基于转录组测序分析枸杞多糖...抑制雏鸡脾脏基因表达的影响_王建东.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 704基于转录组测序分析枸杞多糖对免疫抑制雏鸡脾脏基因表达的影响王建东1，唐玉林2，王敏3，张宝锁4，杨富强4，高海慧1，于洋1，郭延生2*（1宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川750002；2宁夏大学农学院，宁夏银川750021；3宁夏银川市妇幼保健院，宁夏银川750001；4宁夏顺宝现代农业股份有限公司，宁夏吴忠751600）摘要：【目的】利用转录组测序技术分析枸杞多糖（LBP）对免疫抑制雏鸡脾脏基因表达的影响，挖掘LBP修复雏鸡免疫抑制的靶基因，为探究枸杞多糖对雏鸡免疫抑制的修复机制提供理论依据。【方法】将120羽7日龄海兰褐蛋鸡随机分成空白组（NC）、环磷酰胺（CTX）组（CY）和LBP组（CYLbGp），NC组肌注生理盐水，其余2组连续3 d肌注80 mg/（kgd）CTX造模，造模后通过测定血清中IL-2、IL-6和INF-含量对免疫抑制雏鸡模型进行验证。造模成功后在CYLbGp组饮水中加入5 mg/（kgd）LBP，给药结束后采集脾脏进行转录组测序，以P0.05和|log2Fold change|1为条件筛选出差异表达基因（DEGs），并进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析，以探究枸杞多糖对免疫抑制的修复作用。【结果】共获得1049301886个Raw reads，对其进行质控、过滤后，共获得1032097278个Clean reads。CY组和NC组之间共有701个DEGs，CYLbGp组和CY组之间共有748个DEGs。GO功能注释显示，LBP干预后显著回调的DEGs主要与结合、细胞过程、生物调节及细胞组分等功能相关。KEGG信号通路富集结果显示，LBP干预后显著回调的DEGs主要与神经活性配体-受体相互作用和视黄醇代谢通路相关，筛选出所富集的通路中关键的DEGs为人毒蕈碱型胆碱受体M5基因（CHRM5）、烟碱型乙酰胆碱受体4基因（CHRNB4）、代谢型型谷氨酸受体1基因（GRM1）、胆囊收缩素基因（CCK）、神经肽Y1受体基因（NPY1R）、细胞色素P450家族成员2C18基因（CYP2C18）、血管紧张素受体1基因（AGTR1）、细胞色素P450家族成员3A5基因（CYP3A5）、丝氨酸蛋白酶2（PRSS2）和神经紧张素基因（NTS）。RT-qPCR结果与转录组学数据变化趋势基本一致，表明转录组数据有较高的可靠性。【结论】LBP修复雏鸡免疫抑制的作用机制可能与调节神经活性配体-受体相互作用和视黄醇代谢通路有关，其中CHRM5、CHRNB4、GRM1、CCK、NPY1R、CYP2C18、AGTR1、CYP3A5、PRSS2和NTS可作为LBP修复雏鸡免疫抑制的靶基因。关键词：枸杞多糖；雏鸡；环磷酰胺；转录组学中图分类号：S858.3；S852.4文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）03-0704-11收稿日期：2022-11-27基金项目：宁夏自然科学重点基金项目（2020AAC02032）通讯作者：郭延生（1978-），https:/orcid.org/0000-0002-9882-0706，副教授，主要从事中兽药临床应用研究工作，E-mail：guoyan-第一作者：王建东（1980-），https:/orcid.org/0000-0002-9207-5100，副研究员，主要从事动物疾病防治研究工作，E-mail：jiandong-南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（3）：704-714ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.006Effects of Lycium barbarum polysaccharide on genes expressionin spleen of immunosuppressed chicks based on transcriptomesequencingWANG Jian-dong1，TANG Yu-lin2，WANG Min3，ZHANG Bao-suo4，YANG Fu-qiang4，GAO Hai-hui1，YU Yang1，GUO Yan-sheng2*（1Institute ofAnimal Science，NingxiaAcademy ofAgriculture and Forestry Sciences，Yinchuan，Ningxia 750002，China；2College ofAgriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750021，China；3Maternal and Child Health Care Hospi-tal of Ningxia，Yinchuan，Ningxia 750001，China；4Ningxia Shunbao ModernAgriculture Co.