非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的功能研究进展.pdf

动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e文献综述非洲猪瘟病毒结构蛋白p 的功能研究进展收稿日期:基金项目:北京市家畜创新团队(B A I C );年度新型生产经营主体科技能力提升项目(/)作者简介:李子萱(),女,北京人,硕士研究生,主要从事中药与动物疫病防控研究.通讯作者李子萱,张永红,童津津,崔德凤,(北京农学院动物科学技术学院,北京 ;北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京市中兽药工程技术研究中心,北京 )摘要:非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性出血性猪传染病,自 年传入我国以来,使我国生猪养殖业规模急剧减少,并对社会经济造成了巨大影响.由于非洲猪瘟病毒过于复杂,使疫病防治成为难点,目前尚无有效防控疫苗及治疗药物,其中由E L基因编码的p 蛋白参与病毒组装、诱导细胞凋亡及中和抗体等过程,并且是血清学检测诊断技术与疫苗免疫研究方面的重要靶点之一,此外,p 基因型可作为辅助指标,对追踪病毒演变过程有着重要意义.因此,通过分析p 蛋白在非洲猪瘟病毒感染过程中的作用,为阐明非洲猪瘟病毒致病机制、探索非洲猪瘟疫病防控方法及疫苗研发等方面提供参考.关键词:非洲猪瘟病毒;p 蛋白;疫苗;生物学功能中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()非洲猪瘟(A f r i c a ns w i n ef e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s,A S F V)所引起猪的一种急性出血性传染病,病死率可高达 .世界动物卫生组织(WOAH)将非洲猪瘟列入法定报告动物传染病,我国也将其列为重点防范的一类动物疫病.A S F最早发生于 年非洲肯尼亚,随后传播到了欧洲.年月日,我国辽宁省沈阳郊区的一个养猪场报告了首例A S F病例,此后A S F V在我国各地区内开始迅速传播,给我国生猪养殖业带来了极大的经济损失.目前尚未研究出有效的A S F治疗药物或预防疫苗,在暴发、流行地区主要以检疫扑杀的防疫方式为主.A S F V是有囊膜的D NA双链病毒,属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属.病毒基因组长度约为 k b k b,有 个开放阅读框(o p e nr e a d i n gf r a m e,O R F).病 毒 粒 子 大 小 约 为 n m,由类核、核壳、内包膜、衣壳、外包膜组成的 面体对称结构.在病毒结构中,存在着不同种类的蛋白如p 、p 、p 等结构蛋白,构成病毒粒子的重要组成部分,在病毒的侵入、吸附和复制等感染过程中发挥了重要的作用.其中p 蛋白也被称为p E L,是A S F V表达的早期膜蛋白.在病毒粒子组装过程中,决定了病毒的生存能力,可诱导细胞凋亡,介导A S F V抗体中和作用等致病机制.同时,p 也是A S F V疫苗研究的热点.本文对A S F V的p 蛋白的作用功能、诊断方法及疫苗研究中的应用进展进行综述,以期为A S F V疫苗研发提供理论依据.p 的结构特征p 蛋白由E L基因编码,由 个氨基酸(a m i n oa c i d,a a)构成,在变种病毒分离株中分子质量为 k u k u,位于病毒粒子的内膜中.p 是一种型跨膜蛋白,包含跨膜结构域和G l y G l y X基序,G l y X基序是A S F V结构蛋白蛋白质处理的识别序列.p 基因是从晚期mR NA翻译出来的,进入到病毒颗粒的外膜中.在靠近N 末端的位置含有一个疏水跨膜结构域,由 个氨基酸残基(a a )形成,使p 形成了两个部分,分别为C 末端结构域(C T D)和N 末端结构域(NT D),在第 位含有唯一的半胱氨酸残基,这是p 蛋白完成二聚化进而形成成熟病毒所必须的氨基酸.p 基因分型目前,A S F V已被划分成 个基因型和个血清群.由于p 基因相对保守,对此p 基因分型是普遍采用的分型方法,但它并不能完全区分不同表型的病毒.其中,由E L基因编码的p 蛋白可对标准p 基因分型做进一步细化.在p 基因型的最大分支上,p 基因型可将其进一步分为个离散子簇,分别为I a、I b、I c和I d,这有助于对全球不同地区出现的A S F V株进行研究.如利用p 基因序列对广西省 年死于严重出血性疾病的家猪组织样本进行了A S F V核苷酸序列的基因分型检测,结果显示都属于I a(/)和a(/)基因型.广西A S F V可能来自欧洲,检测在猪群中循环的基因组序列有助于准确追踪A S F V在中国的起源及传播过程.对A S F V/G D/毒株进行分析发现,属于p 基因型a,我国流行的其他毒株C h i n a/A n h u i X C GQ、C h i n a/P i g/HL J/和C h i n a/D B/L N/属于p 基因型 c,而C h i n a/G D/与前期报告的种中国基 因 型变 体 均 不 相 同,并 且 与 格 鲁 吉 亚 /(a基因型)密切相关.