组学研究技术.ppt

Chapter 10Chapter 10 基因组学研究技术基因组学研究技术Capter 1Capter 1Capter 1Capter 11物理图谱物理图谱基因转录图谱基因转录图谱基因组功能分析技术基因组功能分析技术生物信息学技术生物信息学技术主要内容主要内容2物理图谱物理图谱3物理图谱物理图谱（physical map）测定测定DNA分子，分子，绘制构成基因组的全部绘制构成基因组的全部基因的排列和间距基因的排列和间距。即即直接将直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置。的实际位置。目的目的把基因的遗传信息把基因的遗传信息在染色体上的相对位置在染色体上的相对位置线性而系统地排列出来线性而系统地排列出来4染色体上每个染色体上每个DNADNA片段的顺序片段的顺序以已知核苷酸序列的以已知核苷酸序列的DNA片段片段（STS）为）为“路标路标”，以碱基，以碱基对（对（bp，kb，Mb）作为基本）作为基本测量单位（图距）的测量单位（图距）的基因组图基因组图。物理图谱物理图谱5物理图的距离物理图的距离依作图方法而异依作图方法而异辐射杂种作图的计算单位为辐射杂种作图的计算单位为厘镭厘镭(cR)限制性片段作图与克隆作图限制性片段作图与克隆作图图距单位为图距单位为碱基对碱基对(bp)。【cR(厘镭厘镭):在确定的辐射剂量下染色体断裂的百分率。】6物理图谱要素物理图谱要素序列序列位置位置长的序列中长的序列中物理图：标明各个序列的路标物理图：标明各个序列的路标通过分子杂交的办法通过分子杂交的办法利用利用DNA双链互补特点双链互补特点一个一个DNA片段杂交在这个位置片段杂交在这个位置说明这个位置的结构与它相似说明这个位置的结构与它相似即这个即这个位置的标记位置的标记以序列作为标记的位置以序列作为标记的位置78物理作图的方法物理作图的方法限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)基于克隆的基因组作图基于克隆的基因组作图(clone-based mapping)荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ hybridization)序标位作图序标位作图(STS，Sequence taged site)9物理图谱的意义物理图谱的意义获得分布于整个基因组的获得分布于整个基因组的30000个序列个序列标签位点（标签位点（sequence tagged site,STS），使基使基因组每隔因组每隔100kb距离就有一个标记距离就有一个标记在此基础上构建覆盖每条染色体的大片在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段段DNA克隆克隆如：如：10酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）细菌人工染色体细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome,BAC）人工附加染色体人工附加染色体（human artificial episomal chromosome,HAEC）人工噬菌体染色体人工噬菌体染色体（P1 bacteriophage artificial chromosome,PAC）等连续克隆等连续克隆(Contig)11限制酶作图限制酶作图 DNA链的限制性酶切片段的排列顺序链的限制性酶切片段的排列顺序即即酶切片段在酶切片段在DNA链上的定位链上的定位限制性内切酶在限制性内切酶在DNA链上的切口是以特异序列链上的切口是以特异序列为基础的，核苷酸序列不同的为基础的，核苷酸序列不同的DNA，经酶切后就，经酶切后就会产生不同长度的会产生不同长度的DNA片段，构成独特的片段，构成独特的酶切图酶切图谱谱(Restriction Mapping)。又称。又称DNA物理图谱物理图谱DNA分子结构的特征之一分子结构的特征之一12DNA是很大的分子，限制酶产生用是很大的分子，限制酶产生用于测序反应的于测序反应的DNA片段只是其中的极小片段只是其中的极小部分，这些片段在部分，这些片段在DNA链中所处的位置链中所处的位置关系关系即即DNA物理图谱物理图谱解决解决的问题的问题DNA物理图谱是顺序测定的基础物理图谱是顺序测定的基础指导指导DNA测序的蓝图测序的蓝图Why?13限制性作图限制性作图将限制性酶切位点将限制性酶切位点标定标定在在DNA分子的分子的相对位置相对位置只能应用于较小的只能应用于较小的DNA分子分子上限上限取决于作图分子中限制酶位点的频率取决于作图分子中限制酶位点的频率采用采用6碱基对碱基对识别顺序的限制酶识别顺序的限制酶适合适合 50KbDNA分子的精确作图分子的精确作图限制酶作图限制酶作图 14基本原理基本原理把庞大的把庞大的DNA先先“敲碎敲碎”，再拼接，再拼接以以Mb、kb、bp作为图距作为图距以以STS（sequence tags