，Ltd.，Wuzhong，Ningxia 751600，China）Abstract：【Objective】This paper analyzed the effects of Lycium barbarum polysaccharide（LBP）on the gene expres-sion of spleen of immunosuppressed chicks via transcriptome sequencing，and explored the target genes of repair mecha-3期7050引言【研究意义】免疫抑制是由于动物机体的免疫器官、组织和细胞在疾病、饲料霉菌毒素、药物、营养失衡和应激等一种或多种不良因素作用下出现暂时性或永久性免疫应答功能不全的状态。当机体处于免疫抑制的状态时，外界病原微生物更易入侵机体，且疫苗接种的效果也会降低，从而增加鸡群继发感染和免疫缺陷的发生，这在很大程度上影响了鸡群的健康生长（史若男等，2014）。近年来，随着养鸡业的发展不断趋于集约化和规模化，鸡群出现免疫抑制的情况也越来越多，严重制约了养鸡业的发展。在当前饲料禁抗的背景下，寻找到一种低残留、无毒副作用的中草药提取物调节鸡群的免疫状态，已成为当前兽医从业人员的研究热点。枸杞（Lycium bar-barum）在我国已有2500多年的食、药用历史，是一种药食同源中药在传统中药学中其具有滋肝补肾、益精明目之功效（王莎莎等，2018）。现代大量药理研究表明，枸杞具有很强的免疫调节活性，而枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是其发挥增强免疫力功效的主要活性成分之一（葛影影等，2021；王亚妮等，2022）。经证实，LBP具有抗氧化应激（Yao et al.，2018）、抑菌消炎（Gan et al.，2018）、保护神经（Gao et al.，2018）、降血糖血脂（Masci et al.，2018）、增强免疫（Zhou et al.，2020）等功能。因此，基于转录组学技术研究枸杞多糖对免疫抑制雏鸡脾脏的基因表达的影响，对枸杞多糖对雏鸡免疫抑制的修复机制具有重要的研究意义。【前人研究进展】目前大量研究表明，植物多糖可通过多种方式和多个水平调节免疫系统。Su等（2014）研究发现，LBP可通过诱导Tfh细胞的产生，进而调节B淋巴细胞成熟和体液免疫功能。Zhao等（2017）研究表明，桔梗多糖可显著促进淋巴细胞增殖，提高CD4+和CD8+T细胞水平，进而提高机体免疫功能。孙晓雨等（2015）研究发现，LBP能显著改善环磷酰胺免疫抑制小鼠脾脏T和B淋巴细胞亚群比例。体外培养树突状细胞时添加LBP可上调细胞表面CD80、CD86和MHC II类分子表达水平（董晓筱，2020；陈艳平等，2021）。王思月（2019）研究表明，LBP能显著改善肉鸡肠道菌群结构，提高血液中IgA和IgG水平，并增加IL-2和IL-6基因的表达水平，从而达到增强免疫的作用。崔小珍等（2020）研究发现，添加不同浓度的松针多糖后，提高体外培养的鸡巨噬细胞HD11活力和一氧化氮（NO）分泌量的水平，进而促进巨噬细胞的吞噬能力。Fan等（2020）使用脂多糖构建黄羽肉鸡免疫应激模型后，再通过饲喂添加蘑菇多糖的日粮，蘑菇多糖可显著降低血浆细胞因子INF-和TNF-水平，提高免疫球蛋白IgG和IgM水平，进而增强黄羽肉鸡的免疫能力。Long等（2020）研究发现，在肉鸡日粮中添加LBP能显著提高生长性能，增强机体抗氧化应激能力，并增加血清中IgG、IgA、IL-4、IL-6、TNF-和IFN-水平。上述研究表明，植物多糖不仅nism of LBP on immunosuppression of chicks.【Method】A total of 120 7-day-old Hy-Line brown laying hens were ran-domly divided into negative control group（NC），cyclophosphamide（CTX）group（CY）and LBP group（CYLbGp）.TheNC group was intramuscularly injected with normal saline，while the other two groups were intramuscularly injected with80 mg/（kgd）CTX for 3 consecutive days for modeling.After modeling，the immunosuppressed chick model was veri-fied by measuring the levels of IL-2，IL-6 and INF-in serum.After successful modeling，the CYLbGp group drinkingwater was added 5 mg/（kgd）LBP，after the administration of CYLbGp group，spleen was collected to be used fortranscriptome sequencing，diferentially expressed genes（DEGs）ofP90%），连续30 d。