复方苦参注射液生物碱类成分及血中移行成分的分析_张莉.pdf

方药研究复方苦参注射液生物碱类成分及血中移行成分的分析张莉，吴欢，尹艳艳（安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥 ；安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 ）摘要 目的利用超高效液相色谱电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱（，）结合 构建靶向筛查策略分析复方苦参注射液（，）的生物碱类成分及血中移行成分。方法首先，采用 的全信息串联质谱技术采集经 分离的 样品及其空白样品、给药后的大鼠血浆样品及空白血浆样品的信息；然后，建立 生物碱化学成分数据库，与 数据一同导入 进行靶向筛查；依据母离子、碎片离子的精确质量对筛查出的化合物进行识别；最后，使用 工作站对 输出的结果进行核实。结果本实验共分离、鉴定了 种 生物碱，其中 种生物碱能在大鼠血浆中被检出。结论该方法能够快速分析 生物碱类成分及其血中移行成分，可为 的质量控制及药效物质研究提供参考。关键词 超高效液相色谱；电喷雾离子化；四极杆飞行时间质谱；全信息串联质谱技术；复方苦参注射液；生物碱类成分；血中移行成分 中图分类号 复 方 苦 参 注 射 液（，）又称“岩舒注射液”，是由苦参及白土苓饮片提取精制而成的灭菌水溶性制剂，具有清热解毒、凉血利湿、散结止痛之功效。临床主要用于抑制肿瘤并缓解癌性疼痛，疗效确切。近年来有研究表明，生物碱是 的主要活性成分，其抑制肿瘤的作用及机制也逐渐被揭示。中药制剂的体内外物质基础研究是中药现代化、国际化的核心问题，能从本质上揭示中药作用的科学内涵，同时也为其质量控制提供依据。马悦利用液质联用结合核磁共振技术识别了 中 种化学成分，然后利用高效液相色谱建立了 批 的指纹图谱并指认了个色谱共有峰，研究取得一定进展。但 中生物碱类成分仍需系统研究，尤其是其血中移行成分。超高效液相色谱电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱（，）具 有 分离性能好、灵敏度高、分辨率高、动态扫描范围宽等优基金项目：国家自然科学基金项目（）；安徽省自然科学基金项目（）；安徽省转化医学研究院科研基金项目（）作者简介：张莉（），女，硕士研究生通信作者：尹艳艳（），女，博士，教授，点，已 被 广 泛 应 用 于 中 药 体 内 外 物 质 基 础 的 研究。本研究采用 的全信息串联质谱技术（，）采 集 样 品 信 息，然 后 基 于 构建靶向筛查策略识别 中生物碱类成分及血中移行成分，以期为 的质量控制及药效物质研究提供参考。仪器与材料 配 有 系统（包括在线脱气器、恒温控制柱室、自动取样器和四联泵）和 系统：美 国 公 司；工 作 站 和 软件：美国 公司；超纯水净化系统：美国 公司；（总生物碱含量为 ）：山西振东制药股份有限公司；色谱级乙腈：德国 公司；甲酸：上海 有限公司。方法 样品溶液及空白溶液的制备取 ，减压离心挥干溶剂。加入 甲醇，涡旋振荡 使残渣溶解，离心 。取上清 至 量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得 样品溶液。取生理盐水 同法制备即得空白样品。动物实验 只 级健康雄性 大鼠，体质量约 ，由安徽医科大学实验动物中心提 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 供，动物生产许可证号为 （皖）。适应性饲养（温度和湿度分别为 和 ，昼夜交替时间为）。大鼠禁食 后，随机分为 组和空白组，每组只。组大鼠腹腔注射 ，隔日次，连续次。空白组给予等量生理盐水。末次给药后，分别于、从眼下静脉采集 血液，置于肝素化 管中。、离心 后，取上清，即得血浆样品。将不同时间点所取血浆合并后，置于 冰箱保存备用。血浆样品及空白血浆的制备取 血浆，平均分成份，每份 。将 血浆置于 管中，加 预冷甲醇，旋涡振荡，、离心 。取上清，用氮气吹干。加 预冷甲醇重新溶解残渣，合并 份残渣混合液，旋涡混合 ，、离心 ，取上清，再次用氮气吹干，加入 预冷甲醇，旋涡混合，、离心 ，即得 血浆样品溶液。空白组血浆亦按此方法处理。条件采用 色谱柱（，粒径为）对复杂组分进行色谱分离，柱温为 ；进样量及流速分别为和 。流动相由 醋酸铵溶液（）和乙腈（）组成。洗脱程序：，；，；，；，；，；，；，；，。条件采用 进行质谱检测。运行参数：毛细管电压 ，锥孔电压 。离子源和干燥气的温度分别为 和 。锥孔气体流速为，干燥气体流速为 。数据采集速率 ，扫描范围 。使用亮氨酸脑啡肽（）在 流速下进行实时数据校正。模式下的低、高碰撞能量分别为 和 。数据分析方法首先，建立 生物碱化学成分 数 据 库。以 苦 参 作 为 关 键 词 检 索 、和 等数据库，收集 可能含有的生物碱类成分信息（包含化合物名称、分子式及结构式）并输入至 表格中。然后，将 的 其中低碰撞能（）获取母离子精确质量，高碰撞能（）获取碎片离子精确质量 采集的 样品及空白样品源文件和 生物碱化学成分数据库一起导入 软件进行靶向筛查。软件参数设定：二维，包含保留时间（，）和离子强度 检测最小峰面积为 ；三维（，包含、离子强度和）检测的低、高碰撞能量下峰强度分别设置为 和 ；偏差为 ；质量误差为。