site）探针序列为路标）探针序列为路标主要是把含有主要是把含有STS对应序列的对应序列的DNA的克隆片段的克隆片段连接成相互重叠的连接成相互重叠的“片段重叠群（片段重叠群（contig）1516（1）完全降解完全降解选择合适的限制性内切酶选择合适的限制性内切酶完全降解待测完全降解待测DNA链链(同位素标记同位素标记)凝胶电泳分离凝胶电泳分离自显影自显影获得图谱获得图谱即组成该即组成该DNA链的酶切片段数目和大小链的酶切片段数目和大小基本步骤基本步骤17同位素标记同位素标记32P限制性内切酶限制性内切酶电泳电泳18末端标记待测末端标记待测DNA的一条链的一条链(同位素同位素)酶部分降解酶部分降解控制反应条件使控制反应条件使DNA链上酶切口随机断裂链上酶切口随机断裂避免所有切口断裂的完全降解避免所有切口断裂的完全降解电泳分离电泳分离自显影自显影比较自显影图谱比较自显影图谱根据片段大小及彼此间的差异根据片段大小及彼此间的差异排出酶切片段在排出酶切片段在DNA链上的位置链上的位置（2）部分降解部分降解1912比较比较排出酶切片段排出酶切片段20完整的物理图谱应包括完整的物理图谱应包括基因组的不同载体基因组的不同载体DNA克隆片段重叠群图克隆片段重叠群图大片段限制性内切酶切点图大片段限制性内切酶切点图DNA片段或一特异片段或一特异DNA序列（序列（STS）的路标图）的路标图基因组中广泛存在的基因组中广泛存在的特征型序列特征型序列等的标记图等的标记图（如（如CpG序列、序列、Alu序列，序列，isochore）【具有mosaic结构,称为isochore。即基因组是由一些较长的大片段（平均长度300 Kb）组成,GC含量相对均匀,而在这些大片段的两端GC含量是跃变的,而不是渐变的】2122荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。连锁图上。23荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）24荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）25荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）26荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）27用用DNA纤维分析水稻第纤维分析水稻第4号染色体号染色体28基于克隆的基因组作图基于克隆的基因组作图 大片段大片段DNA的克隆载体的克隆载体YAC:酵母人工染色体酵母人工染色体230-1700Kb BAC:细菌人工染色体细菌人工染色体300KbPAC:P1人工染色体人工染色体300Kb Cosmids:30Kb重叠群重叠群(Contig)：相互重叠的相互重叠的DNA片段组成的物理图片段组成的物理图Contig组建方法组建方法:染色体步移染色体步移指纹作图指纹作图29v克隆作图克隆作图构建全基因组构建全基因组DNA基因文库基因文库构建指定单一染构建指定单一染色体的基因文库色体的基因文库PCR检测检测STS分子标记分子标记根据重叠根据重叠STS标记标记绘制克隆连锁图绘制克隆连锁图提取基因提取基因组组DNA流式细胞仪流式细胞仪分离染色体分离染色体打断 打断30染色体步移染色体步移原理原理31chromosome walkingchromosome walking酶切，插入A基因探针筛选亚克隆片段重新筛选亚克隆片段重新筛选亚克隆1相邻亚克隆232指纹：指纹：确定确定DNA样品所具有的样品所具有的DNA片段片段一个克隆的指纹一个克隆的指纹即即表示该克隆所具有的限定的顺序特征表示该克隆所具有的限定的顺序特征克隆指纹分析原理克隆指纹分析原理如果如果2个克隆彼此重叠个克隆彼此重叠它们一定含有相同的序列它们一定含有相同的序列克隆指纹主要用于克隆指纹主要用于重叠群重叠群(Contig)的构建的构建33指纹分析方法指纹分析方法n限制性带型限制性带型(restriction patterns)指纹指纹n重复顺序重复顺序DNA指纹指纹(repetitive DNA fingerprints)nSTS目录作图目录作图(STS content mapping)n重复重复DNAPCR(repetitive DNA PCR)或分散重复顺序或分散重复顺序PCR指纹指纹 (interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)34限制性片段指纹限制性片段指纹重叠顺序重叠顺序DNA指纹指纹STS指纹指纹Contig35序标位序标位(STS)作图作图 u长度长度:100-500bpu序列已知序列已知,可以设计可以设计PCR反应反应u单拷贝单拷贝,在染色体上的位置是唯一的在染色体上的位置是唯一的uEST(Expressed sequence tag)可以作可以作STSSTS：sequence tag