这些数据表明,中国南方的毒株可能具有多样性,年中国的A S F V毒株与 年的中国和东欧有关,A S F V/G D/具有某些删除和突变的新变体.p 基因型作为A S F V系统分析中的辅助指标,对A S F V基因组和分型的深入研究,特别是全基因组测序和交叉保护实验数据,有助于进一步判断分析病毒来源,了解基因组多样性和遗传变异过程,追踪其传播方式和可能的传播途径,对于该病的流行病学分析具有重要意义.p 生物学功能p 参与A S F V颗粒组装A S F V颗粒是源于前体膜结构,经内质网(E R)衍生病毒膜聚集在细胞质后,在细胞核内完成组装,前体膜通过外衣壳层的组装发展成 面体结构.同时,核外壳在病毒囊膜形成,病毒D NA、核蛋白经包装和浓缩形成最内层结构.细胞内颗粒通过微管机制从组装部位移动到细胞膜.A S F Vp 参与了病毒膜前体的获取和形成过程,E L基因在病毒的生存能力和膜前体向组装位点的招募起着重要作用.利用A S F Vp 重组蛋白感染细胞后观察到p 抑制了病毒包膜的生成,无法招募E R进而无法将囊膜结构转化形成病毒颗粒,同时使核心前体p p 和p p 在 组 装 地 点 异 常 组 装.用p 与E G F P荧光蛋白通过免疫学证实了融合蛋白在病毒颗粒中的结合,从而分析了病毒感染周期和感染细胞死亡情况.由此提示,p 蛋白可作为嵌入病毒颗粒中载体蛋白,有助于在细胞水平中研究A S F V进入、组装、转运和凋亡细胞死亡的转运途径,并且可追踪病毒的感染进程.p 诱导细胞凋亡细胞凋亡是主动调节组织稳态的过程,激活细胞凋亡可限制病毒的复制,从而阻止病毒完成其复制周期.A S F V可引起易感动物的免疫细胞凋亡,其诱导细胞凋亡的机制与p 蛋白有关,主要涉及与微管运动蛋白D y n e i n的轻链相互作用.D y n e i n是一种负端定向微管相关运动蛋白,参与细胞质中的物质 运 输.而 动 力 蛋 白 轻 链(l i g h tc h a i n,L C)是运动蛋白复合物的一部分,可通过AT P水解沿着微管负端定向运动.将A S F Vp 蛋白在靠近C端的短肽(位氨基酸)与L C 结合,证实了沿着微管负端定向运动运输A S F病毒颗粒的机制,因此L C 可作为病毒粒子的运输工具.A S F Vp 蛋白与L C 动力蛋白的结合位点和促凋亡的B c l 家庭成员B i m 结合位点相似,使其转移至线粒体诱导c a s p a s e 和c a s p a s e 活化引起细胞凋亡.以 上 发 现 证 实 了,A S F V p 参 与 了 激 活c a s p a s e 和c a s p a s e 经线粒体途径诱导的细胞凋亡,这 是 首 次 报 道 的 诱 导 细 胞 凋 亡 的A S F V蛋白.进一步研究发现,p 中有 个氨基酸的结构域与L C 结合,此区域对p 与L C 的结合十分重要,若缺失此氨基酸序列则p 无法诱导细胞凋亡.因此,诱导细胞凋亡可减少感染性子代病毒的产生,从而影响炎症、免疫反应的产生,在免疫逃逸机制中发挥着重要的作用.p 介导A S F V中和抗体通常蛋白中存在多个中和位点,可能还有不同的中和机制.有研究显示,p 在病毒进入过程中起到了重要的作用,揭示了抗体在保护方面的潜在相关性,不同的A S F V分离株可以被恢复期的猪免疫血清和单抗中和.为了探讨p 抗体参与的病毒中和机制,将p 重组表达后,取猪免疫血清接种在V e r o细胞和巨噬细胞上,其结果显示抗p 血清能够抑 制V e r o细 胞 和 巨 噬 细 胞 中 的 病 毒 附着.在蛋白酶K分离试验中,在 培养d后,以上用抗p 附着培养的病毒被内化到细胞中.此外,p 动力蛋白结合域(D B D)与抗体介导的病毒中和有关,用重组蛋白p 免疫猪可以诱导中和抗体.由此提示,抗p 抗体参与并抑制与病毒附着相关的前期步骤,诱导p 产生保护性中和抗体对于亚单位疫苗的开发具有指导作用.p 蛋白的表达与制备A S F Vp 是A S F V的一个具有良好免疫原性的蛋白,能刺激机体产生针对该蛋白的抗体.在感李子萱等:非洲猪瘟病毒结构蛋白p 的功能研究进展染A S F V d即可检测到p 蛋白抗体,可在感染动物血液中持续存在.此外,A S F V抗体阳性血清在 保存,个月后仍能检测出阳性抗体反应.通过氨基酸序列比对结果显示,与其他病毒蛋白之间不存在相似序列,是A S F V特有的蛋白.由于p 的强抗原性和免疫原性,可作为血清学检测诊断技术的开发靶点.通过纯化p 蛋白,对动物进行免疫,从而获得A S F抗体.将重组p 进行原核表达后,免疫双驼峰制备纳米抗体(N b),利用慢病毒表达系统建立了稳定表达N b HR P融合蛋白,从而建立竞争性酶联免疫吸附试验(c E L I S A),以检测猪血清中的A S F V特异性抗体.将合成的含有p 基因的重组蛋白,免疫小鼠并制备p 蛋白的单克隆抗体,从而建立一种阻断E L I S A方法,可用于A S F V临床样品的抗体检测.此外,将p 重组蛋白免疫A S F V抗体阴性健康猪并制备多克隆抗体,利用p 多克隆抗体建立了A S F V抗体胶体金检测方法.以上研究为建立A S F V的血清学鉴别方法奠定了基础,为实现养殖场快速检测A S F V抗体水平提供了帮助,p 与A S F V疫苗研究现状我国发现A S F疫情后,多个周边国家如蒙古、越南、柬埔寨、朝鲜、老挝等也确认了A S F V疫情的暴发.为了更好地控制疫情的传播,接种疫苗被认为是有效阻止A S F V疫情蔓延的手段,而经过学者长期研究,目前仍没有有效控制A S F V疫情的疫苗问世.p 蛋白抗原性好,可诱导机体产生强烈的免疫应答及中和抗体的产生,在疫苗研究中可作为潜在靶点,是理想的A S F V亚单位疫苗抗原.因此,有学者通过将表达纯化后的p 蛋白,对实验动物进行免疫,从而获得A S F V抗体,用于A S F V的免疫学研究.