在CYLbGp组给药结束后第1 d，3个组均随机选取6只鸡，取脾脏于冻存管中，-80 超低温冰箱保存。1.2免疫抑制模型验证造模结束后，从NC组、CY组和CYLbGp组中各随机挑选出5只雏鸡进行心脏采血，收集血清后使用ELISA法测定血清中IL-2、IL-6和IFN-水平（IL-2、IL-6和IFN-检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司），通过检测血清中细胞因子水平，验证免疫抑制模型雏鸡是否建立成功。采用SPSS 22.0单因素方差分析中最小显著差异（LSD）法处理试验数据，用平均值标准差表示，并进行差异显著性分析。1.3转录组测序采用TRIzol试剂法从雏鸡脾脏组织样品中提取总RNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计对所提取的总RNA浓度和纯度进行检测，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，再使用Agilent 2100生物分析仪测定RNA完整值（RIN）。利用带有Oligo（dT）的磁珠与ploy（A）进行A-T碱基配对，从总RNA中分离出mRNA，用于分析转录组信息，再加入Fragmen-tation Buffer，将mRNA随机断裂，通过磁珠筛选分离出300 bp左右的小片段。加入六碱基随机引物（Ran-dom hexamers），在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板反转录合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构，从而完成整个cDNA文库的制备，并在Illumina NovaSeq 6000平台进行测序（PE文库，读长2150 bp）。测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。1.4测序质量评估及序列比对测序完成后所获得的原始测序数据（Raw reads），使用SeqPrep、Sickle等在线平台修剪、剔除原始数据中的问题片段，得到高质量测序数据（Clean reads），再对其进行质量评估，计算Q20、Q30和GC含量，同时选择对应的测序碱基平均错误发现率（FDR）小于0.1%的片段用于后续的转录组分析。将Clean reads与参考基因组进行比对，比对到指定的参考基因组上reads（Mapped reads）才可用于后续分析，同时对本次测序的比对结果进行质量评估，并使用TopHat2进行序列比对分析。1.5转录组分析获得基因的Read counts数后，利用DESeq2筛选出各组样本间差异表达基因（Differentially expressedgenes，DEGs），筛选条件为|log2Fold Change|1且P0.05。将经过筛选获得的DEGs集导入RSEM中进行聚类分析，参数设置：基因和样本聚类算法选用层级聚类，基因聚类方式为complete，样本聚类方式则为single，距离算法均采用euclidean。利用Blast2go 2.5和KOBAS分别对基因集进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析，筛选GO条目中富集较多的功能及Padj0.05的KEGG信号通路，再根据|log2Fold Change|2.5的标准筛选信号通路中的关键基因。1.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测从DEGs中随机挑选5个DEGs即CD83、CCL4、PSPH、LPIN2和ULK2，采用qRT-PCR验证转录组测序结果的准确性。以-actin作为内参基因。所用引物经由由上海美吉生物医药科技有限公司合成，见表1。qRT-PCR反应体系20.0 L：2ChamQ SYBRColor qPCR Master Mix 10.0 L，5 mol/L上、下游游引物各0.8 L，50ROX Reference Dye 10.4 L，2.5 g/L cDNA 2.0 L，ddH2O补充至20.0 L。扩增程序：95 预变性5 min；95 5 s，55 30 s，72 40 s，进行40个循环；72 延伸5 min，采用2-Ct法计算基因的相对表达量。2结果与分析2.1免疫抑制雏鸡模型验证结果由表2可知，CY组和CYLbGp组的雏鸡血清中3期707细胞因子IL-2、IL-6和IFN-含量较NC组显著降低（P0.05），表明免疫抑制雏鸡模型成功建立。2.2测序数据质量评估与序列比对由表3可知，对3组脾脏样本进行转录组测序后，共获得1049301886条Raw reads，对其进行质控、过滤，共获得1032097278条Clean reads。