吴梧桐主编生物制药工艺学学习笔记.pdf

第一章 生物药物概论 1、生物药物的分类：（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂（2）基因药物（3）天然生物药物（4）合成与部分合成的药物。DNA 重组药物和基因药物的区别：DNA 重组药物即应用重组 DNA 技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；基因药物即以基因物质（DNA 或 RNA）为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。2、生物药物的作用特点：药理学特性：（1）药理活性高（2）治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠。（3）毒副作用较少，营养价值高。（4）生理副作用常用发生。理化特性：（1）生物材料中的有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。（2）生物活性物质组成结构复杂、稳定性差。（3）生物材料易染菌，腐败。（4）生物药物制剂的特殊要求。3DNA 重组药物有：（1）细胞因子干扰素类：-干扰素、-干扰素、-干扰素（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：白介素-2（IL-2）和突变型白介素-2（Ser125-IL-2）肿瘤坏死因子类主要有TNF-和 TNF-受体。（3）造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）（4）生长因子类：胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDFD）、转化生长因子（TGF-和 TGF-）、神经生长因子及各种神经营养因子。（5）重组多肽与蛋白质类激素：重组人胰岛素（rhInsulin）、重组人生长激素（rhGH）、促卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白和重组人血红蛋白（6）心血管病治疗剂与酶制剂：因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及 DNsae 等（7）重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。4 术语 药物：用于预防、诊断、治疗 保健的一类物质。药品：是指用于预防、治疗、诊断人体疾病，有目的地调节人体生理功能并规定有适应证或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。药品根据其来源可分两大类：天然药物即植物药、动物药和矿物药；合成药包括化学合成药与微生物合成药。天然药物一般来源于自然界，很少有人工加工过程，药物成分相对较复杂。生化药物：（biopharmaceutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。DNA 重组药物：即应用重组 DNA 技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等。基因药物：以基因物质（RNA 和 DNA 及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的 DNA 片段、重组疫苗、反义药物和核酸等。生化药物：是运用生物化学的理论、方法、技术与研究成果，从生物体（包括动物、植物、微生物和海洋生物）分离、纯化得到的一些重要生理活性物质，经药效学和毒理学研究证明对于疾病的防治是安全有效的一大类药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、维生素、激素、糖类、脂类、核酸、核苷酸及其衍生物。反义药物：是以人工合成的 10几十个反义寡核苷酸序列与模板DNA 或 mRNA 互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和 mRNA 的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒作用，目前有 20 多种反义药物进入临床试验，其中 ISIS 是 FDA 批准的第一个反义药物，用于治疗 AIDS病患者的巨噬细胞病毒性视网膜炎。核酸疫苗：将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA 或 RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。第二章生物制药工艺学技术基础 1、生物活性物质的浓缩与干燥的方法：生物活性物质的浓缩：（1）盐析浓缩（2）有机溶剂沉淀浓缩（3）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（4）用聚乙二醇（PEG）浓缩（5）超滤浓缩（6）真空减压浓缩与薄膜浓缩 生物活性物质的干燥：（1）减压干燥（2）喷雾干燥（3）冷冻干燥 2 简述生物活性物质分离纯化的主要原理：根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离的目的。