非洲猪瘟病毒p72蛋白可溶性表达及鉴定.pdf

动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e非洲猪瘟病毒p 蛋白可溶性表达及鉴定收稿日期:基金项目:江苏省重点研发计划(现代农业)重点项目(B E ,B E );江苏省农业自主创新资金项目(C X();扬州大学科技创新团队项目()作者简介:黄霞(),女,江苏常州人,博士研究生,主要从事非洲猪瘟免疫逃逸机制及疫苗研究.通讯作者黄霞,康喜龙,韩顺子,孟闯,潘志明,焦新安(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/扬州大学农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室/扬州大学农业与农产品安全国际合作联合实验室,江苏扬州 )摘要:为获得可溶性的非洲猪瘟病毒(A S F V)p 蛋白,将重组质粒p C o l d p 分别与种分子伴侣质粒进行融合表达,S D S P AG E鉴定表达产物;以重组蛋白H i s p 免疫小鼠制备多克隆抗体,通过W e s t e r nb l o t和间接免疫荧光方法鉴定多克隆抗体与真核表达蛋白的免疫反应性.结果显示,重组蛋白H i s p 与伴侣蛋白p G T f 或p T f 共表达后,实现了可溶性表达.以可溶性H i s p 蛋白免疫小鼠后,获得H i s p 多克隆抗体,抗体效价达到 ;W e s t e r nb l o t和间接免疫荧光的试验结果显示多抗血清可特异性识别真核表达的p 蛋白.说明利用分子伴侣融合表达的A S F Vp 可溶性蛋白具有较好的免疫反应性,为抗A S F V药物的研发提供了候选蛋白.关键词:非洲猪瘟病毒;p 蛋白;分子伴侣;可溶性表达;多克隆抗体中图分类号:S ;S 文献标识码:A文章编号:()非洲猪瘟(A f r i c a ns w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s,A S F V)引起的猪高致死性出血性疾病,在我国被列为一类动物疫病.自 年月传入我国以来,迅速蔓延全国,对我国的养猪业造成了严重的经济损失.现今在尚无安全有效疫苗的情况下,许多学者将目光投向了抗病毒药物,以期为A S F V的防控提供新思路,小分子抑制剂就是其中一类具有潜力的靶向药物.A S F V属于非洲猪瘟病毒科,是非洲猪瘟病毒属的唯一成员,系目前已知唯一由虫媒介导的大型双链D NA囊膜病毒.根据不同毒株,A S F V基因组的长度约为 k b,有 个开放阅读框(o p e nr e a d i n gf r a m e,O R F),可编码 种蛋白质.其中,由B L基因编码的p 蛋白,是A S F V的重要结构蛋白.由于其具有构象中和表位和抗原性稳定,常被用作血清学检测和免疫制剂的靶标 ,而p 蛋白三维结构的成功解析也使得其成为了小分子抑制剂的重要靶标.原核表达系统具有低成本、易操作、可大量制备目的蛋白等优点,一直是表达外源蛋白的首选方案.然而也存在外源蛋白易形成包涵体等问题.已有研究表明p 蛋白在大肠埃希氏菌表达系统,如p E T c()、p C o l d 等中均以包涵体形式表达,这为后期的蛋白纯化和变复性造成困难,并且通过复性得到的蛋白也很难保证其活性 .本研究以我国流行的非洲猪瘟病毒A n h u i X C GQ毒株p 全长基因为研究对象,通过分子克隆构建p C o l d p 原核表达质粒,将完整的p 蛋白分别与种分子伴侣在大肠埃希氏菌中共表达,从而使p 蛋白以可溶性形式表达,为抗A S F V药物的研发提供候选抗原蛋白,同时也为进一步研究p 蛋白的生物学功能研究奠定基础.材料与方法材料菌株、质粒、细胞及实验动物引物及基因序列合成工作由南京金斯瑞公司生物科技公司完成;HE K T细胞、B L (D E)(p G E X P p )重组菌、p C o l d载体、p CMV m y c表达载体及p CMV m y c p 质粒由江苏省人兽共患病学重点实验室保存;Ec o i lDH 和B L (D E)感受态细胞,南京诺唯赞 生 物 公 司 产 品;分 子 伴 侣p K J E、p G K J E、p G r o、p G T f 和p T f 感受态细胞,宝生物工程(大连)有限公司产品;周龄雌性B a l b/c小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物实验均通过扬州大学伦理委员会的审查.