实验二-外植体的消毒接种与培养.doc

实验二 外植体的消毒、接种与培养

一、目的要求
    通过在超净工作台上进行无菌操作训练，掌握外植体消毒和接种的无菌操作技术。
二、原理
    灭菌是组织培养中重要的工作环节之一，是指采用理化手段杀死物体表面及其孔隙内的一切微生物，包括细菌的芽孢和真菌的孢子。组织培养中要求无菌室、超净工作台达到无菌状态，植物材料也要经过消毒灭菌后再接种，接种人员的双手同样如此。
    无菌室和超净工作台可采用甲醛、高锰酸钾混合薰蒸，结合紫外灯照射20～30分钟；外植体可采用75%酒精和0.1%的升汞杀菌；双手可用75%的酒精棉球擦拭；接种工具可采用75%酒精棉球擦拭，再经火焰灼烧灭菌。
三、用品用具
1、实验材料：青蒿嫩叶、菊花嫩茎、胡萝卜块根、枸杞叶、瓜叶菊叶、芦荟茎尖、康乃馨茎段、月季茎段、草莓茎段、马铃薯芽尖等。
2、实验试剂：75％的酒精、95％的酒精、0．1％的升汞（(氯化汞，HgCl2)）、无菌水、无菌滤纸等。
3、实验器具：超净工作台、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯。
四、方法和步骤
    1．用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子与鞋子，进入接种室。
    2．打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射20～３０min。
    3．操作前10～20min使超净工作台处于工作状态，让过滤室空气吹拂工作台面和四周的台壁。
    4．照射20min后，关闭紫外灯。
    5．用70％～75％的酒精擦拭工作台和双手。
    6．用蘸有70％酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台。
    7．把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95％酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上。
    8．材料预处理：剪取康乃馨植株的幼嫩茎段3～5cm，去掉叶片，用洗衣粉水清洗10分钟，再用清水冲洗残余的药剂；
9、在超净台上，用70%酒精浸泡30S，用0.1%升汞浸泡5min左右，最后用无菌水清洗3～5次，吸干水分后备用；
10、将材料置于无菌培养皿内，切取1cm左右带有一个腋芽的茎段，接种到培养基上。接种时动作尽量要快，应使形态学上端向上，防止倒置。把培养材料放进70％的酒精中浸泡约30s，再在0.1％的升汞中浸泡5～10min，或在10％的漂白粉上清液中浸泡10～15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗3~5次。
 11．用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶口。
 12．取下接种器械，在火焰上灭菌。
  13．把培养材料放人培养瓶，盖上瓶口(每人接种5—10瓶)。操作期间应经常用70％酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌。
14．接种结束后，清理和关闭超净工作台。

附录: 植物组织培养中常用的消毒剂
消毒剂名称
使用浓度（%）
消毒难易
灭菌时间（min）
消毒效果
乙醇
70～75
易
0.1～3
好
氯化汞
0.1～0.2
较难
2～15
最好
漂白粉
饱和溶液
易
5～30
很好
次氯酸钙
9～10
易
5～30
很好
次氯酸钠
2
易
5～30
很好
过氧化氢
10～12
最易
5～15
好

如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，且生长正常，即可以认为消毒时间适宜。

五、思考题
1、接种1周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因。
2、接种4~6周后，观察并记录愈伤组织或者丛生芽的诱导率。
3、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌和霉菌对接种工具与接种材料的污染？