主要纯化原理有：（1）根据分子的形状和大小不同进行分离（2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离（3）根据分子极性大小及溶解度的不同进行分离。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离（5）根据配体特意性进行分离 3、保存菌种、菌种退化、检查菌种退化 常用的菌种保存方法：斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法、甘油冷冻保藏法、其他如沙土管保藏法。菌种的退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细胞的死亡。一般把菌株的生活力、产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化。检查菌种退化：（1）单位容积中发酵液的活性物质含量（2）琼脂平皿上的单菌落形态，（3）不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征，如形成孢子的能力；（4）发酵过程的 pH 变动情况（5）发酵液的气味、色泽 4 重组 DNA 技术基本原理，如何获取目的基因 基因工程是通过体外重组将甲生物体的基因转入乙受体生物体内进行表达的生物技术。获取目的基因的方法有：（1）鸟枪克隆法（2）人工合成目的基因 1、酶促方法 2、化学合成法 5 常见的基因载体有，如何构建基因重组体 在体外将含目的基因的 DNA 片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获的重组 DNA 分子。常见的基因载体有：链霉菌质粒、芽孢杆菌载体、质粒、噬菌体（phage）、黏粒(cosmid)、病毒载体等。6 DNA 重组体有主要有哪几种表达系统？各有什么特点？基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。根据宿主细胞种类不同，分为原核基因工程和真核基因工程。原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。（1）大肠杆菌表达系统：遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（2030min 即可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高（可达总蛋白的 5%6%），下游技术成熟、易于控制。目前使用最广泛、最成功的表达系统。（2）酵母表达系统：是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后的修饰与糖基化；表达量高，如明胶表达量达 14。8g/L;培养成本低；适用高密度发酵；杂蛋白少，产物易纯化。（3）哺乳动物表达系统：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和猴肾细胞（COS）优点是能识别和剪切外源基因的内含子并加工成为成熟的 m RNA.但其培养技术难度大，成本高，研究与生产周期长。三体系表达特点比较 表达体系 产物 产生部位 培养方式 提纯 产物活性 潜在危险 大肠杆菌 多肽、蛋白质或融合蛋白质 菌体内 容易 部分可获得高产 一般 对原核者好 真核者稍差 不大 酵母 多肽、蛋白质或糖基化蛋白 菌体内或分泌出细胞 容易 可高产 菌体内，稍复杂 真核的接近天然 不大 哺乳动物细胞 完整糖基化蛋白质 分泌出细胞 较难成本高 可高产 简单 几乎可为天然产物 需注意有致癌因素 7 生物制药工艺中试放大的目的，如何进行中试放大。中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模化生产至关重要。这些研究工作都是围绕着如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。中试放大的方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。主要采用经验放大法。8 术语 微生物纯培养：系指只在单一种类存在的状态下所进行的生物培养。所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养，高等植物或动物的无菌培养（无菌饲养）也可说是一种纯培养。纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（L Pasteur）和柯赫（RKoch）建立起来的。在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物；也有一些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。