用伪狂犬病病毒(P R V)疫苗株B a r t h a K ,通过R e d/E T重组技术构建表达A S F Vp 、p p 、p 、p 和C D v抗原基因的重组病毒r B a r t h a K p A S F V,对仔猪和小鼠进行免疫后能诱导体内产生较高水平对抗体,这为A S F疫苗开发中抗原基因的筛选提供了重要参考.研究发现,将优化后的A S F Vp 与猪白细胞介素I L 融合蛋白的重组植物乳杆菌,免疫小鼠后增强了抗A S F V活性和黏膜免疫,由于T细胞的增殖使I F N 的分泌增加从而在一定程度上抑制了A S F V的复制.构建A S F Vp 与猪免疫球蛋白I g A 的基因融合蛋白,在酿酒酵母系统中表达p F c 融合蛋白.经口服免疫试验猪后,p F c 融合蛋白可促进猪源性细胞抗原的结合和内细胞的生成,从而加速抗原的呈递诱导产生p 特异性抗体及黏膜免疫力,这为开发A S F V口服疫苗奠定了理论基础.另外,由于A S F V的特性包含广泛的遗传多样性和抗原变异性,这可能会影响特定抗原在诊断中的识别,并限制A S F V疫苗的有效性,因此准确选择抗原的保守区对诊断和疫苗接种具有重要意义.有研究发现位于p NT D(a a )的两个线性B细胞表位,其中含有一个天然线性B细胞表位.经分析后显示在型和型A S F V毒株中高度保守,并检测了与抗体相结合的关键位点,当关键残基位点被取代后会导致抗原性丧失.此次的发现使我们进一步了解到p 在A S F的预防、诊断上有一定的帮助.证实了T细胞反应在保护中的关键作用,以及A S F Vp 及其他多种具有保护潜力的抗原.但单纯由一种或几种蛋白质很难达到免疫预防的效果,因此,未来可能会研发含有不止一种病毒决定因素的疫苗出现,以获得全面保护性疫苗.小结与展望我国首例A S F病例在辽宁省沈阳市被发现后,迅速传播至全国,给我国养猪业带来了严重的经济损失.而目前尚无有效的治疗药物和预防疫苗,这可能与A S F V复杂的致病机制有关.A S F Vp 作为重要的结构蛋白之一,在病毒颗粒组装过程中发挥着重要的作用,可诱导细胞凋亡,介导A S F V抗体中和作用等致病机制.近年来有学者以p 蛋白为靶点对其进行了研究,为A S F V疫苗的研发和诊断方法的确立提供了帮助.这些研究结果提示,p 蛋白在病毒组装和致病机制过程中发挥了重要作用.然而,仍有些机制尚未阐明,如A S F V其他诱导细胞凋亡机制、A S F V中和抗体在保护性反应中的作用等仍不清楚,这些问题有待进一步研究.随着p 蛋白机制研究及临床应用的成果不断涌现,也为A S F疫苗的研发提供了理论依据,加快了安全有效的保护性疫苗及治疗药物上市的步伐.参考文献:WE N X,HEX,Z HAN G X,e ta l G e n o m es e q u e n c e sd e r i v e df r o mp i ga n dd r i e db l o o dp i gf e e ds a m p l e sp r o v i d ei m p o r t a n ti n s i g h t s i n t ot h et r a n s m i s s i o no fA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u si nC h i n a i n JE m e r gM i c r o b e s I n f e c t,():L I U Y,Z HAN G X,Q IW,e ta l P r e v e n t i o na n dc o n t r o ls t r a t e g i e so fA f r i c a ns w i n e f e v e r a n dp r o g r e s so np i g f a r mr e p o p u l a t i o n i nC h i n aJ V i r u s e s,():郭怡德,李冰,蔡汝健,等非洲猪瘟病毒蛋白功能研究进展J动物医学进展,():WAN G FX,Z HANG H,HOU L,e ta l A d v a n c eo fA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u si nr e c e n ty e a r sJ R e sV e tS c i,:动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)T E S F A GA B E R W非洲猪瘟病毒p /E L蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及应用D北京:中国农业科学院,L ICF,HEXL,YAN GY,e ta l R a p i da n dv i s u a ld e t e c t i o no fA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u sa n t i b o d yb yu s i n gf l u o r e s c e n t i mm u n o c h r o m a t o g r a p h yt e s t s t r i pJ T a l a n t a,:P E T R OVANV,MUR G I A MV,WUP,e ta l E p i t o p em a p p i n go fA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u s(A S F V)s t r u c t u r a lp r o t e i n,p J V i r u sR e s,:WAN