待识别出 所含的生物碱类成 分 后，以 这 些 成 分 重 新 建 库，连 同 采集的 给药后大鼠血浆及空白血浆导入 软件进行血中移行成分的筛查。依据母离子、碎片离子的精确质量对筛查出的化合物结构进行确认。最后验证结果，对 输出的结果进行逐一核实，当在空白组和 组样品谱图的同一处提取到离子强度相近的离子流时，则认为该成分为假阳性结果，应予以剔除。结果 条件的优化流动相的表面张力、黏度及流速越低，越有利于 源电喷雾离子化。因此，有机相选择表面张力和黏度均较低的乙腈，流速设为 。生物碱容易荷正电荷，离子检测模式设置为 模式。水相分别考察了纯水、乙酸溶液、甲酸溶液和 醋酸铵溶液，其中 醋酸铵溶液作为水相与乙腈进行梯度洗脱时，化合物峰形和分离度均较好。因此，选择乙腈 醋酸铵溶液作为洗脱液。样品中生物碱成分分析采用 检测 样品溶液及空白溶液。在正离子模式下 样品溶液和空白溶液的总离子流图见图。根据“”项下构建的靶向筛查策略对 中生物碱类成分进行定性分析。共识别出 种生物碱类成分，包括 种苦参碱型、种金雀花碱型、种羽扇豆碱型、种苦豆碱型成分，具体结果见表。以峰为例解析苦参碱类化合物的识别过程。低碰撞能量下峰（）检测到加合离子的为 ，以 的元素组成工具推测其分子式为 ；高碰撞能量下观察到 、等碎片离子；其中，为 脱去一分子而产生，接着 发生电荷转移并 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 图空白样品（）和 样品（）在 模式下的总离子流色谱图表 生物碱类成分的 色谱及质谱数据序号化合物名称 分子式实测值 理论值 质量误差 加合离子二级碎片离子氧化黄叶槐碱 ，金雀花碱 ，二羟基苦参碱 ，槐胺 ，羟基苦参碱 ，氧化槐醇碱 ，氧化苦参碱 ，氧化槐果碱 ，黄叶槐碱 ，氧化槐定碱 ，槐醇碱 ，鹰靛叶碱 ，甲基金雀花碱 ，氧化槐定碱 ，槐定碱 ，菱叶碱 ，羽扇烷宁 ，苦参碱 ，槐果碱 ，注：示血中移行成分 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 图氧化苦参碱的质谱图（）和裂解途径（）经过系列裂解后生成 、和 ，其中 可进一步脱去生成 的 碎 片 离 子。见 图。因 此，经 靶向筛查并结合其母离子、碎片离子精确质量以及裂解特征，推测该化合物为氧化苦参碱。血中移行成分分析利用 检测“”项下获得的 血浆样品及空白血浆样品。将“”项下的 种 生物碱成分重新建库并导入 ，自动比对含药血浆及空白血浆，靶向筛查出血中移行的生物碱类成分。共有 种成分能够在血浆中被检出，包括 种苦参碱型（，二羟基苦参碱、羟基苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、氧化槐定碱、槐醇碱、氧化槐定碱、槐定碱、苦参碱和槐果碱）、种金雀花碱型（甲基金雀花碱、菱叶碱）、种羽扇豆碱型（氧化黄叶槐碱、黄叶槐碱、）、种苦豆碱型（鹰靛叶碱、羽扇烷宁）成分。讨论多项临 床 研 究 表 明，对 恶 性 肿 瘤 如 肝癌、胃 癌、肺癌、乳腺 癌 具 有 较 好 的 疗效，肿瘤抑制作用可能与其抑制癌细胞增殖，诱导细胞周期阻滞，加速凋亡，抑制血管生成，抑制肿瘤转移和侵袭有关，。已有研究表明，苦参碱和氧化苦参碱等生物碱类成分是 的主要活性成分，它 们 对 人 肝 癌 细 胞（）、胃 癌 细 胞（和 ）以 及 乳 腺 癌 细 胞 系（）有不同程度的抑制作用。然而，中药制剂具有多成分、多靶点协同作用的特点，其血中移行成分是其发挥治疗作用的潜在活性物质。因此，有必要对 生物碱类组分及血中移行成分进行系统分析。的 模式是一种能够实现高、低碰撞能量切换扫描的数据非依赖性采集技术，能在一次样品采集过程中同时捕获母离子和碎片离子的精确质量，并依据它们的色谱行为进行关联和匹配 ，降低了数据采集次数。由于中药制剂化学成分具有多样性和复杂性，传统的手动提取离子流，依据母离子及碎片离子等信息进行人工解谱的过程复杂且耗时；在有基质干扰的情况下，响应信号小或含量低的成分在采集模式下易发生漏判。作为一种简单高效的数据分析平台，能 对 的数据进行采集、峰提取、分子式确定，也能比对含药样品及空白样品的差异并与库中化合物进行匹配，依据碎片离子对化合物进行推导，最后输出拟识别化合物的信息。本研究通过 技术结合靶向筛查策略识别了 中 生物碱类成分及 种血中移行成分，为其药效物质的系统阐明及质量控制体系的建立奠定了基础。参考文献：，：，：，：，：，：，：，：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ，：马悦复方苦参注射液化学成分和质量控制研究北京：中国中医科学院，梁风尘，周晋华，吴欢，等超高效液相色谱四级杆飞行时间串联质谱快速分析复方守宫散化学成分及血中移行成分安徽中医药大学学报，（）：，：，：，：，：，：（），（）：，：（），（）：，（）：，（）：黄梦文，吴欢，于伟，等超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法快速辨识芪玉三龙汤化学成分色谱，（）：，：（收稿日期：），（，；，）（）（），（），；，；：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月