主要试剂琼脂糖凝胶回收试剂盒、限制性内切酶、P r i m e s t a rm a xD NAP o l y m e r a s e,宝生物工程(大连)有限公司产品;C l o n ee x p r e s s o n es t e pc l o n i n g一步法连接试剂,南京诺唯赞生物公司产品;快速质粒小提试剂盒,北京天根生物科技有限公司产品;I P T G、L 阿拉伯糖(L A r a b i n o s e)、四环素(T e t r a c y c l i n e)、氨苄青霉素,生工生物工程(上海)股份有 限 公 司 产 品;A n t i H i st a ga n t i b o d y,瑞 士R O CHE公司产品;羊抗鼠酶标二抗,德国C a l b i o c h e m公司产品;H i sB i n dP u r i f i c a t i o nK i t,N o v a g e n公司产品;A l e x aF l u o r 标记的山羊抗小鼠I g G(HL)及W e s t e r nb l o t细胞裂解液,碧云天公司产品;L i p o f e c t a m i n eTM ,美国I n v i t r o g e n公司产品.主要仪器P C R仪、G E L D o c 凝胶成像分析系统和蛋白质电泳仪,美国B i o R e d公司产品;Am e r s h a mI m a g e r 拍照系统,美国G EH e a l t h c a r e公司产品;细胞恒温培养箱,T h e r m o公司产品.方法重组表达质粒的构建及鉴定根据A S F VA n h u i X C GQ株p 密码子优化后的基因序列设计P C R引 物,H i s p F:AT G GAG C T C G G T A C C C T C GAGAT G G C GAG C G G T G G C G C G T T C T (下划线部分为X h o酶切位点);H i s p R:AG C AGAGAT T A C C T AT C T AGAT T AG G T G C T AT AA C G C AG C A C C G (下 划 线 部 分 为X b a酶切位点).以密码子优化的基因序列为模板,扩 增 出 目 的 片 段,聚 合 酶 链 反 应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n,P C R)扩增程序为:s、s、m i n,共 个循环;P C R产物经 g/L琼脂糖凝胶电泳验证正确后,对目的片段进行回收纯化.使用限制性内切酶X h o和X b a对p C o l d载体质粒进行双酶切.通过C l o n e e x p r e s so n es t e pc l o n i n gk i t连接目的片段与线性化质粒p C o l d,并转化至大肠埃希氏菌感受态细胞DH 中;随机挑选单菌落接菌提取质粒,酶切验证正确后,进行测序鉴定,测序正确的重组质粒命名为p C o l d p .将验证正确的重组质粒和空载体质粒分别转化至含伴侣质粒的感受态细胞中,通过含氯霉素(m g/L)和氨苄青霉素(m g/L)的双抗性L B平板筛选阳性克隆并进行P C R验证,获得的阳性菌分别命 名 为p C o l d p p K J E、p C o l d p p G K J E、p C o l d p p G r o、p C o l d p p G T f 和p C o l d p p T f .可溶性表达体系的建立及筛选对p C o l d p p K J E、p C o l d p p G K J E、p C o l d p p G r o、p C o l d p p G T f 和p C o l d p p T f 进行诱导表达,程序如下:过夜培养的菌液以 m L/L接种量接种至L B液体培养基(含氨苄青霉素 m g/L和氯霉素 m g/L),同时根据伴侣质粒种类加入不同诱导剂,即含p G T f 质粒需加入g/LT e t r a c y c l i n e,含p G K J E 伴侣质粒需加入L A r a b i n o s e和g/LT e t r a c y c l i n e,其余种菌株培养基中均需加入L 阿拉伯糖,并设置不同L 阿拉伯糖浓度组别、g/L;当菌液的O D n m值达到时,静置培养 m i n,并添加终浓度为mm o l/L的I P T G,在 条件下诱导表达目的蛋白,诱导时长为 h.收集细菌菌体,以P B S洗涤菌体次后,按照 比例加入P B S重悬菌体,超声破碎菌体;于、r/m i n离心 m i n,分别收取诱导后各表达菌株的上清和沉淀,通过S D S P AG E观察并确定有效的伴侣蛋白.