诱变育种：是指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。诱变育种主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株 3 个部分。蛋白质工程：在基因水平上设计表达新功能蛋白。转基因动物：将外源基因导入哺乳动物的受精卵或胚胎中，使导入基因与受精卵染色体整合，并将外源基因稳定地子代，使子代表现外源基因的性状。蛋白质组学：研究细胞、组织或个体全部蛋白质的全部表达状态与功能状态，是后基因时代重要研究方向 第三章、生物材料的预处理 1、去处发酵液中的杂蛋白的方法：（1）加入凝聚剂（2）加入絮凝剂（3）变性沉淀（4）吸附（5）等电点沉淀（6）加各种沉淀剂 2、去处发酵液中的钙、镁、铁离子的方法：（1）离子交换法 去铁离子（2）沉淀法 钙与草酸钠或草酸 镁的去处用草酸沉淀不完全，碱性条件下用磷酸盐，或三聚磷酸钠，生成络合物（污染河水）3、影响絮凝效果的主要因素：絮凝剂分子量、絮凝剂用量、pH 及操作条件 絮凝剂分子量越大，链越长，吸附桥架效果就越明显，但分子链越大，絮凝剂在水中的溶解度降低；絮凝剂浓度越低，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果，但过多引起吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层，使胶粒稳定，降低絮凝效果；pH 的变化影响离子型絮凝剂功能团的电离度，电离度的提高使电排斥作用增强，架桥能力最佳；搅拌应注意，刚开始搅拌迅速使絮凝剂分散，发挥絮凝作用，絮凝团形成后，高的剪切力会打碎絮凝团。4 细胞破碎：方法 原理 特点 机械法 匀浆法 基于液相的剪切力 适用面广，处理量大，速度快，工业广泛使用，不适用某些高度分支微生物，产热大，可能会生物活性物质失活 珠磨法 研磨作用破碎 适用面广，处理量大，工业广泛使用，产热大，可能会生物活性物质失活 超声波 超声波的空穴作用破碎 产热大，散热不易，成本高，适用小量样品破碎 物理法 干燥法 菌体细胞膜渗透性变化，自溶 较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性 冻融法 胞内冰晶引起细胞膨胀破碎 较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，实验室使用 渗 透 压冲击法 渗透压突然变化，细胞快速膨胀变化 较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用 化学法 化 学 试剂处理 化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞成分 需选择合适的试剂，减少对活性物质的破坏，可应用于大规模生产 制 成 丙酮粉 丙酮迅速脱水，破坏蛋白质与脂质结合的键 迅速脱水，减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放 生物法 酶解法 用酶反应分解破坏细胞壁上特有的化学键 反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模应用 组 织 自溶法 利用组织中酶改变、破坏细胞反应条件温和、成本低，不适用于易受酶降解的目的物的提取 结构、使组织自溶 5、超声波破碎细胞的原理：超声波的破碎作用与液体中空穴的形成有关。当超声波在液体中传播时，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用，出现细小的空穴。这种空穴泡在超声波的继续作用下，又迅速闭合，产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的黏滞性旋涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎。术语：1、凝聚作用：（coagulation）是指在某些电解质的作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥作用降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。2、絮凝作用：（flocculation）是指在胶体悬浮液中加入絮凝剂后，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀的过程。3、渗透压冲击法：把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压的作用，细胞外的水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液中。4、错流过滤：滤液给过滤介质表面一个平行的大流量冲刷，则过滤截止表面积累的滤饼就会减少到可以忽略的程度，而通过过滤介质的流速却比较小。