GAP,J I AN G M,L I U HL,e t a l D e v e l o p m e n t a n dc h a r a c t e r i z a t i o no f m o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tt h e N t e r m i n a ld o m a i no fA f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u ss t r u c t u r a l p r o t e i n,p JI n t JB i o lM a c r o m o l,:L I JH,B A IY,L IF,e t a l R a p i da n du l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no fA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u sa n t i b o d yo ns i t eu s i n gQ DM b a s e d A S F Vi mm u n o s e n s o r(QA I S)J A n a lC h i m A c t a,:戈胜强,左媛媛,韩乃君,等非洲猪瘟病毒基因分型与血清分群研究进展J中国动物检疫,():S H IKC,L I UHX,Y I NYW,e t a l M o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o no fA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u sf r o m o u t b r e a k si nG u a n g x i p r o v i n c e,s o u t h e r nC h i n aJ F r o n tV e tS c i,:L IL,R E NZ,WAN GQ,e t a l I n f e c t i o no fA f r i c a ns w i n e f e v e ri nw i l db o a r,C h i n a,J T r a n s bE m e r gD i s,():时俊非洲猪瘟病毒蛋白A L调控细胞凋亡与坏死性凋亡的分子机制D江苏扬州:扬州大学,赵旭阳,靳家鑫,路闻龙,等非洲猪瘟病毒免疫逃逸分子机制研究进展J畜牧兽医学报,():王俊非洲猪瘟病毒蛋白异戊二烯化修饰鉴定及调控细胞凋亡的分子机制D北京:中国农业科学院,鲍春晖非洲猪瘟P 蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定D江苏扬州:扬州大学,李俊慧,邵军军,常惠芸抗原表位鉴定方法的研究进展J中国兽医科学,():王晓丽,孙蕾,刘文军,等非洲猪瘟病毒编码蛋白功能研究进展J微生物学通报,():Z HAO HJ,R E NJH,WUSY,e ta l HR P c o n j u g a t e d n a n o b o d y b a s e dc E L I S Af o r r a p i da n ds e n s i t i v e c l i n i c a l d e t e c t i o no fA S F Va n t i b o d i e sJ A p p lM i c r o b i o lB i o t e c h n o l,:徐玲玉,曹琛福,李中圣,等非洲猪瘟病毒p 蛋白单克隆抗体的制备及阻断E L I S A方法的建立J畜牧兽医学报,():戴建华,王豪伟,张紫菡基于p 的非洲猪瘟抗体胶体金检测方法建立J中国动物传染病学报,():C HE N L Y,Z HAN G X H,S HAO G M,e ta l C o n s t r u c t i o na n de v a l u a t i o no fr e c o m b i n a n tp s e u d o r a b i e sv i r u se x p r e s s i n gA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u sa n t i g e ng e n e sJ F r o n tV e tS c i,:C HE NXL,WAN GJH,Z HAO W,e ta l L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms u r f a c e d i s p l a y e dA S F V(p )w i t hp o r c i n e I L g e n e r a l l ys t i m u l a t e sp r o t e c t i v ei mm u n er e s p o n s e si n m i c eJAMBE x p r e s s,:C HE NC,HUADP,S H IJG,e ta l P o r c i n e i mm u n o g l o b u l i nF c f u s e dP /P p r o t e i no fA f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u sd i s p l a y i n go ns u r f a c eo fSc e r e v i s i a ee l i c i ts t r o n ga n t