，如荧光染料、放射性同位素、酶、胶体金等。借助于荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜，就可观测到这些标记物发出荧光、酶促反映产生的有色沉淀或高电子密度颗粒，从而观测到抗原抗体复合物所再的部位。由此可见，免疫组化技术以其特异性和灵敏度高等特点，又因其操作比较简便而得以广泛应用。第三节 有关的免疫学理论抗原（antigen）：抗原应具有的条件： 异物性理化性质特异性 抗原的种类： 免疫原性与免疫反映性完全抗原不完全抗原抗原与机体的亲缘关系 异种抗原 同种异型抗原 自身抗原抗原的化学结构 蛋白质抗原 多糖抗原 核酸抗原低分子量物质抗原合成多肽抗原抗原的理化性状 颗粒性抗原 可溶性抗原 抗原的制备：材料的准备和预解决组织的粉碎抗原的提取抗原纯化抗原纯度的检测半抗原的免疫原制备法抗体（antibody） 是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反映的球蛋白，称免疫球蛋白（immunolobulin,Ig）,共有五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,重要分布在血清或外分泌物中。 抗体的分子结构抗体的理化性质抗体与抗原的特异性结合抗体的种类 抗体的抗原性： 同种型抗体 同种异型抗体 独特型抗体 抗体的制备方法： 多克隆抗体（血清抗体）指机体接受抗原的积极免疫或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。 单克隆抗体是1975年由Kohler和Milstein发明的一种新技术。原理是将体外培养的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞系既有骨髓瘤细胞无限生长的能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。这种免疫细胞通过纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，既单克隆抗体。这一技术被称为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞。（祥见图解） 单克隆抗体与多克隆的特性比较见下表:单克隆抗体与多克隆的特性比较特 性 单克隆抗体 多克隆抗体 组成 特异性 亲合力 交叉反映 单一类的抗体 高，针对单一抗原决定簇 不定，较低 低 多种类抗体的混合物 低，针对多个抗原决定簇 平均亲和力较高 高 第四节 免疫组化的基本技术根据标记物（或示踪物）不同可分为以下技术： 免疫荧光组化技术免疫酶组化技术亲合免疫组化技术 免疫胶体金组化技术免疫铁蛋白技术尚有双重和多重标记技术等。不同的免疫组化技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都涉及抗体的制备，组织材料的解决，免疫染色，对照实验，显微镜观测等环节。(一)免疫荧光组化技术1. 基本原理 根据抗原抗体反映原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针与细胞或组织内相应抗原结合，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上具有标记的荧光素，运用荧光显微镜观测标本（荧光素受荧光显微镜激发光的照射而发出一定波长的荧光），从而可拟定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。2. 分类 直接法 间接法 补体法 双重免疫荧光标记法1) 直接法用荧光标记的特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（第一抗体）直接与标本反映（染色），以检测标本中相应的抗原。如图 特点： 操作简朴，特异性高，但敏感性低，且由于一种荧光标记抗体只能检测一种特异性抗原，所以应用范围较这窄。染色环节: 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定。 必要时用酶适当消化。 用PH7.4 PBS洗15分钟。 滴加经适当稀释的荧光抗体，室温或37孵育箱内孵育3060分钟。 用PBS洗3次，5分钟/次。 用50%甘油（用PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）封片 荧光显微镜下观测。2) 间接法 此法是直接法的重要改善，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反映，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原抗体荧光抗体的复合物。如图 由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如 细胞抗原上每个分子结合35个分子的抗体，当此抗体作为抗原时又可结合35个分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。 特点：特异性强，灵敏度高，应用更广，只需要制备荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔即可应用于多种抗体（第一抗体）的标记显示。 染色环节： 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定 必要时用酶适当消化。 用PH7.4 PBS洗15分钟。 滴加经适当稀释的未标记一抗，在室温或37孵育箱内孵育3060分钟。 用PBS洗3次，5分钟/次。 滴加荧光标记二抗，在室温或37孵育箱内孵育3060分钟。 用PBS洗3次，5分钟/次。 