第四章 萃取法 1、溶液萃取法的基本原理：如某一抗生素在有机溶剂（不溶于水）中溶解度较大，当料液与有机溶剂接触后，抗生素就从水相转移到有机相中。另外，抗生素在不同 pH 条件下，可以有不同的化学状态（如游离态酸、碱或成盐），其分配系数亦有差别，若适度改变 pH，可将抗生素自有机相再转入水相，这样反复萃取，可以达到浓缩和提纯的目的。2、溶液萃取法按操作方式不同，可分为单级萃取和多级萃取，后者分为错流萃取和逆流萃取。当萃取剂用量相同时，二级萃取收率比单级萃取收率高，在萃取用量一定的情况下，萃取次数愈多，则萃取愈完全。多级逆流与错流萃取相比，萃取剂耗量较少，萃取液平均浓度较高。3、乳化剂能使乳化液稳定：（1）、界面膜形成表面活性剂分子聚集在界面上，形成紧密吸附层，在分散相表面形成保护层。（2）、界面电荷的影响：O/W 型乳状液油滴多数是带负电的，W/O 型乳状液中水滴则带正电。产生排斥力。（3）、介质黏度：乳化剂能增加乳状液的黏度，增加保护膜的机械强度，则形成的界面膜不易被破坏，并可阻止液珠的聚结。4、破坏乳化剂的方法：（1）、加入表面活性剂（2）离心（3）加电解质（4）加热（5）吸附法破乳（6）高压电破乳（7）稀释法（8）其他途径：超滤、反应萃取、中性磷萃取、脂肪类萃取剂 5、影响乳化剂类型的因素有：（1）乳化和破乳化（2）pH 的影响（3）温度和萃取时间的影响（4）盐析作用的影响（5）溶剂种类、用量及萃取方式的选择 6、影响双水相萃取的因素：（1）成相高聚物的分子量（2）成相高聚物浓度界面张力（3）电化学分配盐类的影响（4）疏水效应（5）温度及其他因素 7、影响超临界流体萃取的因素：（1）压力的影响（2）温度的影响（3）助溶剂（4）物料性质的影响 8 术语 双水相萃取：不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，利用物质在互不相溶的两水相分配系数的差异来进行萃取的方法。双节线：高聚物 P、Q 的浓度均以重量百分含量表示，相图右上部为两相区，右下部为均相区，两相与均相的分界线叫双节线 多级错流萃取：料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取的方法。多级逆流萃取：在第一级中加入料液（F），萃余液顺序作为后一级的料液，而在最后一级加入萃取剂（S），萃取液顺序作为前一级的萃取剂。由于料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。反胶束萃取：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，在有机溶剂内形成聚集体，其中表面活性剂的非极性基团在外，与非极性的溶剂接触，而极性基团在外，形成极性核，从而能够溶解极性物质，进行萃取。超临界流体萃取：（supercritical fluid SCF）是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技术。第五章 沉淀和结晶 1、盐析沉淀是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。基本原理：一、盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互结合。二、中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，疏水区相互作用，使其沉淀。2、影响盐析效果的因素：（1）无机盐的种类（2）溶质（蛋白质）种类的影响（3）蛋白质浓度的影响（4）温度的影响（5）pH 的影响 3、影响沉淀效果的因素：（1）有机溶剂种类及用量（2）pH 的影响（3）温度（4）无机盐的含量（5）某些金属离子的助沉淀作用（6）样品浓度 4、形成过饱和溶液的方法：（1）蒸发法（2）温度诱导法（3）盐析结晶法（4）透析结晶法（5）有机溶剂结晶法（6）等电点法（7）微量扩散法（8）化学反应结晶法（9）共沸蒸馏结晶 5、影响晶体大小的因素：（1）过饱和度：增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，对前者影响较大，过饱和度增加，晶体较细小。（2）温度 快速冷却，达到较高的过饱和度，晶体细小形成针状晶；反之，缓慢冷却得到较粗大的晶体。（3）搅拌速度：搅拌能促进成核和加快扩散，提高晶核长大的速度，过快则晶体会被打碎。经验表明，搅拌速度愈快，晶体愈细。（4）晶种 加入晶种能诱导结晶，还能控制晶体的形状、大小和均匀度。6、等电点沉淀的特点，如何应用 对于两性物质，等电点时净电荷为零，使稳定的双电层及水化膜变弱或破坏，分子间排斥电位降低，吸引力增大，相互聚集，产生沉淀。等电点沉淀法操作简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物质少，常用的纯化方法，主要适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质。应用：胰岛素纯化时，在 pH8。0 除去碱性杂蛋白，调 pH3。