sit36STS作图原理作图原理成套片段成套片段2个标签同时出现在6个大片段中只有2个大片段有2个标签37染色体染色体DNASTS作图原理作图原理38寻找寻找STS的方法的方法表达顺序标签表达顺序标签(expressed sequence tag，EST)从从cDNA中找到的小段顺序中找到的小段顺序基因家族成员间共有的序列基因家族成员间共有的序列不能用于不能用于STSSSLP （simple sequence length polymorphisrns）随机基因组顺序随机基因组顺序39表达顺序标签表达顺序标签EST随机挑选随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序克隆进行单向、一步大规模测序所获得的部分所获得的部分cDNA序列即序列即ESTEST是一个是一个cDNA克隆快速大规模测序后克隆快速大规模测序后所获得的所获得的端和端和端部分端部分cDNA随机片段随机片段每个每个EST长度约长度约200600bp代表了一个单拷贝基因的部分代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列表达序列40大多数大多数EST的长度不足的长度不足400bpWhy？一个基因转录本的一个基因转录本的cDNA序列序列可能包含多个序列重叠的可能包含多个序列重叠的EST一个基因一个基因mRNA剪接点不同剪接点不同可以获得多个可以获得多个cDNA克隆克隆那么那么，EST既可能对应于一个既可能对应于一个cDNA的某一部分的某一部分又可能代表又可能代表mRNA的不同剪接方式的不同剪接方式41基因转录图谱基因转录图谱（transcriptionmap）42转录图谱转录图谱(基因图谱)在识别基因组所包含的蛋白质编码在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。表达模式等信息的图谱。即利用即利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱。作为标记所构建的分子遗传图谱。（genemap）43Ortranscriptionmap:在人类基因组中鉴别出占在人类基因组中鉴别出占2%至至5%的全部的全部基因的位置结构与功能。基因的位置结构与功能。基本原理：基本原理：蛋白质推测蛋白质推测mRNA的序列，的序列，mRNA反转录反转录为为cDNA，然后利用其与所测序列进行杂交，然后利用其与所测序列进行杂交，鉴别出与转录有关的基因。鉴别出与转录有关的基因。44基本原理基本原理生物性状和疾病生物性状和疾病由结构或功能由结构或功能蛋白质蛋白质决定决定已知的蛋白质已知的蛋白质由由mRNA编码编码mRNA反转录反转录合成合成cDNA 即即EST的的cDNA片段片段用这种稳定的用这种稳定的cDNA或或EST作为作为“探针探针”进行分子杂交进行分子杂交鉴别出与转录有关的基因鉴别出与转录有关的基因45基本原理 或用或用PolyA互补的互补的寡聚寡聚T或克隆载体的相关序列作为引物或克隆载体的相关序列作为引物对对mRNA双端尾侧的几百个双端尾侧的几百个bp进行测序进行测序得到得到EST（表达序列标签）（表达序列标签）46表达序列标签表达序列标签（EST）克克隆隆测测序序获得获得EST47基本过程基本过程细胞细胞/组织组织高质量高质量mRNA构建构建cDNA文库文库克隆克隆3和和5端端探针探针估计全长和复杂性估计全长和复杂性杂交阵列文库杂交阵列文库克隆克隆3和和5端端全长候选基因全长候选基因纯化克隆纯化克隆证实证实5端端48基因图谱的意义基因图谱的意义1、能为估计人类基因的数目提供可靠的依据。能为估计人类基因的数目提供可靠的依据。2、提供不同组织、不同时期基因表达的信息（数提供不同组织、不同时期基因表达的信息（数目、种类及结构功能）。目、种类及结构功能）。3、提供结构基因的标记，可以作为筛选基因的探、提供结构基因的标记，可以作为筛选基因的探针，有直接的经济价值。针，有直接的经济价值。4、鉴定病态基因（如癌基因）的变异位置。鉴定病态基因（如癌基因）的变异位置。49 单核苷酸多态性单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）人类是一个具有多态性的群体。不同的群人类是一个具有多态性的群体。不同的群体和个体在生物学性状（对疾病的易感性体和个体在生物学性状（对疾病的易感性抗性）上的差别，是进化过程中抗性）上的差别，是进化过程中基因组与环基因组与环境境相互作用的结果相互作用的结果50 不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异，不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异，平均每平均每1000对碱基出现一个对碱基出现一个SNP,2个无关个体间有个无关个体间有300万万SNPs.51SNPSNPSNPSNP作图的一般步骤包括：作图的一般步骤包括：作图的一般步骤包括：作图的一般步骤包括：获取获取DNA序列；序列；从从DNA序列确定序列标签位点序列确定序列标签位点（sequence tagged sites，STSs）；扫描扫描STSs或或ESTs确定候选确定候选SNPs；确定确定SNPs；将将SNPs定位于染色体特定位置。