猫传染性腹膜炎诊断方法研究进展_许晓琳.pdf

2023(15):36-41专论与综述 收稿日期:2022-11-26;修回日期:2023-07-31基金项目:国家市场监督管理总局专项(2013810)作者简介:许晓琳(1992),女,助理研究员,博士,研究方向为动物疫病检测技术,1767858105 .通信作者:吴绍强(1970),男,研究员,博士,研究方向为外来动物疫病,sqwu .DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2022.11.0262 猫传染性腹膜炎诊断方法研究进展 许晓琳,王慧煜,袁向芬,孔玉方,吴绍强(中国检验检疫科学研究院 动物检验与检疫研究所,北京 100176)中图分类号:S829.3;S852.65+9.6文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2023)15-0036-06摘 要:猫传染性腹膜炎(feline infectious peritonitis,FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起的全身性、致死性疾病。近年来,FIP 在世界各地广泛流行,感染率呈上升趋势。文章对 FIP 的诊断方法进行了全面总结,以期为 FIP 的临床和实验室诊断提供参考和指导。关键词:猫传染性腹膜炎;猫冠状病毒;积液;诊断;免疫组织化学;基因突变 猫冠状病毒(feline Coronavirus,FCoV)感染在猫中很常见,大约40%的家猫感染了 FCoV,在多猫家庭中 FCoV 感染率可高达 90%1。根据 FCoV 的致病性可分为猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。在大多数情况下,FECV 在猫聚集环境中高度流行且具有较高传染性,健康猫通过接触其他已感染 FECV 的猫排出的粪便而被感染,感染后大多无症状或仅引起轻度和短暂的腹泻等胃肠道临床症状2。相比之下,FIPV 不通过粪口途径传染,而是由 FECV 突变引起的,即 FIPV 是 FECV 的高毒力突变株,获得了在巨噬细胞内复制的能力,可以摆脱肠道的限制,发展到其他组织器官,导致猫传染性腹膜炎(feline infectious peritonitis,FIP)的发生。FIP 是猫的一种全身性、致死性疾病,发生在世界各地的家养和野生猫科动物中,最常发生于两岁以下的幼猫,发病初期不具有特征性症状,病猫表现为食欲不振、嗜睡、体重减轻、发热、步态异常或精神状态异常等。根据不同临床表现形式,FIP 可分为湿性、干性和混合性三个类型:湿性 FIP 主要表现为胸腔或腹腔积液;干性 FIP 主要表现为腹腔脏器组织形成肉芽肿及眼部病变和神经症状;而上述症状同时出现时,为混合性 FIP1,3。目前,我国尚无商品化的 FIP 诊断试剂,严重影响了 FIP 的有效防治。本文综述了关于 FIP 检测方法的相关研究进展,归纳了目前常见的 FIP 诊断方法与检测手段,并讨论了多种检测方法检测不同样本的灵敏度、特异性及差异性,分析不同情况下不同检测方法的优势与局限性,以期为临床上选择合适的检测方法,快速诊断 FIP 提供借鉴。1 FIP 的临床诊断1.1 血液指标异常 猫患 FIP 后,其血常规异常,主要表现为贫血、微细胞和带状中性粒细胞数量增多、淋巴细胞和血小板数量减少。其中,微细胞和带状中性粒细胞数量增多是 FIP 的共同特征,在大约50%FIP 患猫中可观察到淋巴细胞减少症,此症状在有积液的患猫中更常见。绝大多数 FIP 患猫的血清生化指标异常,即表现为高蛋白血症,尤其是高球蛋白血症,约 89%的 FIP 患猫表现为该症状3。这些血液异常变化在 FIP 患猫中以不同的组合发生,但它们不是 FIP 的特异性变化,这些症状也可能发生在患有各种炎症基础疾病的猫身上4-5。H.Y.Tsai 等6认为,根据血液异常的特点检测白蛋白与球蛋白的比值(A G)可以用于诊断FIP,当比值0.8 时患 FIP 的可能性较小。U.Jeffery 等7认为,AG0.6 可排除 FIP。通常 FIP 急性期的患猫体内蛋白质浓度显著增加,如血清中的-1-酸性糖蛋白(AGP)、血清淀粉样蛋白 A(SAA)或触珠蛋白(Hp)等,检测 AGP 浓度相对于检测 SAA 和 Hp 浓度来鉴别诊断 FIP 的效果更佳,其灵敏度和特异性均为93%8。