0除去酸性杂蛋白，粗提液经此处理后纯度大大提高，有利于后步提取操作。7 术语 Ks 盐析：在一定的 pH 和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析。盐析：在一定离子强度下仅改变 pH 和温度进行盐析。盐析分布曲线：蛋白质沉淀的速度可用dS/dP 对盐饱和度（P）作图表示。蛋白质沉淀的速率开始时十分迅速，以后变慢，从起始沉淀到沉淀结束，形成具有尖峰的曲线。透析结晶法：为了使蛋白质溶解度的变化缓慢而且连续，而进行透析的方法；在盐浓度缓慢降低的结晶情况下，进行透析。第六章 吸附法 1、化学吸附与物理吸附的区别：当吸附剂和吸附物之间作用力是通过分子间引力（范德华力）产生的吸附称为物理吸附，最常见的一种吸附现象。在吸附剂和吸附物之间有电子的转移，发生化学反应而产生化学键，这种吸附称为化学吸附。物理吸附是可逆的，可以是单分子层吸附或多分子吸附，选择性较差。物理吸附与吸附剂的表面积、孔分布和温度等因素有密切的关系。化学吸附的选择性强，即一种吸附剂只对某种或特定几种物质有吸附作用，只能形成单分子层吸附，吸附后较稳定，不易解吸，平衡慢。项目 物理吸附 化学吸附 作用力 范德华 库仑力 吸附力 较小，接近液化热 较大，接近反应热 选择性 几乎没有 有选择性 吸附速度 较快，需要活化能很小 慢，需要较高的活化能 吸附分子层 单分子层或多分子层 单分子层 2、吸附剂及被吸附物的极性对吸附的影响：一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。如活性炭从水中吸附有机化合物；硅胶是极性的，适宜从有机溶剂中吸附极性物质。3、吸附剂用量及吸附剂浓度对于吸附效果的影响：一般吸附物浓度大时，吸附量也大。由于杂质存在，浓度升高后，吸附的杂质量也上升，吸附选择性差。提高吸附选择性，常将料液适当稀释。吸附量是指单位重量吸附剂所吸附物质的量。4 两种以上常用吸附剂的性质，用途。活性炭：吸附能力很强的非极性吸附剂。价格低，来源广。除杂，生化药物的分离。人造沸石：人工合成的无机阳离子交换剂。带正电荷。与钠离子交换。磷酸钙凝胶：吸附作用主要是钙离子与蛋白质负电基团结合。白陶土：活性物质分离纯化的吸附剂，也可作为助滤剂与去除热原的吸附剂。白陶土能吸附分子量较大的杂质，包括导致过敏的物质，常用它脱色。：氧化铝：适用于亲脂性成分的分离价廉，再生容易，活性易控制，操作不便，手续繁琐，处理量有限 硅胶：活性强弱与自由水的含量有关，自由水多，活性低，自由水少，活性高。5、大网格高聚物吸附剂与传统吸附剂相比的优点：选择性好、解吸容易，理化性质稳定，机械强度好，反复使用，流体吸力较小。6 术语：正吸附：吸附提取液中的有效成分。负吸附：去除提取液中的杂质。大网格高聚物吸附剂：与大孔网状离子交换树脂具有相同的大网状骨架，保留离子交换树脂的功能团，性质与活性炭、硅胶等吸附剂相似。第七章 凝胶层析 1、公式 Ve=Vo+KdVi 各字母的含义，凝胶层析的原理。Ve 淋出体积 Vo 粒尖体积 Vi 填料的孔体积 Kd排阻系数或分配系数 凝胶层析原理：平衡排除理论 一个高聚物分子的流出体积是由在宏观的流动相和微观的孔体积中的平衡分配系数所决定的。这里所谓的平衡是指扩散的平衡，即溶质分子扩散进入一个填料颗粒孔中且再出来所需要的时间远小于溶质区段在此停留的时间。换言之，当溶质分子流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。平衡条件只是在流速很慢时一个极端情况。2、常用凝胶的名称、特点及用途。名称 特点 用途 葡 聚 糖 凝 胶（Sephadex G）最常用，稳定，对阳离子轻微吸附，多次重复使用 分离 修饰葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 化学稳定好，成分不易脱落，适用 pH 广，机械强度好，无带电基团，分辨率较高 琼脂糖类凝胶 多孔玻璃微球 化学稳定性高、强度大、高压下操作，好的流速；缺点是对糖类、葡萄糖吸附 疏水性凝胶 只适用分离分子量较小的物质 分离不溶水的有机物质 3、选择凝胶：选择何种凝胶及其型号、粒度，一方面是考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离分子量范围，（渗入限与排阻限），理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意分离目的和样品的性质。4、好的凝胶层析效果如何选柱、装柱。选柱：层析柱的有效体积与柱比的选择必须根据样品的数量、性质及分离目的加以确定。对于类分离，柱床体积一般微样品溶液体积的5 倍或略微多一些就够了，柱比 5：1 或 10：1，对于分级分离，要求柱床体积大于样品体积 25 倍以上，柱比在 25100 之间。底端支持物满足两个条件：不易阻塞，死腔小。装柱：正式装柱前必须检查柱底的凝胶支持物是否符合要求。要求不漏不堵，不吸附样品，且能保持一定的流速。在装柱时，连续搅拌下小心装柱。开始装柱时，避免胶粒直接冲击支持物，空柱种应约留1/5 的水或溶剂。