用50%甘油（用PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）封片 荧光显微镜下观测。3) 补体法大多数抗原抗体复合物都能结合补体。因此，在染色时先将新鲜补体与第一抗体混合，同时加在抗原标本切片上，经37 孵育后，如发生特异抗原抗体反映，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反映，形成抗原抗体补体荧光抗体的复合物。如图 特点：只需一种荧光抗体，可合用于各种不同种属来源的第一抗体的检测。 染色环节： 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定 必要时用酶适当消化。 用PH7.4 PBS洗15分钟。 将抗血清60灭活20min，并作适当稀释。 将新鲜豚鼠血清（其中具有补体）稀释10倍 取等量抗血清和豚鼠血清混合，滴加在切片上，将切片置 37孵育箱内孵育3060分钟 用PBS洗3次，5分钟/次。 滴加经适当稀释的荧光标记抗补体抗体，在室温或37孵育箱内孵育30分钟。 用PBS洗3次，5分钟/次。 用50%甘油（用PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）封片 荧光显微镜下观测。 4）双重免疫荧光标记法 在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法。将两种荧光抗体（如 抗A 和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗达明荧光素标记，发红色荧光，可以明确显示两种荧光抗原的定位。 3对照实验与荧光抗体染色结果判断（1）对照实验 为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验（新抗体初次使用）时进行以下对照实验。 免疫荧光染色的对照实 对照设立直接法间接法抗补体法标本自发荧光对照阳性对照荧光抗体对照克制实验补体对照 自发荧光 组织不通过荧光染色，在紫外光或短光波的照射下，所呈的荧光称自发荧光。一般自发荧光较弱，多呈蓝绿色或蓝白色，容易与特异性荧光相区别。 例： 胶原纤维 蓝绿色弹力纤维 蓝绿色软骨组织 黄绿色心肌 黄绿色红细胞 黄色 标本自发荧光对照： 标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观测应呈阴性荧光。（无与特异性荧光相似的荧光） 阳性对照： 将以知阳性标本用免疫荧光组化技术染色（直接法、间接法、补体法）结果应呈阳性荧光。 荧光抗体对照： 除不加一抗外，其他染色环节相同，染色结果呈阴性荧光。（即标本只加荧光抗体染色） 克制实验： 在加荧光标记抗体前或同时，加入未标记的相同抗体，染色结果呈阴性或荧光减弱。 补体对照： 取新鲜豚鼠血器清1：10稀释，先作用标本，洗后再用补体荧光抗体染色，结果呈阴性。 （2）特异性染色应具有的条件 染色只限于特异性抗原。 不应被荧光素结合的非免疫血清染色。 用未标记的特异性免疫血清预先解决标本，则特异性染色被克制；而用未免疫的血清预先解决，则不能克制特异性染色。 假如将荧光素标记抗体一方面用相应的抗原充足吸取，则特异性染色被克制；而假如使用无关的抗原进行吸取则不能克制特异性染色。4荧光抗体的制备 荧光抗体的制备方法比较复杂，现在已有各种荧光抗体出售，所以，在这我们不讲。但大家要知道荧光色素的一些种类，以便对免疫荧 光染色结果的观测和判断。 目前重要常用的荧光色素有：1） 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）呈现黄绿色荧光2） 四已基罗达明（terraethylrodemineB200，RB200）呈现明亮橙红色荧光3） 四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）呈现橙红色 4）4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸氏（SITS）呈蓝色荧光5.荧光抗体的保存 以04 或 -20地低保存6荧光显微镜： 它是由超高压光源，滤板系统（涉及激发光和压制滤板）和光学系统等重要部件组成。是运用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观测标本的荧光图像。使用注意事项：1） 严格按照荧光显微镜出厂说明书规定进行操作，不要随意改变程序。2） 应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压贡灯515分钟，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适合暗室，再开始观测标本。3） 防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应带上防护眼睛。4） 检查时间每次以12小时为宜，超过90分钟，超高压贡灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本受紫外线照射35分钟后，荧光也明显减弱或退色，所以最多不超过23小时。5） 荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应用电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间，灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充足冷却后才干点燃。一天中应避免数次点燃光源。6） 标本染色后立即观测，因时间久了荧光会逐渐减弱。最佳是在稍加观测后即显微摄影。 将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。