然而,在患有其他炎症性疾病、肿瘤甚至健康的 FECV 感染猫中也可以发现急性期蛋白(APP)浓度增加9,表明患猫体内蛋白质浓度显著增加并不是 FIP 的特异性特征。因此,无论血常规检测、生化指标检测还是血清中蛋白质浓度检测,都只能辅助诊断 FIP,确诊还需结合其他临床检查、实验室或影像学检测结果。1.2 积液 大多数 FIP 患猫会出现积液,特别是胸腔或腹腔积液(腹水)或两者组合出现,甚至出现心包积液10。FIP 患猫的典型积液是黏稠、稻草色、清澈到632023(15):36-41专论与综述中度混浊的,由于具有高蛋白质含量、低 A G 和较低的总细胞计数,这些积液的常规检查、细胞学检查、细胞计数和生化参数的测定对于排除或鉴别诊断 FIP很重要。尽管检测这些指标并不能完全特异性指示FIPV 感染,在其他病因诱导猫产生的积液中也可能出现结果异常11-12,但结合临床症状分析,对 FIP 的诊断有一定的指导作用。Rivalta 测试是一种廉价且快速的检测方法,将腹水滴加到 8 mL 纯化水与 98%乙酸混合液中,若腹水在混合液中保持浑浊液滴状沉入底部则为 FIP 阳性,若腹水与混合液融合则为阴性。然而该测试方法的特异性仅为 66%81%13,因为细菌性腹膜炎/胸膜炎或淋巴瘤引起的积液也可能呈阳性14。Rivalta测试操作简单,不需要任何分析仪器,可用于初步排除 FIP。A.Stranieri 等15使用自动血液分析仪检测猫积液中 delta 总有核细胞计数(TNC),并根据 TNC 判断是否为 FIP 患猫,FIP 患猫的 TNC 高于健康猫,该方法的诊断准确性较高,当 TNC 的临界值为 1.7时,该方法的灵敏度为 79%90%,特异性为 94%100%;当临界值提高至 2.5 或 3.4 时,特异性可提高到 100%。1.3 神经系统症状 没有明显积液的 FIP 患猫更容易出现神经系统症状。临床病理学检查发现,FIP 患猫的脑脊液中蛋白质浓度和细胞数量增多16,脑脊液细胞学检查结果显示有混合性或化脓性炎症,也可见单核细胞浸润。然而,脑脊液异常并非 FIP 的特异性特征,此外,获取脑脊液样本具有一定难度,操作不当时容易形成脑疝,在临床中并不推荐通过脑脊液诊断 FIP。1.4 眼部病变 据报道,高达 29%的 FIP 患猫出现眼部病变,包括化脓性肉芽肿和肉芽肿性葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎17,但非 FIP 患猫出现葡萄膜炎也很常见,因此对猫眼房水的细胞学检查无法准确诊断 FIP。2 FIP 的实验室诊断2.1 抗 FCoV 抗体的检测猫感染 FCoV 后可产生特异性抗体,与 FIP 的形成无关。L.M.Desmarets 等18研究结果表明,猫试验性感染 FCoV 后,在第 7 28 天可检测到抗 FCoV血清抗体。1976 年,FCoV 抗体检测方法首次建立19,到目前为止,已经研发出多种不同的抗体检测方法,如使用 FCoV 作为抗原的间接免疫荧光抗体检测(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和快速免疫层析试验(RIM)20-21。Chen Q.等22研究结果表明,抗体检测不能区分 FECV 和 FIPV 感染,且 FCoV与猪冠状病毒(TGEV)和犬冠状病毒(CCV)之间存在交叉反应。检测血清中 FCoV 抗体诊断 FIP 的灵敏度和特异性相对较低,即使猫血液中 FCoV 抗体水平较高也并不能说明其患有 FIP。在多猫家庭中,高达 80%甚至更高概率的猫具有抗 FCoV 的血清抗体,但这些猫中的大多数未发生 FIP23。此外,猫接种 FCoV 疫苗后也会产生特异性抗体。大约 10%的 FIP 患猫未产生特异性血清抗体14,其原因可能是由于炎症导致血液外渗,使血液中抗体进入积液,血清抗体水平下降,甚至降至检测限以下;此外,机体产生的大量抗体可能与 FIPV 的高病毒载量相互中和24,因此当猫血清中 FCoV 抗体检测为阴性时,仍不能排除 FIP。K.Hartmann 等14对有积液的疑似 FIP 患猫进行检测,结果猫血清中抗体的灵敏度和特异性分别为 85%与57%,而积液中抗体的灵敏度和特异性分别为 86%与85%,虽然检测猫积液中 FCoV 抗体的特异性更高,但也并不具有准确性。