定位于染色体特定位置。52特异杂交特异杂交53SNP不同于罕见的单碱基突变不同于罕见的单碱基突变（Mutation）SNP等位位点出现的频率等位位点出现的频率1位于基因的编码序列中的位于基因的编码序列中的SNP称为称为cSNP如果如果cSNP引起蛋白质重要部位引起蛋白质重要部位AA变异变异导致其功能发生改变导致其功能发生改变位于基因调控序列中的位于基因调控序列中的SNP影响基因的表达调控影响基因的表达调控SNP因连锁不平衡所形成的单倍型因连锁不平衡所形成的单倍型用于关联研究（用于关联研究（Association studies）确定与之联锁的生物学性状相关序列确定与之联锁的生物学性状相关序列54连锁分析与基因定位连锁分析与基因定位疾病的关联研究疾病的关联研究多基因疾病的基因定位多基因疾病的基因定位个体识别和亲子鉴定个体识别和亲子鉴定发病机理的研究发病机理的研究个体用药个体用药生物进化和生物间相互关系生物进化和生物间相互关系SNP应用应用55【例例1】镰刀型贫血症镰刀型贫血症（sickle-cell anemia）血红蛋白的血红蛋白的珠蛋白基因珠蛋白基因17位的位的A突变为突变为T导致导致Val变变Glu血红蛋白构型改变血红蛋白构型改变携氧能力大大降低，引发严重贫血携氧能力大大降低，引发严重贫血SNP与临床与临床直接导致遗传病直接导致遗传病56【例例2】静脉血栓静脉血栓（venous thrombosis）凝血因子凝血因子5（factor V）基因基因1691位的位的G突变为突变为A导致导致Arg变为变为Glu封闭了抗凝血因子封闭了抗凝血因子APC(activated Protein C)对对factorV的切割位点的切割位点促使血栓形成促使血栓形成57关联分析关联分析（Association studies）：如果某一因素可增加某种疾病的发生风险如果某一因素可增加某种疾病的发生风险即与正常对照人群相比即与正常对照人群相比该因素在疾病人群中的频率较高该因素在疾病人群中的频率较高那么那么，该，该因素与疾病相关联因素与疾病相关联如如非遗传因素吸烟与肺癌相关非遗传因素吸烟与肺癌相关遗传因素中，遗传因素中，APOE4与与Alzheimers相关相关SNP与遗传标记与遗传标记研究复杂性状与疾病的遗传，以及群体的基因识别研究复杂性状与疾病的遗传，以及群体的基因识别 老年痴呆/阿尔海默症 58遗传标记遗传标记用于遗传分析或关联分析的特征核酸位点用于遗传分析或关联分析的特征核酸位点SNP数量多，分布广泛数量多，分布广泛SNP适于快速、规模化筛查适于快速、规模化筛查SNP等位基因频率的容易估计等位基因频率的容易估计易于基因分型易于基因分型59同样药物的剂量同样药物的剂量对病人甲有效对病人甲有效对病人乙不起作用对病人乙不起作用对病人丙则可能有副作用对病人丙则可能有副作用药物的疗效与副作用方面，病人的反应差异很大药物的疗效与副作用方面，病人的反应差异很大Why？病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性SNP）导致对药物产生不同的反应导致对药物产生不同的反应SNP与个体用药与个体用药60【例例】细胞色素细胞色素P450酶酶与大约与大约25%广泛使用的药物的代谢有关广泛使用的药物的代谢有关如果病人该酶的基因发生突变如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用就会对降压药异喹胍产生明显的副作用那么，那么，查明病人的查明病人的SNP图谱图谱检测病人是那一个或多个基因发生突变检测病人是那一个或多个基因发生突变对症下药对症下药个体医疗个体医疗。61美国国立卫生研究院美国国立卫生研究院(NIH)提供提供 （National Institutes of Health ）与癌症和肿瘤相关的候选与癌症和肿瘤相关的候选SNP数据库：数据库：http:/cgap.nci.nih.gov/GAI适于生物医学研究的适于生物医学研究的dbSNP多态数据库：多态数据库：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/SNPSNP公用数据库公用数据库62基因组功能分析技术基因组功能分析技术 63基因分离技术基因分离技术 差异基因分离技术差异基因分离技术SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)基因芯片技术基因芯片技术遗传连锁分析遗传连锁分析位点关联分析；位点关联分析；64双杂交技术双杂交技术蛋白组学蛋白组学基因封闭技术基因封闭技术（反义核酸、核酶、RNAi、基因剔除）基因替代技术基因替代技术（基因转移、可控性基因表达）蛋白修饰技术蛋白修饰技术生物信息学分析技术生物信息学分析技术基因功能研究技术基因功能研究技术65变性高压液相色谱变性高压液相色谱(DHPLC)(denaturing