7） 载玻片厚度应为0。81。2毫米之间，盖玻片厚度在0。17毫米左右，标本不能太厚，因太厚会使激发光大部分消耗在标本的下部，而物镜观测到的上部不能充足激发，此外细胞重叠会影响结果判断。8） 荧光亮度的判断标准：（质量控制和结果解释）“”无或可见薄弱自发荧光 “”仅能见明确可见荧光 “”可见明亮的荧光 “”可见耀眼的荧光(二) 免疫酶组织化学技术（免疫酶细胞化学技术） 免疫酶组织（细胞）化学是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。1 基本原理：先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。l 常用标记酶的种类：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP、ALP、AP）酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD） 目前，用的最多的酶是HRP，AKPl 用于标记酶的规定：1. 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观测。2. 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周边组织弥散，影响组织学定位。3. 获得的酶分子，最佳有商品出售。4. 中性PH值时，酶应稳定，酶标记抗体后，活性不应改变，且酶的活性越高越好。5. 酶标过程中，酶与抗体连接，不影响两者的活性。6. 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶其中1.,2.两点最重要。由于并非容易显示的酶均有形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（HRP）较佳，是最常用的一种酶。l 酶标抗体的制备及纯化： 略l 酶的底物及沉淀颜色：见下表 酶底物沉淀颜色HRPAKPDAB（3，3-二氨基联苯胺）+ H2O2AEC（3氨基-9乙基卡巴唑）+ H2O2NBT(四氮唑蓝)+5嗅-4氯3吲哚-磷酸盐棕色红色蓝色l 免疫酶技术与免疫荧光技术不同在于： 可用普通显微镜代替荧光显微镜，易于推广 切片不易退色，可长期保存 阳性细胞定位精确，较易与非特异性反映鉴别，因此判断容易，主观性少 组织结构清楚，可与HE切片对照观测 可作免疫电镜超微结构观测2 分类：直接法 间接法 补体法 免疫酶桥法 免疫酶双桥法 过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP） 双PAP法等1） 直接法原理：用酶直接标记在特异性一抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反映产生有色产物，沉淀在抗原抗体反映部位，即可在镜下对标本中的抗原进行检测。 优点：简便，快速，特异。缺陷：敏感性差，标记一种抗体只能检测一种抗原，所以应用受限制。染色环节： 切片按免疫组化常规解决 0.3%H2O2甲醇。室温1030分钟 必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分钟，PBS洗 120正常血清，室温孵育15分钟 滴加适当稀释的酶标一抗，室温或37，孵育3060分钟 PBS洗3次，每次5分钟 加酶的底物溶液，510分钟，显微镜下观测，至特异性染色清楚，背景无染色时，终止显色。 苏木素衬染，脱水，透明，封片。）间接法原理：在间接法中先用未标记的特异性一抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（二抗）结合，然后再加酶的底物显示抗原抗体抗抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。 优缺陷：提高了敏感性，并且用一种酶标记一种抗体就可检测多种抗原，因此较直接法使用广，但其较费时，非特异性染色较多。染色方法： 切片按免疫组化常规解决 0.3%H2O2甲醇。室温，1030分钟 必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分钟，PBS洗 120正常血清，室温孵育15分钟 滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37，孵育3060分钟 PBS洗3次，每次5分钟 滴加适当稀释的酶标二抗于标本上，室温或37，孵育3060分钟 PBS洗3次，每次5分钟 加酶的底物溶液，510分钟，显微镜下观测，至特异性染色清楚，背景无染色时，终止显色。 苏木素衬染，脱水，透明，封片。以上两种方法都是通过化学方法将酶直接标记在抗体上，所以通称为酶标抗体法。）酶桥法在酶标记抗体过程中，酶与抗体的化学反映交联过程可影响酶的活性和抗体的效价，同时产生非特异酶标记抗体，可增长非特异性背景染色，为了避免上述缺陷，相继发展了酶桥法和PAP法。它们是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶抗体，通过酶与抗体的特异性结合进行标记，属于非酶标记的抗体酶法。 原理：先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高，特异性强的抗酶抗体，然后以二抗为桥梁，将在组织中与抗原结合的一抗与酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经酶的底物显示出抗原的分布。如图 l 第一抗体（假设来自种属A）孵育60分钟，37。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，振洗时不易丢失。l 切片与第二抗体（桥抗，抗种属A IgG抗体）孵育1小时37 。