所用的凝胶必须是用相应溶剂系统充分溶胀的。为了防止柱中出现气泡，凝胶悬液温度必须与室温平衡并用水泵减压排气。进胶过程必须连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。5、溶质通过色谱峰时造成的峰加宽效应包括：（1）分子扩散：使用颗粒度小而均匀的填料可以降低扰动作用。（2）涡流扩散：涡流扩散对凝胶色谱峰的加宽比较重要。应用小而均匀的填料紧密地装在内径适当的柱中可以减少由涡流扩散造成的峰加宽，提高效柱。（3）流动相中传质阻力造成的色谱峰加宽。扩散速度越快，流速不平衡的影响就越小。（4）固定相中传质阻力造成的色谱峰加宽。填充介质粒度越小所造成的峰加宽效应也小。溶液在柱外产生的峰加宽：（1）连接管路（2）检测池 6、利用凝胶层析测量蛋白质的分子量。测定的依据是不同分子量的物质，只要在凝胶的分离范围内（渗透限与排阻限之间），洗脱体积 Ve 及分配系数 Kd 值随分子量增加而下降。对于一个特定体系，待测定物质洗脱体积与分子量之间的关系：Ve=-KlgM+C (1)求解法 以两个已知分子量的蛋白质过柱，求出 C和 K，将 待测物的 Ve 代入得到 M。（2）标准曲线法 以多个已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自的 Ve 值。以 Ve 作纵坐标，lgM 作横坐标，制作标准曲线。在同一测定体系中测取未知物质的 Ve，由标准曲线求得分子量。7 术语 柱比：层析柱的长度与直径的比值 操作压：凝胶层析由于进出口之间液位差形成的对凝胶颗粒的压力 内水体积：柱中凝胶颗粒内部所含的液相体积。外水体积：凝胶柱床中凝胶颗粒之间的液相体积。类分离：分开样品分子中分子量悬殊较大的两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。分级分离：分开分子量不很悬殊的大分子物质。排阻系数：表征物质分子进入凝胶颗粒的程度。全渗入：Kd=1 全排阻：Kd=0 分离限.分辨率：R=Ve/(1/2(Wa+Wb)分辨率与洗脱体积的差值成正比，而与两物质的洗脱峰宽度成反比。第 8 章 离子交换 1、离子交换常用洗脱方法：从树脂上洗脱目的物的方法主要有两种：（1）调节洗脱液的 pH，使目的物粒子在此 pH 下失去电荷，甚至带相反电荷，从而丧失与原离子交换树脂的结合力而被洗脱下来。（2）用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。2、离子交换树脂的命名法。举两种树脂骨架。树脂命名编号：强酸类 1100 号，弱酸类 101200 号，强碱类 201300号，弱碱类 301400 号，中强酸 401500。各种树脂除注明类别和编号外，还需标明载体的交联度。书写交联度时，将百分号除去，写在树脂编号后并用乘号“X”隔开。强酸 1X7，交联度为 7%。树脂骨架：（1）苯乙烯型离子交换树脂（2）丙烯酸型阳离子交换树脂（3）多乙烯多胺环氧氯丙烷树脂（4）聚乙烯砒啶系离子交换树脂（5）其他离子交换树脂 蛇笼树脂 选择性离子交换树脂 热再生离子交换树脂 3、离子交换的选择性的因素：一、离子化合价与水合半径的影响 二、离子化合价与离子浓度的影响 三|、交换环境的影响（1）溶液的pH（2）离子强度（3）有机溶剂 四、树脂结构的影响（1）树脂载体交联度（2）辅助力（3）其他结合力 五、偶极离子排斥作用。4、偶极离子的交换特点：净电荷为零时，正电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。钠型树脂，被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂磺酸基的负电荷产生排斥力。偶极离子的排斥作用，所以使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。氢型树脂：由于氨基酸的解离度低，被取代之氢离子为羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶极，故与树脂磺酸基没有排斥力。偶极离子的排斥力随氨基酸的 R 基碳链的加长而减弱。适当增加溶液中离子强度，偶极排斥力减弱。5、大孔、均孔树脂的特点：大孔型离子交换树脂的特征：1 载体骨架交联度高，有较好的化学和物理稳定性及机械强度。2 孔径大，不受环境条件的影响，动力学性能好，抗污染能力强，交换速度快。3表面积大，表面吸附能力强，对大分子物质的交换容量大 4 孔隙率大，比重大，对小离子的体积交换量比凝胶型树脂小。均孔树脂的特点：主要为阴离子交换树脂，骨架的交联度比较均匀，孔径大小一致，重量和体积交换容量都较高，膨胀度、相对密度适中、机械强度好、抗污染和再生能力强。6、离子交换纤维素的特点及洗脱。离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；分辨率强，能分离复杂的生物大分子混合物。洗脱：对离子交换纤维素进行吸附后的洗脱一般比从离子交换树脂的洗脱缓和。升高环境的 pH 或是降低环境的 pH 或增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。