high-performance liquid chromatography)基质辅助激光解吸飞行时间质谱基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)DNAChipSSCP(单链构像多肽性单链构像多肽性)动态特异等位基因杂交动态特异等位基因杂交（dynamic allele-specific hybridization）SNP大规模分离检测技术大规模分离检测技术66新基因功能研究策略新基因功能研究策略67基因表达系列分析基因表达系列分析SAGE（serials analysis of gene expression）1995 Velculescu 及其同事年创立68原原 理理来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的息，可作为区别转录物的标签标签（tagtag）；）；通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（量多联体（concatemerconcatemer），对每个克隆到载体的），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用多联体进行测序，并应用SAGESAGE软件分析，可确定软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达丰度（基因的表达丰度（abundanceabundance）。）。691.将将5g含有含有oligodT（引物）（引物）的磁珠与的磁珠与RNA混合。混合。2.合成双链合成双链cDNA。3.用用Nla酶消化酶消化形成一条链形成一条链末端有标签的产物。末端有标签的产物。4.将样品分成两份，连接成含将样品分成两份，连接成含有识别序列的产物，以备用有识别序列的产物，以备用BsmF1消化。消化。5.用用MmeI切割切割每一个样品形每一个样品形成约成约60bp的标签。的标签。SAGE SAGE 步骤步骤磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠识别序列识别序列标签706.延伸延伸5秒，连接成约秒，连接成约130bp的的双链标签双链标签。7.PCR扩增。扩增。8.用用Nla酶切酶切130bp产物释产物释放放34bp双链标签。双链标签。9.连接片断形连接片断形成串联体成串联体。10.克隆到克隆到pZErO-1+里，里，并并测序测序。连接扩增71SAGESAGE实例实例72锚定酶辟分 AE一半结合结头B一半结合结头A标签酶辟分 TE标签酶 辟分 TE连接、用引物A、B扩增73双标标签锚定酶辟分 分离双标标签连接、用引物A、B扩增串联克隆双标标签双标标签SAGE74SAGESAGE特点：特点：研究研究转录物组转录物组转录水平；转录水平；可可寻找较低丰度的转录物，寻找较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息；最大限度地收集基因组的基因表达信息；75快速详细分析快速详细分析成千上万个成千上万个ESTEST，寻找表达丰度不同寻找表达丰度不同的的SAGESAGE标签序列，完整获得基因组的表达信息；标签序列，完整获得基因组的表达信息；SAGESAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速；病组织与正常组织的比较发展迅速；76生生物物信信息息学学技技术术 读懂读懂“天书天书”77生物信息学技术生物信息学技术 读懂读懂“天书天书”78什什么么是是生生物物信信息息学学？79建立生物学信息系统框架建立生物学信息系统框架支持生物学的信息管理系统支持生物学的信息管理系统分析工具分析工具通讯网络通讯网络即传统的即传统的生物信息学生物信息学（Bioinformatics）两个交叉领域的工作两个交叉领域的工作生物信息学计算机技术生物信息学计算机技术基于计算理解基本生物学问题基于计算理解基本生物学问题即计算生物学即计算生物学（Computational Biology）80基因组信息的收集、储存、管理与提供基因组信息的收集、储存、管理与提供新基因的发现与鉴定新基因的发现与鉴定非编码区信息结构分析非编码区信息结构分析生物进化的研究生物进化的研究完整基因组的比较研究完整基因组的比较研究基因组信息分析的方法研究基因组信息分析的方法研究大规模基因功能表达谱的分析大规模基因功能表达谱的分析蛋白质分子空间结构预测模拟和分子设计蛋白质分子空间结构预测模拟和分子设计药物设计等。药物设计等。研究内容与应用范围研究内容与应用范围81EST数据库（包括数据库（包括SAGE数据库）数据库）STS数据库（遗传标记，电子数据库（遗传标记，电子PCR）SNP数据库数据库蛋白数据库蛋白数据库蛋白结构数据库蛋白结构数据库蛋白功能位点数据库（蛋白功能位点数据库（PROSITES）UNIGENE基因数据库基因数据库82同源性分析同源性分析 83分子进化分析分子进化分析84ENDEND85