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。l 切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育1小时 37。因抗酶抗体和第一 抗体均系种属A IgG ，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab 能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体结在与组织抗原结合的第一抗体上。l 切片与酶（HRP）孵育30分钟 ，酶与抗酶抗体结合。l 显色 优缺陷：在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高方法敏感性，又能节省第一抗体的用量。 但其最大的缺陷是抗酶抗体必须高度纯化。由于抗酶抗体中非特异性抗体不能与酶结合，但能与抗酶抗体竞争桥抗体的结合位点，从而减少了抗酶抗体的结合，而大幅度减少呈色能力。此外，抗酶抗体的酶结合是低亲和力的，冲洗时易丢失而减少其敏感性。染色环节： 切片按免疫组化常规解决 0.3%H2O2甲醇。室温，1030分钟 必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分钟，PBS洗 120正常血清，室温孵育15分钟 滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37，孵育3060分钟 PBS洗3次，每次5分钟 加适当稀释的二抗，37 或室温，孵育30分钟 PBS 洗3次，每次 510 分钟 加抗酶抗体，室温或37 ，30 分钟 PBS洗3次，每次510 分钟 加酶溶液，37 ，孵育30 分钟 酶的底物显色 衬染，脱水，透明，封片。 4）PAP法 原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是先将抗酶抗体与酶结合制成酶抗酶复合物（PAP），PAP复合物中的抗酶抗体和第一抗体为同种属动物的IgG，所以桥抗体可以作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。如图 PAP复合物：是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，在这不介绍。 PAP复合物为五边形环状结构，这种结构极为稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了PAP法的灵敏度，约比免疫荧光法敏感1001000倍。比酶桥法灵敏20倍。 优缺陷：灵敏度高，PAP背景染色低，但制备较复杂。染色环节： 切片按免疫组化常规解决 0.3%H2O2甲醇。室温，1030分钟 必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分钟，PBS洗 120正常血清，室温孵育15分钟 滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37，孵育3060分钟 PBS洗3次，每次5分钟 加适当稀释的二抗，37 或室温，孵育30分钟 PBS 洗3次，每次 510 分钟 加PAP复合物，室温或37 ，孵育30 分钟 PBS洗3次，每次510 分钟 酶的底物显色 衬染，脱水，透明，封片。5） 双PAP法： 原理：在PAP法的基础上反复滴加1次二抗和PAP复合物，结果使抗原抗体复合物上结合比PAP法更多的酶分子，从而更进一步增强了敏感性。 双PAP法连结机理尚不清楚，也许是第一次PAP中还留有未完全结合的位点。 优缺陷：双PAP法比PAP法更敏感，但环节较多，费时较长，故不常用。（三）免疫胶体金技术1971年，Faulk 和Taylor 一方面报道应用免疫胶体金技术研究细胞表面抗原的分布，从此开创了免疫组织化学研究的新领域，即免疫金技术（immunogold technique）。免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，就能对组织或细胞内抗原进行定性、定位、甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金自身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观测。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观测。1） 胶体金的概念： 胶体金是指由直径为1100nm范围内的金颗粒所组成的分散系，即金以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。通常所说的胶体金是指以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。2） 胶体金的理化性质 颜色：与粒子的大小有关，如15nm的胶体金为红色，而95nm的胶体金则为蓝色。一般用于免疫组化的胶体金颗粒直径范围在560nm，均呈红色，但颗粒越小，红色越深。稳定性：胶体金可以在相称的时间内保持其溶胶不变。胶体金的稳定性受多种因素的影响，其中最重要的是电解质，另一方面还与浓度、温度等有关。电解质：少量的电解质对胶体金的稳定性有促进作用，但过量的电解质常导致稳定性破坏而使胶体金凝聚。 胶体金浓度：浓度越高，金颗粒之间的距离越近，容易导致金颗粒的凝聚。 温度：一般情况下，温度对胶体金的稳定性影响不大，但长时间加热会使胶体金的稳定性稍有下降。 大分子物质：大分子物质对胶体金的稳定性影响比较复杂，在一定条件下，加入大分子物质可以使胶体金的稳定性大大加强，对抗某些影响胶体金稳定因素的作用，如高浓度的电解质等。 带电性：胶体金属憎水性胶体，金颗粒周边包围了大量吸附离子所形成的静电层，带负电，可在电场中泳动。