其中，NC组、CY组和CYLbGp组分别获得357135798、324728438和350233042条Clean reads。在获得的Clean reads中，所有样品的唯一比对率均在83.76%以上。测序所得数据的FDR最大值为0.0263%（0.1%），各样本Q20和Q30的最小含量分别为97.39%和93.05%，且GC含量为50.16%52.40%。这些数据均表明本研究转录组测序数据质量较高、结果可靠，可用于后续分析。2.3DEGs筛选及聚类分析筛选出3个处理组间的DEGs如图1所示。CY组和NC组间有701个DEGs表达差异显著，其中，CY组相较于NC组有416个DEGs显著上调表达，285个DEGs显著下调表达（图1-A）。CYLbGp组和CY组间有748个DEGs表达差异显著，其中，CYLbGp组相较于CY组有276个DEGs显著上调表达，472个DEGs显著下调表达（图1-B）。将上述中所筛选出的DEGs进行聚类分析，结果（图2）发现，NC、CY和CYLbGp明显聚集成3大类，说明筛选出的DEGs能很好地将3组区分开来，从而反映3组之间脾脏基因表达存在差异性。2.4GO功能注释结果筛选出CY组和NC组的DEGs中，在给予LBP干预后显著回调的DEGs共368个，并对这些基因进行GO功能注释分析，并对排名前20的功能条目进行分组别GroupNCCYCYLbGpIL-2含量（ng/L）IL-2 content48.686.21a41.235.52b42.566.86bIL-6含量（ng/L）IL-6 content21.243.23a16.871.48b15.293.67bIFN-含量（pg/mL）IFN-content40.266.52a34.974.93b35.383.49b基因 GeneCD83CCL4PSPHLPIN2ULK2-actin引物序列 Primer sequenceF：5-CCTCTGCTCTTCACCCTG-3R：5-GCTATTCTGTCGCCAACT-3F：5-TTGTTCTCGCTCTTCTCA-3R：5-GTGCTGTAGTGCCTCTGG-3F：5-CGCAGTGTGCTTTGATGT-3R：5-GTCCTAGTCGTGCCGTTA-3F：5-CAAGCGAAGTCATCACCA-3R：5-TCCACTATCAGCAGCAGC-3F：5-CAGCGAAACAGCACCTAT-3R：5-GAGTGTCTCACAACCCCA-3F：5-GTGATGAAGCCCAGAGCA-3R：5-CGACCAGAGGCATACAGG-3样品SampleNC1NC2NC3NC4NC5NC6CY1CY2CY3CY4CY5CY6CYLbGp1CYLbGp2CYLbGp3CYLbGp4CYLbGp5CYLbGp6总计 TotalRaw reads（条）6205305456130338632231805762982261297798627246866230445058281482538269205803246649910928479069245794636857794892576604405894328058889860647449981049301886Clean reads（条）6098287855180082622354725670050860308048617288106107722257352120528661245713389449115194471838845707101256859850566907125790576857993996637117041032097278错误率（%）Error rate0.02590.02610.02570.02590.02590.02580.02630.02580.02600.02570.02610.02580.02570.02610.02600.02610.02540.0258-Q20（%）97.5597.4897.6397.5897.5897.5997.3997.6097.5097.6697.5097.6197.6497.5097.5297.4897.7697.60-Q30（%）93.4493.2393.5793.4493.4593.4893.0593.4893.2993.6293.2193.5093.5893.2393.3393.2493.9093.51-GC含量（%）GC content52.1951.3751.9150.1651.1150.7152.4051.6051.1850.5150.1950.4851.2751.0451.7051.0851.5650.58-Uniquely mapped reads（条）51894676474276815302881849666579515617525385255751157245491702394532720749950 9974306463840957444488873414956460148789277503998335039827755359281890458443唯一比对率（%）Uniquely mapped