7、酸碱性蛋白选择合适的离子交换纤维素。酸性蛋白质（等电点约 pH5），作为一个阴离子，它的 DEAE-纤维素柱层析可在 pH5。59。0 之间进行，蛋白质和交换剂都是解离的，带有相反的电荷。在 CM-纤维素上层析则需限制在（pH3.54.5）之间。碱性蛋白质（等电点约 pH8）作为一个阳离子，用羧甲基纤维素层析可在 pH3.7.5 进行。8、离子交换聚焦色谱的原理：（1）pH 梯度的形成：色谱聚焦利用离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用，当洗脱缓冲液不断滴到离子交换柱上时，柱内自动形成pH 梯度。（2）蛋白质的色谱行为：蛋白质所带电荷取决与他们的等电点和介质的 pH.当介质的 pH 低于它的等电点时，蛋白质带正电荷，它不与阴离子交换剂结合，随洗脱液向下移动。（3）聚焦效应：当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处，移动速度明显减慢。加上相同的第二个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直到追到正在慢移的第一个样品成分处（聚焦）。然后这两个样品一起下移，往柱下一起洗脱出来。所有的样品必须在第一个样品峰尚未被洗脱前加入。9 举例三种常用离子交换树脂和离子交换纤维素。大孔型强酸型离子交换树脂 大孔型弱酸型离子交换树脂 大孔型弱碱型离子交换树脂 甲基磺酸纤维素 乙基磺酸纤维素 二乙基氨基乙基纤维素 苄基化的 DEAE 纤维素 10、术语：CM-C：羧甲基纤维素。DEAE-C：二乙氨基乙基纤维素。PBE94：多缓冲交换剂 尼柯尔斯方程：m1(1/z1)/m2(1/z2)=K c1/c2.交换容量：meq/g(毫克当量/克树脂)树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。偶极离子排斥：被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂之负电荷产生排斥力。蛇笼树脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型阴离子交换树脂中聚合而成的一类树脂。第九章 亲和层析 1、亲和层析原理，主要特点。利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一型可逆结合的特性。主要特点：经过一此简单的处理就可以获得所需的高纯度活性物质。对设备要求不高，操作简便，使用范围广，特异性强，分离速度快，分离效果好，分离条件温和。缺点是吸附剂的通用性较差。2、选择配基的注意点：（1）配基与配体由足够大的亲和力（2）配基与配体的结合应是专一的（3）配基应具有化学活性。3、手臂，其长短与亲和层析的效果的联系，为什么。由于酶的活性中心常是埋藏在其结构的内部，它们与介质的空间障碍影响其与亲和配基的结合作用。在载体和配基之间插入手臂，以消除空间障碍，手臂的长度是有限的，太短不能起消除空间障碍的作用，太长会使非特异性性吸附增加。4、制作高亲和力的亲和吸附剂:提高亲和层析效果，固定相的配基和流动相的配基具有较强的亲和力。配基浓度对亲和力的影响。为了将亲和配体和其他物质分开，在实际亲和层析时，通常需要阻流值10。空间障碍的影响：插入适当长度的手臂。配基与载体的结合位点的影响。载体孔径的大小对吸附剂的亲和能力有决定性的作用。微环境的影响，包括载体及手臂的电性、极性、次级键对配基亲和力的影响。5、非专一性吸附包括那些：如何克服。亲和层析中的非专一性吸附有以下情况：（1）离子情况（2）疏水基团 a 长的烃类结构的“手臂”b 疏水性配基（3）复合亲和力 确定离子强度以获得良好的分离效果 6、亲和层析洗脱方法：（1）非专一性洗脱 改变洗脱剂的 pH 以影响电性基团的解离程度而洗脱（2）特殊洗脱（3）专一性洗脱 竞争性效应 非竞争性效应 反竞争性效应 7、二次作用亲和沉淀:利用在物理场（如 pH、离子强度、温度和舔加金属离子等）改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。亲和介质结合目的分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法。8、亲和膜分离原理及特点：亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。优点：（1）传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高。（20压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。缺点：理论塔板很低，吸附和清洗率低。9 术语：亲和力：配基对互补分子间的作用力，是制备高效亲和柱的重要参数。亲和吸附剂：载体配基。配基：在亲和层析中起可逆结合的特异性物质。阻流值：Ve/Vo。正洗脱：吸附提取物中的有效成分。