镍柱蛋白纯化.doc

. 镍柱蛋白纯化一、原理镍柱里面含有琼脂糖微球体，在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与Ni2+发生螯合，螯合后的Ni2+能与HIS上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离。影响蛋白质/多肽与金属离子鳌合力大小的因素主要是蛋白质表面可结合的氨基酸（种类、数目和分布）、金属离子的种类和密度、层析条件（pH、盐的种类和浓度、添加剂等）二、缓冲液的配制(500ml PH=7.4)Binding buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 20mM咪唑 1.8g （550mM）Washing buffer: PB 50 mM Nacl 14.625g 5mM 0.45g 10 mM 0.9g 15 mM 1.35g 20 mM 1.8g 40Mm 3.6gElution buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 100 mM 9g 200mM 18g400mM咪唑 45g 600mM咪唑 63g三、操作步骤 此步骤过镍柱的所有溶液、上清蛋白都要先用滤膜过滤，所有液体过镍柱的速度要严格控制2.5ml /min，中间镍柱不能进气泡1、5倍镍柱体积去离子水洗涤，去除空气和20%乙醇 (5ml /min)2、510倍镍柱体积Binding buffer平衡3、上蛋白样品4、5倍镍柱体积Wsahing buffer 洗脱杂蛋白(HIS标签含有6个组氨酸，结合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白)，此步骤设洗脱梯度5、5倍镍柱体积Elution buffer洗脱目的蛋白，此步骤设洗脱梯度6、5倍体积去离子水清洗掉缓冲液7、20%乙醇保存于 4注意：洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来四、镍柱重生（介质使用约3-20次，具体与原料来源、样品体积等有关）1. 镍柱用去离子水清洗2. 5倍镍柱体积EDTA 重生镍柱(20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA，pH 7.4)3. 5倍体积 Binding buffer 平衡4. 5倍体积去离子水清洗5. 20倍体积 1M NaoH 洗涤6. 水洗至中性7. 5倍柱体积挂镍8. 用5倍体积以上的纯水清洗层析柱，去除游离的金属离子9. 20% 乙醇保存 4五、注意事项1、推荐在中性至弱碱性的条件下（PH 78）结合重组蛋白，磷酸盐Buffer是常用的缓冲液，Tric-cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度2、避免在Buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂3、若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有Buffer中添加6M盐酸胍或8M尿素4、避免缓冲液中有高浓度的供电子基团，如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris5、各种Buffer中不能含有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价NI被还原6、不能含有离子型的去垢剂，比如SDS,防止Ni流失7、Buffer里可加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度可高达50%8、Buffer中Nacl浓度应在300 Mm 2M之间9、可加入非离子型去垢剂2 / 2