E.Lorusso 等25研究结果表明,在 61 只 FIP 患猫中,猫积液中未检测到 FCoV 抗体的猫有 18 只。J.E.Foley 等26研究结果表明,检测猫脑脊液的中 FCoV 抗体可用于神经性 FIP 的初步诊断,但进一步研究发现,检测具有神经症状的FIP 患猫脑脊液中 FCoV 抗体的灵敏度较低,并推测猫脑脊液中 FCoV 抗体水平的诊断临界值为 1 640及更高27。综上所述,检测猫血液、积液、脑脊液中FCoV 抗体水平对 FIP 的诊断意义非常有限。2.2 免疫复合物的检测FIP 形成的典型免疫介导的病变是产生非保护性抗体和免疫复合物,可在 FIP 患猫血清和积液中检测到循环免疫复合物。一项研究显示,利用 ELISA方法检测 FIP 患猫血清中免疫复合物来诊断 FIP,其检测灵敏度为 48%,特异性为 91%14。但在未患有FIP 的健康猫体内也存在 FCoV 免疫复合物23,猫感染 FECV 后,免疫复合物可以在一段时间内循环出现。因此,免疫复合物的检测对 FIP 的诊断没有帮助。2.3 FCoV 抗原的检测1989 年,K.Hk28首次报道了采用免疫荧光染色方法检测猫瞬膜上皮细胞中的 FCoV 抗原。随后,有研究人员采用免疫细胞化学(ICC)和免疫组织化学(IHC)技术检测到 FIP 患猫不同病变组织中巨噬细胞内的 FCoV 抗原29-30。在临床诊断中,通常在超声引导下,利用细针穿刺(FNA)或 Tru-cut 穿刺活检(TCB)采集肝脏、肾脏或淋巴结样本并进行 ICC 或IHC 检测,但检测灵敏度普遍较低29,只有 FIP 患猫病变组织中巨噬细胞含有足够量的 FCoV 抗原才会呈现阳性染色结果。采用免疫荧光染色法(IFA)检测疑似 FIP 患猫积液中 FCoV 抗原是 FIP 诊断的常用方法,在早期的研究中,该检测方法的特异性可高达 100%,因此阳732023(15):36-41专论与综述性结果都可以明确诊断 FIP31。然而,通过 IFA 检测积液中 FCoV 抗原的灵敏度并非绝对,阴性检测结果并不能排除 FIP,因为积液中巨噬细胞数量少或积液中循环抗体与 FCoV 抗原竞争性结合均会造成假阴性结果。此外,在收集猫积液后,应尽快进行检测,虽然采集 FIP 患猫积液 48 h 内仍可检测到 FCoV 抗原(室温或 4 保存),但随着保存时间的延长,检测灵敏度会明显降低。在感染 FCoV 且无积液的猫中,眼部葡萄膜炎是很常见的,继发于眼部炎症和血眼屏障的破坏,眼睛中存在携带 FCoV 的巨噬细胞,可通过 ICC 方法检测房水内巨噬细胞中的 FCoV 抗原32。目前只有一项研究评估了 ICC 检测房水对 FIP 诊断的价值,其检测灵敏度和特异性较低,因此不能用作单一的 FIP 诊断检测。到目前为止,针对疑似 FIP 患猫,采集其特征性病变组织并进行 FCoV 抗原 IHC 检测是诊断 FIP 的金标准33。由于 IHC 需要活检,对患猫进行穿刺采样风险较大,因此需要依赖有经验的兽医开展此项检测。2.4 逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应(RT-PCR)检 测FCoV RNA自从 RT-PCR 应用于 FCoV 检测以来34,它被广泛用于 FCoV 基因组的扩增和 FIP 的诊断。在 FIP患猫体内,病毒载量最高的器官是大网膜、肠系膜淋巴结和脾脏,相比之下,肾脏、肝脏、肺脏、心肌和腘窝淋巴结含有较少或不含 FCoV RNA,采用 RT-PCR、RT-qPCR 等方法检测病毒载量高的组织中 FCoV RNA,检测灵敏度较高,但特异性并不理想35。此外,侵入性采集猫的大网膜、肠系膜淋巴结等组织样本具有风险,因此临床诊断 FIP 很少采集活猫的组织样本进行 RT-PCR 检测。采集猫血液相对容易,但是猫血液中 FCoV 病毒载量很低,采用 RT-PCR 方法检测易出现漏检36。A.A.Herrewegh 等37通过RT-PCR 方法在无症状猫和患有其他疾病(除了FIP)猫的血液中均检测到 FCoV RNA,因此不建议采用 RT-PCR 检测血液样本中 FCoV RNA 以诊断 FIP。对于有积液的 FIP 患猫,积液中的病毒载量远高于血液中的病毒载量38。