3）胶体金的制备：可用多种方法制备胶体金，其中应用最多的是化学还原法。 基本原理：是在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。常用的还原剂有柠檬酸钠，鞣酸和白磷。其中，柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，为15150nm，白磷还原制备的金颗粒直径较小，为312nm。4）胶体金探针的制备略 5）免疫胶体金染色方法： 免疫金法 免疫金银法免疫金法（immunogold staining，IGS）免疫金法可分为直接法和间接法两种。一般多采用间接法。1、 直接法将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色，然后在光镜或电镜下进行观测。这种方法非常简朴，但由于一种探针只能研究一种抗原，所以比较受局限。用胶体金标记的单克隆探针，进行双重或多重染色效果比较好。 2、 间接法是指先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合，然后用金标的二抗与一抗结合，在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究。 染色环节：（以人肝组织HbsAg的定位为例） 石蜡切片、脱蜡至水 1%胰蛋白酶消化10分钟 用双蒸馏水洗5分钟2 用TBS PH8。2 洗5分钟2 1%卵蛋白（EA）封闭10分钟 稀释鼠抗 HBsAg单克隆抗体，37 12h ,4冰箱过夜 TBS PH8。2 洗10分钟2 1%EA封闭10分钟 TBS PH8。2 稀释兔抗鼠金标记抗体3745分钟 TBS PH8。2 洗10分钟2 双蒸馏水洗5分钟2 10%戊二醛，10分钟 双蒸馏水洗5分钟苏木素衬染核，甘油封片结果：在镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表白有HBsAg 定位在细胞浆内。 免疫金银法（immunogoldsliver staining， IGSS） 基本原理：1983年Holgate 等人将IGH与银显影方法相结合立。通过免疫反映沉淀在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离（Ag ）子还原成银原子（Ag0）。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成自身也具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使银壳越长越大，最终抗原位置得到清楚放大。 染色环节： 石蜡切片、脱蜡至水 lugol液，5min 5%硫代硫酸钠水溶液脱碘5min 双蒸馏水冲洗干净 TBS PH7.4 洗5min2 1%胰蛋白酶消化10min 用TBS PH7.4 洗5min2 1%卵蛋白（EA）封闭10min 稀释鼠抗 HBsAg单克隆抗体，37 孵育12h 或4冰箱过夜 TBS PH7.4 洗5min2 1%卵蛋白（EA）封闭10min TBS PH7.4 稀释兔抗鼠金标记抗体37 45min TBS PH7.4 洗5min2 双蒸馏水洗5min2 物理显影 双蒸馏水洗5min2 苏木素衬染核 脱水、透明、封片 结果： 光镜下见肝细胞胞浆内有膜状或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。 显影液配方：1. 乳酸银显影液的配制10%阿拉伯胶水溶液60ml柠檬酸缓冲液PH3.5 10ml对苯二酚1g，加双蒸水20ml溶解乳酸银水溶液（100mg加水10ml）以上四液临用前依次混合、暗处显影2. 硝酸银显影液的配制10%阿拉伯胶水溶液60ml柠檬酸缓冲液PH3.5 10ml对苯二酚1.7g，加双蒸水30ml溶解硝酸银40mg，溶于蒸馏水2ml以上四液临用前依次混合、暗处显影 6）免疫胶体金技术的特点 胶体金制备简朴制备胶体金所需设备和试剂均易得到，制备方法也简朴、快速 标记简朴抗体等生物大分子很容易通过界面物理吸附作用，与胶体颗粒相结合形成稳定的金标复合物。由于标记过程中不需要通过任何化学反映过程，因此标记后生物大分子的生物学活性仍基本保持不变。 敏感性高电镜下，金颗粒的电子密度高，界线清楚，即使是单个的金颗粒也容易辨别。因此免疫金电镜的检出率远远超过免疫酶组织化学反映产物DAB，大大提高了免疫组织化学技术在电镜水平的分辨率。光镜下，金颗粒经银显影后得到放大，用于检测组织细胞抗原时，其敏感性也高于其他方法。 特异性强免疫金探针的非特异性吸附作用很小，较少受组织标本背景因素的影响，在抗原抗体检测中显示出高度的特异性。 定位准确由于金颗粒电子密度高，特性明显，呈散在颗粒，不存在酶反映扩散等缺陷，因此免疫金技术定位准确。 适应性广胶体金既能用于普通光镜观测，也能用于透射电镜，扫描电镜，荧光显微镜观测。标本能长期保存。 易于双重和多重标记通过控制条件可制备不同直径的胶体金颗粒，将不同直径的胶体金颗粒分别标记不同的抗体和抗原，可以在一张切片上同时区分两种或两种以上抗原或抗体的分布，因而特别合用于电镜水平的双重或多重标 （四）亲和免疫组化技术 亲和组织化学（affinity histochemistry）就是运用一些物质之间的高度亲特性，将酶等标记物连接到抗原抗体复合物上，以对体内的抗原（抗体）进行检测。 事实上抗原抗体反映本质上也属于亲和组化这一范畴，只是近代免疫组化方法的更新更突出了亲和这一组化技术的特点。（由于抗原抗体的结合事实上是由于两者之间具有高度的亲和性） 具有高度亲和的物质除了抗原抗体，尚有植物凝集素糖类，生物素抗生物素，葡萄球菌A蛋白IgG，阳离子阴离子，激素受体等。 下面以生物素抗生物素为例 生物素（维生素H，biotin）是一种分子量244Da小分子维生素。抗生物素（卵白素，