蛋白提取步骤.doc

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提蛋白及WB的步骤
整个过程细胞或蛋白都必须放冰上
准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、
当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记1.5ml 离心管及0.6ml离心管、细胞刮板、开低温高速离心机
细胞裂解液配制：
1ml cell lysis
10ul NP-40（离心机后）
25ul 焦磷酸钠
40ul NaF
1ul β-甘油磷酸
2 ul Na3VO4
1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱）
10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒）
细胞裂解和收集
1. 观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。
2. 将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加0.1ml ），冰上静置1-2min。
3. 刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。
细胞破碎
4. 超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不要碰到离心管的壁和底部）
超声波设置：
工作功率5% 工作时间3min
开机时间15s，关机时间30s
温度0度，
报警温度1度
5. 4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，）
蛋白保存
6. 蛋白保存及分装：吸上清液至0.6ml离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。
注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度
1、 测空白板，选差异较小的孔。
BCA测定法波长 570，Bracford：595
2、 标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至0.5mg/ul。
取5ul标准蛋白+45ul PBS
3、 加样：
浓度
0
0.1
0.2
0.3
0.4
BSA（ul）
0
4
8
12
16
PBS（ul）
20
16
12
8
4
4、 样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS
5、 配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量，一般防止损耗，多算一个样。
6、 加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果）
7、 计时30min
8、 配分离胶，灌胶，加水封。
9、 计时20min。
10、 测蛋白：先振板、再设置参数。
11、 计算上样体积:
12、 配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。
13、 打开干式加热器
10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul)
标记0.6ml离心管
加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致）
11、计时10min ，变性10min。
12、安装电泳槽:
电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次）
液面刚覆盖胶，不能有气泡。
13、上样：maker 上样量为3ul。 依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去
14、电泳
分离胶 100V，20min左右、条带都跑开即可。
浓缩胶 145V 1h 有 等紫色部分跑到底结束。
转膜
准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜
PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。
用海绵和滤纸之前先浸湿。
转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。
三层滤纸和膜都需要赶气泡。
安装转移槽：加转子、冰盒，安装时夹子面朝上
15、转膜 电压100V 90min。（视蛋白大小而定，蛋白分子小的可适当缩短时间）
16、取膜晾干、剪个角作为标记，保鲜膜保存4℃。
孵育抗体
1、 膜的活化：把膜晾干，甲醛浸泡（回收）膜数秒、无菌水洗3次、TBST洗2次。
2、 封闭：配封闭液：3 % 的牛奶：4ml TBST+ 0.12g 脱脂奶粉，混匀、涡旋。
3、 4℃ 封闭一小时、盖盖子。
4、 TBST 洗三次、每次10 min 。（封闭液与一抗相同则不用洗）
5、 一抗孵育：加一抗，1:1000（比例视情况定）、密封孵育、盖盖子。
6、 4℃ 过夜孵育。
7、 回收一抗(回收到对应的离心管，立即放回4℃冰箱)
8、 TBST洗三次、每次10 min。
9、 二抗孵育：加二抗，室温孵育1h。
10. 回收二抗，TBST洗3次，每次10 min(最后一次不要倒掉)（可以准备洗膜用的东西：检查显影液是否能用）
显影
11.准备显影的东西：显影液、镊子、剪刀、光片、保鲜膜、计时器、
配发光液：A:B 1:1、放小黑屋里 。剪好保鲜膜、铺在板上，做好准备。
12. 最后一次TBST洗完后，拿到小黑屋，关门、开红灯。
13.先剪X光片、右上角做个记号（位置看个人习惯），
14.将膜上的液体吸干（卫生纸上稍微吸干），放板上，定一个3min 计时器，加上发光液，开始计时。观察发光现象，当看到发光时，压片。
15. 压片：将膜反扣在保鲜膜上，不能产生气泡。每次压片都记时，先从2min开始。
15． 压片结束后，放在显影液里，轻轻摇晃至看到条带，用镊子夹至水中浸泡，清洗数秒，再放置定影液内。
16.等膜洗完后，拿至外间，用自来水清洗光片，晾干。
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