RT-PCR/RT-nPCR 方法检测积液中 FCoV RNA 的特异性较高(大部分可达 90%以上),灵敏度也较高14,对诊断 FIP 具有较大价值。为了开发特异性检测 FIPV 的 RT-PCR 方法,A.Hornyk等39建立了一种基于引物-探针能量转移的检测FCoV 亚基因组 mRNA 的实时荧光定量 PCR 方法,该方法特异性可达 100%,但灵敏度仍需要提高,且该方法仅用于少量样本的检测,并未广泛应用。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的核酸检测手段,具有反应时间短、结果可视化等优势。有研究者采用 RT-LAMP 方法检测 FIP 患猫的血液和积液中 FCoV RNA,结果特异性接近 100%,但灵敏度低40-41。2022 年,W.Rapichai 等42以实验室分离的 FCoV RNA 为模板,建立了检测 FCoV RNA 的RT-LAMP 方法,该方法特异性高,检测灵敏度(检测限为 20 fg/L)远高于 RT-PCR 方法,但只能用于FCoV 的检测,无法对猫是感染 FECV 还是 FIPV 进行鉴别诊断,需要借助核苷酸测序或与特异性 RT-PCR方法结合分析,方可确诊 FIP。2.5 FCoV 基因突变的检测FCoV 在复制过程中容易出错,会发生多个位点突变18。FCoV 刺突(S)蛋白负责病毒进入细胞,而FCoV S 基因的突变及相应氨基酸的替换,可能会导致病毒细胞嗜性改变43,这也是 FIP 发病机制的关键。研究结果表明,绝大多数 FIPV 毒株中 S 基因的23 531 位点和 23 537 位点发生了特异性突变,23 531 位点的 A 突变为 T 或 C 可导致 S 蛋白的第1 058 位 的 甲 硫 氨 酸(M)突 变 为 亮 氨 酸(L),23 537 位点的 T 突变为 G 并使 S 蛋白第 1 060 位的丝氨 酸(S)突变为丙氨酸(A),S23531A T/C 和S23537TG 特异性突变位点为 FIP 的鉴别诊断提供了新的思路44-45。针对 FIP 患猫组织、积液、血液等样本中 FCoV存在 S 基因特异性突变的特点建立了 RT-PCR、RT-qPCR 等方法。比起单独利用 RT-qPCR 方法检测FCoV,增加 S 基因测序分析可使检测的特异性从93%提高到 95%,而灵敏度从 90%下降到 81%46。其他研究人员也得到类似的结果,A.Stranieri 等12针对 FCoV 高度保守的 3非翻译区(UTR)建立了RT-nPCR 方法,对 FIP 患猫组织样本中 FCoV 进行检测并测序分析 S 基因,结果增加 FCoV S 基因突变分析可使 RT-nPCR 方法检测诊断的特异性从 50%提高到 88%,但灵敏度从 91%下降到 70%;并且在一只未患 FIP 的猫中检测到 FCoV S 基因的突变。综上所述,对猫组织、血液、积液等样本中 FCoV S 基因突变进行分析,不会显著增加 RT-PCR、RT-nPCR、RT-qPCR 等方法检测 FIP 的特异性与灵敏度,即无法提高 FIP 诊断的准确性;同时,考虑到检测 S 基因突变点所需的测序费用和时间,对 FCoV S 基因突变进行分析似乎并不具有诊断优势,但可以将检测 FCoV S基因突变作为额外手段辅助 FIP 诊断。此外,明确FECV 转化为 FIPV 的突变位点后,S 基因突变检测在鉴别 FIPV 和 FECV 中具有潜在的应用前景。3 小结与展望随着经济的发展和人们生活水平的提高,宠物猫的饲养数量越来越多,FIP 发病率也逐年上升,严重威胁猫的健康。现阶段关于 FIP 的发病机制和免疫机制尚未完全清楚,也缺乏特异性诊断方法及精准有832023(15):36-41专论与综述效的治疗手段。纵观上述 FIP 检测方法,各种检测技术针对不同样本的检测灵敏度与特异性差异较大,当猫疑似患有 FIP 时,不能基于单一检测结果来诊断,需要结合病史和典型的临床病理症状等,根据临床症状收集样本并进行针对性检测。根据猫的临床表现推荐的相关诊断步骤见图 1。