i b o d yp r o d u c t i o n i ns w i n eJ V i r o lS i n,:P r o g r e s so nF u n c t i o n so fS t r u c t u r e lP r o t e i np o fA f r i c a nS w i n eF e v e rV i r u sL IZ i x u a n,Z HANGY o n g h o n g,TONGJ i n j i n,C U ID e f e n g,(C o l l e g eo fA n i m a lS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,B e i j i n gK e yL a b o r a t o r yo fT r a d i t i o n a lC h i n e s eV e t e r i n a r yM e d i c i n e,B e i j i n gU n i v e r s i t yo fA g r i c u l t u r e,B e i j i n g,C h i n a;B e i j i n gE n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e ro fT r a d i t i o n a lC h i n e s eV e t e r i n a r yM e d i c i n e,B e i j i n gU n i v e r s i t yo fA g r i c u l t u r e,B e i j i n g,C h i n a)A b s t r a c t:A f r i c a nS w i n eF e v e r i sa na c u t eh e m o r r h a g i c s w i n e i n f e c t i o u sd i s e a s ec a u s e db yA f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s S i n c e t h es p r e a d i n t oC h i n a i n ,i th a sd r a m a t i c a l l yr e d u c e dt h es c a l eo fp i gb r e e d i n g i n d u s t r ya n dc a u s e dah u g e i m p a c to ns o c i a l e c o n o m y D u e t ot h ec o m p l e x i t yo fA S F V,i t i sd i f f i c u l t t op r e v e n ta n dc o n t r o l t h ed i s e a s ew i t h o u te f f e c t i v ev a c c i n ea n dt h e r a p e u t i cd r u g,a m o n gt h e m,p p r o t e i ne n c o d e db yE Lg e n e i s i n v o l v e d i nt h ep r o c e s so f v i r u s a s s e m b l y,i n d u c t i o no f a p o p t o s i s a n dn e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e s I t i sa n i m p o r t a n t t a r g e to f s e r o l o g i c a l d e t e c t i o na n dd i a g n o s i s t e c h n o l o g ya n dv a c c i n e i mm u n i t yr e s e a r c h,w h i c hc a nb eu s e da s a na u x i l i a r y i n d e xw i t hg r e a t s i g n i f i c a n c e f o r t r a c i n g t h e e v o l u t i o no f v i r u s T h e r e f o r e,t h i sp a p e r a n a l y z e s t h e r o l eo f p i n t h ep r o c e s s o fA S F i n f e c t i o n,w h i c hw i l l p r o v i d e av i t a l r e f e r e n c e f o r e l u c i d a t i n gt h ep a t h o g e n i cm e c h a n i s mo fA S F V,e x p l o r i n gt h ep r e v e n t i o na n dc o n t r o lm e t h o d sw i t hv a c c i n e s K e yw o r d s:A f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s;p ;v a c c i n e;b i o l o g i c a l f u n c t i o n李子萱等:非洲猪瘟病毒结构蛋白p 的功能研究进展