rate85.1085.9585.2187.5985.5087.2483.7685.7385.7487.4387.6886.8085.6687.1786.0687.0486.9086.89-表 3测序数据质量处理及序列比对Table 3Sequencing data quality processing and sequence comparisonQ20和Q30分别指测序质量在99.0%和99.9%以上的碱基占总碱基的百分比；GC含量：质控数据对应的G和C碱基总和占总碱基的百分比；唯一比对率：在参考序列上有唯一比对位置的Clean reads数目Q20 and Q30 referred to the percentage of bases with sequencing quality above 99.0%and 99.9%in the total base respectively；GC content：The per-centage of the total G and C bases corresponding to the quality control data in the total base；Unique mapped reads：The number of Clean reads withunique alignment positions on the reference sequence表 1qRT-PCR引物序列Table 1qRT-PCR primer sequence表 23组雏鸡血清细胞因子IL-2、IL-6和IFN-含量比较Table 2Contents of cytokines IL-2，IL-6 and IFN-in chickserum of three groups不同小写字母表示差异显著（P0.05）Different lowercase letters represented significant difference（P0.05）王建东等：基于转录组测序分析枸杞多糖对免疫抑制雏鸡脾脏基因表达的影响54卷南 方 农 业 学 报 708析，结果如图3所示。这些DEGs主要涉及的分子功能包括结合、催化活性、转运活性及分子传感器活性；主要涉及的生物过程包括细胞过程、生物调节、代谢过程、刺激反应、发育过程、本土化、多细胞生物过程及细胞成分组织或生物发生；主要涉及的细胞组分包括细胞部分、膜、膜部分、细胞器、细胞器部分、含蛋白质复合物、膜外区部分和胞外区部分。2.5KEGG信号通路富集分析结果将所筛选出的368个显著回调DEGs集映射到KEGG信号通路数据库中进行富集分析，如图4所示。这些DEGs显著富集在神经活性配体受体相互作用和视黄醇代谢通路上（Padj0.05）。2.6富集通路中相关DEGs分析结果图5的右边显示的是出现回调的DEGs显著富集的通路，图5的左边为所富集到的DEGs，按log2FoldChange从大到小的顺序进行排列，结果发现，共有44个DEGs被富集到这2条通路上，分别是神经活性配体受体相互作用和视黄醇代谢。将这些DEGs映射到神经活性配体受体相互作用通路和视黄醇代谢通路上（图6和图7）。再根据|log2Fold Change|2.5的标准，筛选出所富集的通路中关键的DEGs为人毒蕈碱型胆碱受体M5基因（CHRM5）、烟碱型乙酰胆碱图 1DEGs火山图Fig.1DEGs volcano map图 2DEGs聚类分析结果Fig.2Cluster analysis of DEGsNC vs CYlog2Fold Change-lg P876543210-12-10-8-6-4-20246810SignificantUp（416）No sig.（18863）Down（285）log2Fold Change-lg PSignificantUp（276）No sig.（18761）Down（472）CY vs CYLbGpAB11109876543210-8-6-4-202468CY5CY2CY1CY3CY4CY6LbGp6LbGp5LbGp4LbGp3LbGp1LbGp2NC4NC5NC1NC6NC2NC3420-2-43期709050100150200250300350400DEGs数量 Number of DEGsMolecular transducer activityTransporter activityCatalytic activityBindingCellular component organization or biogenesisMulticellular organismal processLocalizationDevelopmental processResponse to stimulusMetabolic processBiological regulationCellular processExtracellular regionExtracellular region partProtein-containing complexOrganelle partOrganclleMembrane partMembraneCell partCellular componentBiological processMolecular function受体4基因（CHRNB4）、代谢型型谷氨酸受体1基因（GRM1）、胆囊收缩素基因（CCK）、神经肽Y1受体基因（NPY1R）、细 胞 色 素 P450 家 族 成 员 2C18 基 因（CYP2C18）、血管紧张素受体1基因（AGTR1）、细胞色素P450家族成员3A5基因（CYP3A5）、丝氨酸蛋白酶2（PRSS2）和神经紧张素基因（NTS）。