图 1 FIP 诊断流程Fig.1 FIP diagnostic process 对于有腹腔或胸腔积液的猫,可进行 Rivalta 测试,如果 Rivalta 测试结果为阴性可排除 FIP,如果Rivalta 测试结果为阳性则需要进一步检测;对于有神经症状或葡萄膜炎的猫,应收集脑脊液或房水进行检测分析,但上述检测难以准确诊断时,可通过 RT-PCR 检测辅助诊断,如果 RT-PCR 检测结果为阴性时可大概率排除 FIP,若在 RT-PCR 检测为 FCoV 阳性的样本中检测到高 FCoV 载量或 S 基因突变则可以确诊 FIP。为了提高 S 基因突变检测结果的灵敏度,可采集猫肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏、全血的 FNA样本进行检测分析。如果在 RT-PCR 检测结果为FCoV 阳性的样本中未检测到 S 基因突变且样本中病毒载量较低,但仍高度怀疑 FIPV 感染的情况下,则需要考虑对猫采取剖腹或腹腔镜取组织样本进行IHC 或组织病理学检测,以确认或排除 FIP。对于无典型症状的猫,只能采集猫血液或通过超声引导对肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏等不同器官进行 FNA,然后通过 RT-PCR 检测作为初步检测诊断。FIP 的鉴别诊断一直是临床一大难题,需要在排除其他可能疾病的前提下,结合猫临床症状与各项检测结果进行评估与诊断,即使各项检测结果都表明猫患有 FIP,也只能是“高度疑似”,组织病理学和 IHC检测仍然是诊断 FIP 的金标准,但在临床上该检测手段并非首选方案。理想的检测方法应适用于不同的样本,无论是血液、积液还是其他样本;同时,应具有高灵敏度和特异性,并实现快速检测。因此,为了开发灵敏度与特异性高的 FIP 检测方法,还需要探究FIP 的发病机制和免疫机制,确定 FECV 转变为 FIPV的突变机制等,为特异性诊断 FIP 与有效防控 FIP 提供参考。随着对 FIPV 研究的不断深入,相信在不久的将来,对 FIP 的鉴别诊断与预防能够更加高效、特异。参考文献:1 PEDERSEN N C.A review of Feline infectious peritonitis virus infection:19632008 J.J Feline Med Surg,2009,11(4):225-258.2 PEDERSEN N C,ALLEN C E,LYONS L A.Pathogenesis of feline enteric coronavirus infection J.J Feline Med Surg,2008,10(6):529-541.3 RIEMER F,KUEHNER K A,RITZ S,et al.Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis:a retrospective study of 231 confirmed cases(20002010)J.J Feline Med Surg,2016,18(4):348-356.4 PALTRINIERI S,COMAZZI S,SPAGNOLO V,et al.Laboratory changes consistent with feline infectious peritonitis in cats from multicat environments J.J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med,2002,49(10):503-510.5 NORRIS J M,BOSWARD K L,WHITE J D,et al.Clinicopathological findings associated with feline infectious peritonitis in Sydney,Australia:42 cases(19902002)J.Aust Vet J,2005,83(11):666-673.6 TSAI H Y,CHUEH L L,LIN C N,et al.Clinicopathological findings and disease staging of feline infectious peritonitis:51 cases from 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