负洗脱：去处提取物中的杂质。金属螯合层析：利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。有机染料亲和层析：有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+的结构，一些需要核酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具有一定的亲和力，将这些染料共价偶联到纤维素或琼脂等多糖载体上，就制得亲和层析柱。亲和错流过滤：(affinity cross flow filtration)ACFF 将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。亲和萃取：利用偶联亲和配基的 PEG 为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和作用下促进目标产物在 PGE 相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。亲和反胶团萃取：是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如 AOT）外，舔加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。第十章 离心技术 1、相对离心力：（RCF）离心力与重力的比值。用符号“g”或“g”表示。RCF=11.18 106N2r(g)2、离心机转子有几种，各自特点。（1）角度转子：机械强度高，重心低，运转平稳，寿命长，管内温度分布均匀，温差对流小，离心时间短，使用方便，但离心管外壁易产生强烈对流和涡流，同时管外侧会出现沉淀，形成壁效应。（2）水平转子：结构复杂，加工困难，机械强度低，重心高，容量小，低速运转时易摇摆，离心时间长，寿命短而价格高。对流作用小，“壁效应”弱。（3）区带转子：Anderson 转子，无离心管，“十”字隔板将样品槽分为四个扇形室。无壁效应，适用于大量样品的密度梯度及等密度梯度离心。配有附属设备和仪器，操作过程复杂，设备较贵，但离心机使用效率高。（4）垂直管转子：特殊类型的定角转子。离心时的碰撞及温差引起的对流不显著。颗粒沉降时间短，可用于差速、密度梯度及等密度离心，用于平衡等密度离心时效果最佳。（5）连续离子转子：低速或高速离心机转子，可用于超速离心机。结构简单，低速时加样，高速时排出清夜。用于实验室，也可用于小规模生产，最适宜自培养液中收集菌体及细胞。（6）细胞洗脱转子：低速离心时连续分离型转子，最高转速不超过6000r/min。最适于自动植物培养液或发酵液中连续分离单细胞和菌体，回收浓度及回收率均较高。3、速度区带离心的特点及其用途：离心操作时将样品液置于连续或不连续线形或非线形密度梯度液上，控制离心时间，使所需组分通过部分梯度液，形成的分离区带在达到其等密度区之前即停止离心。速度区带离心的特点：（1）样品加于梯度介质的顶步、离心时间需严格控制。（2）介质的密度需严格掌握：梯度最大值组分最小密度（3）样品的密度10 柱填料 30、5、10m 全多孔或30m 薄壳型 10、50m 全多孔 流动相流速（ml/min）1 10 流动相线速度（cm/s）0.11 0.010.5 样品体积（l）1000 要求的检测灵敏度 高 低 注射的样品量（mg）100 7、术语 塔板理论：塔板理论把色谱柱看作一个分馏塔，有如下基本假设：（1）色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔板组成。在柱内每层塔板内部，组成能够在流动相和固定相中达到平衡。（2）流动相通过色谱柱呈间歇式前进运动，每次前进为一个塔板体积。（3）样品和流动相同时加在第一个塔板上，且样品垂直于前进方向的扩散（纵向扩散）可以忽略。（4）分配系数在各塔板上是常数。速率理论：在低流速时增加流速，峰变锐，柱效增加；当超过一定流速时峰变钝，柱效降低。用塔板高度 H 对载气流量作图为二次曲线，曲线最低点对应的塔板高度最小，柱效最高，此时流速为最佳流速（最佳）其数学表达式为 H=A+B/+C 容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中的总摩尔数之比。00tttkR 选择因子：表示柱对难分离物质的选择性的好坏。12kk 综合表达式：212211(41NkkRs）（第十三章 生化药物 1、生化药物的特点及主要资源。(主要资源：（1）氨基酸类药物（2）多肽与蛋白质类（3）核酸类药物（4）酶类药物（5）糖类药物（6）脂类药物（7）维生素及辅酶类 药理学特性：（1）药理活性高（2）治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠。（3）毒副作用较少，营养价值高。（4）生理副作用常用发生。理化特性：（1）生物材料中的有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。（2）生物活性物质组成结构复杂、稳定性差。（3）生物材料易染菌，腐