2.7qRT-PCR验证结果qRT-PCR验证结果（图8-A）显示，CY组CD83和CCL4基因的相对表达量较NC组极显著降低（P0.01，下同），CYLbGp组CD83基因的相对表达量较CY组极显著升高，CCL4基因相对表达量也较CY组有明显升高，说明LBP干预可诱导CD83基因上调表达；CY组PSPH、LPIN2和ULK2基因相对表达量较NC组极显著升高，CYLbGp组PSPH、LPIN2和ULK2基因相对表达量较CY组极显著降低，说明LBP干预抑制这3个基因的表达。该结果与转录组测序（图8-B）图 3LBP干预后表达显著回调DEGs 的GO功能注释分析结果Fig.3GO functional annotation analysis of significantly down-regulated DEGs after LBP intervention图 4LBP干预后显著回调DEGs的KEGG信号通路富集分析结果Fig.4KEGG signal pathway enrichment analysis of significantly down-regulated DEGs after LBP intervention05101520253035DEGs数量 Number of DEGs0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5Ncuroactive ligand-receptor interactioRctinol mctabolismDrug metabolism-cytochrome P450Tryptophan metabolismProtein digestion and absorptionAlanine，aspartate and glutamate metabolismPentose and glucuronate intercnversionsSphingolipid metabolismChemical carcinogenesisSteroid homone biosynthesisVitamin B6 metabolismNitrogen metabolismArginine biosynthesisViral protein interaction with cytokine and cytokine receptorCortisol synthesis and secretion-lg P-lg PNumberKEGG信号通路 KEGG pathwayGO功能条目 GO term王建东等：基于转录组测序分析枸杞多糖对免疫抑制雏鸡脾脏基因表达的影响54卷南 方 农 业 学 报 710图 5LBP干预后显著回调DEGs的KEGG信号通路富集弦图Fig.5String diagram of KEGG signal pathway enrichment analysis of significantly down-regulated DEGs after LBP intervention图 6DEGs参与的神经活性配体-受体相互作用通路图Fig.6Diagram of neuroactive ligand-receptor interaction pathway with DEGs involvement红色边框的节点代表DEGs，黄色底色框代表整个通路所参与的已知基因，黄色绿色表示已知新基因。图7同Red border nodes represented DEGs，yellow background border represented known genes involved in the entire pathway，and yellow+green represent-ed known new genes.The same was applied in Fig.7KEGG pathwaylog2Fold Change-6-4-2 0 2 4 6Neuroactive ligand-receptorRetinol metabolism3期711变化趋势基本一致（图8），表明转录组数据有较高的可靠性。3讨论CTX是一种烷化剂类药物，因其良好的免疫抑制效果，常被用于免疫抑制模型的建立（Yao et al，2018）。研究表明，CTX通过抑制机体免疫器官的发育、降低免疫细胞数量和减少免疫相关细胞因子产生达到免疫抑制的效果（Yu et al，2014），而LBP可通过调节各种免疫细胞活化、分化及促进免疫分子的分泌达到免疫增强的作用（Chen et al，2008）。本研究结果显示，CY组和CYLbGp组的雏鸡血清中细胞因子IL-2、IL-6和IFN-含量较NC组均显著降低，结果表明免疫抑制雏鸡模型成功建立图 7DEGs参与的视黄醇代谢通路图Fig.7Diagram of retinol metabolism pathway with DEGs involvement图 85个DEGs的qRT-PCR检测结果（A）与转录组测序分析结果（B）Fig.8qRT-PCR detection（A）and transcriptome sequencing analysis results（B）of 5 DEGs*分别表示与NC组差异极显著（P0.01）；#分别表示与CY组差异极显著（P0.01）*indicated extremely significant difference with NC group（P0.01）；#indicated extremely significant difference with CY group（P0.01）CD83CCL4PSPHLPIN2ULK2基因 Gene相对表达量Relative expression1.51.00.50.0NCCYCYLbGp*ACD83CCL4PSPHLPIN2ULK2基因 Gene相对表达量Relative expression4.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0*NCCYCYLbGpB*王建东等：基于转录组测序分析枸杞多糖对免疫抑制雏鸡脾脏基因表达的影响54卷南 方 农 业 学 报 712神经活性配体-受体相互作用通路与信号转导密切相关，涉及细胞质膜上与信号转导相关的配体和受体蛋白（Authier et al.，2009）。研究表明，神经紧张素（NTS）具有显著降压效果，也可通过脑肠轴调节胃肠道蠕动、分泌及免疫功能（Jariel andLeinninger，2021），胆囊收缩素（CCK）作为递质参与多种中枢神经系统的功能，如抑制采食、焦虑、镇痛、调节胰岛素分泌、血压、记忆等功能（Lee and Soltesz，2011）。此外，NTS和CCK升高会刺激摄食中枢产生饱感，导致食欲减退（Torruella-Surez and McEllifott，2020；Zeng et al.，2020）。本研究使用CTX造模后，免疫抑制雏鸡出现采食量下降现象，可能与此有关。CTX也被用于脾虚证模型的建立（费文婷等，2018），而脾虚证动物模型体内组织和血浆中NTS和CCK含量均显著上升（钱泽南等，2010），也与本研究结果相符。在本研究中NTS和CCK基因表达在LBP处理后出现显著下降，提示枸杞多糖有助于提高雏鸡采食量，改善神经内分泌免疫调节，进而影响机体免疫调节功能。支配脾脏的神经主要是去甲肾上腺素能传出神经纤维和胆碱能神经纤维构成的腹腔交感神经节后纤维，由脾门伴随脾动脉进入脾脏，脾交感神经对脾脏的形态学和免疫功能调节起到至关重要的作用。Roagusch等（1995）通过使用低剂量脂多糖刺激大鼠，结果发现产生的IL-1可抑制脾交感神经兴奋所引起的血管收缩效应，增加脾脏灌注血流量，进而影响免疫细胞的再循环、运输和归巢，提高免疫功能。柯妍妍等（2012）研究发现，通过腹腔注射六羟多巴胺（6-OHDA）阻断小鼠交感神经后，小鼠脾脏重量较对照组出现显著降低，动脉周围淋巴鞘的面积和脾小体直径较对照组也出现显著下降，且体外增殖试验结果显示，脾淋巴细胞增殖率降低。此外，研究表明，血管紧张素和神经肽Y均可引起全身小动脉收缩，并且能引起大鼠脾交感神经兴奋，从而调节脾脏免疫功能（Ganta et al.，2005；徐中山，2015）。本研究中，胆碱能受体基因（CHRM5和CHRNB4）、AGTR1和NPY1R基因的相对表达量在使用枸杞多糖干预后降低，表明LBP可抑制CTX所致的脾交感神经兴奋，增强免疫细胞活性，进而提高免疫抑制雏鸡免疫功能。PRSS2是一种丝氨酸蛋白酶，广泛存在于外周组织器官中，在除胰腺外的所有组织中，脾脏的PRSS2基因表达水平最高（Koshika-wa et al.，1998），过度表达则会促进机体炎症发生（曾琼，2000）。据此推测，脾脏中PRSS2可能参与机体免疫调节，并在促进炎症发生过程中起一定作用。视黄醇代谢通路中视黄醇及其代谢物可调节细胞增殖、分化和凋亡，视觉循环和炎症过程（王亚莉和耿越，2019）。CYP2C18和CYP3A5均为细胞色素P450超家族成员，在机体药物代谢过程中也发挥非常重要的作用（刘文波等，2016）。CTX是一种无活性的前药，必须在体内经过肝脏中CYP450代谢活化才能产生细胞毒性，起到抗肿瘤和免疫抑制的作用，而其中大部分CTX由CYP2B6、CYP2C9和CYP3A5等代谢活化（陈玲燕等，2014）。本研究中LBP干预后视黄醇代谢通路中的DEGs（CYP2C18和CYP3A5）表达均显著下调，提示LBP有助于降低视黄醇代谢和抑制环磷酰胺活化，进而发挥调节免疫的作用。此外，前人研究表明枸杞具有明目的功效（苏国辉和米雪松，2015），可能也与LBP参与视黄醇代谢通路调节有关。4结论LBP修复雏鸡免疫抑制的作用机制可能与调节神经活性配体-受体相互作用和视黄醇代谢通路有关，其中CHRM5、CHRNB4、GRM1、CCK、NPY1R、CYP2C18、AGTR1、CYP3A5、PRSS2 和