可溶性重组蛋白的纯化及鉴定p C o l d p p T f 诱导表达后,收集菌体,用 倍体积纯化用的B i n d i n gb u f f e r重悬菌体.超声裂解重悬的菌体,收集上清.按照H i sB i n dP u r i f i c a t i o nK i t纯化步骤纯化H i s p 蛋白,并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s,S D S P AG E)及W e s t e r nb l o t进行鉴定分析.多克隆抗体的制备及鉴定以纯化的可溶性蛋白H i s p 作为抗原,以常规程序及方法免疫小鼠,制备多克隆抗体.以纯化的G S T p 蛋白为包被抗原,采用间接酶联免疫吸附试验(e n z y m e l i n k e di mm u n o s o r b e n ta s s a y,E L I S A)测 定 抗 体 效 价,以P B S免疫组血清为阴性对照,计算抗体效 价.以H i s p 和G S T p 为检测抗原,进行S D S P AG E电泳,以 稀释的多抗血清作为一抗,使用羊抗鼠酶标二抗(稀释)作为二抗,对多克隆抗体进行W e s t e r nb l o t鉴定.多克隆抗体的应用评价在 孔细胞培养板中 接 种HE K T细 胞,其 细 胞 密 度 生 长 至 时,利用L i p o f e c t a m i n eTM 分别将p CMV m y c和p CMV m y c p 重 组 质 粒 转 染 至HE K T细胞,转染后细胞置于、体积分数为的C O培养箱培养 h.弃去细胞培养液上清,P B S轻柔清洗遍,加入冰甲醇,在室温下固定细胞 m i n,P B S清洗遍;以 m g/m LB S A的P B S封闭h,加入多抗血清()作为一抗,孵育黄霞等:非洲猪瘟病毒p 蛋白可溶性表达及鉴定过夜;P B S洗涤细胞次,加入A l e x aF l u o r 标记的山羊抗小鼠I g G(HL)二抗(),在 的条件下,避光孵育h;以P B S洗涤次后,m L/L甘油将细胞封片,于荧光显微镜下观察结果.同时,将p CMV m y c和p CMV m y c p 质粒以同样方法转染HE K T细胞 h后,P B S清洗次,使用W e s t e r nb l o t裂解液裂解细胞,于、r/m i n离心m i n,取细胞裂解液上清,加入S D S P AG E蛋白上样缓冲液,于 加热 m i n,进行S D S P AG E电泳分离蛋白.将蛋白转印至N C膜上,以封闭液(m L/L脱脂奶的P B S T)室温封闭h;P B S T清洗N C膜遍,以 稀释的多抗血清作为一抗,摇床孵育过夜;P B S T清洗遍,使用羊抗鼠酶标二抗(稀释)作为二抗,室温孵育h;再以P B S T清洗遍后,最后使用E C L底物进行显色检测.结果重组表达质粒的构建及鉴定以合成的含p 基因的质粒为模板扩增A S F VB L基因,电泳结果显示,在约 b p处出现特异性条带(图),条带大小与预期一致.重组表达质粒p C o l d p 双酶切鉴定正确后(图),经测序鉴定,基因序列正确,表明成功构建重组表达质粒p C o l d p .MD NA标准D L ;P C R扩增产物MD NA M a r k e rD L ;P C Rp r o d u c t图A S F VB L基因的P C R产物电泳分析F i g E l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so fA S F VB Lg e n eP C Rp r o d u c t可溶性体系的建立及筛选分别将含伴侣质粒并转入p C o l d p 的重组表达菌进行诱导表达,S D S P AG E结果显示,不含伴侣质粒的p C o l d p 诱导表达后在约 k u处出现明显的目的蛋白条带(图 A),主要以包涵体形式表达.含有不同伴侣质粒的种共表达菌株均可表达p 蛋白.其中,含p K J E、p G K J E 及p G r o 分子伴侣的表达菌株诱导表达后,目的蛋白仍主要为包涵体形式存在,受诱导物浓度影响不大(图 B图 D).而重组质粒p C o l d p 与伴侣质粒p G T f 或p T f 共表达后,上清中可见大小为 k u的目的蛋白条带,说明使用分子伴侣p G T f 和p T f 共表达可促进目的蛋白的可溶性表达(图 E和图 F).分别在培养基中加入、g/L的L 阿拉伯糖诱导含p T f 伴侣质粒的共表达菌株,结果显示随着L 阿拉伯糖浓度的增加,目的蛋白p 的表达量逐渐降低,在L 阿拉伯糖浓度为g/L时,p 蛋白表达量最高,故本研究选用了g/L作为后续试验浓度(图 F).M D NA标准D L ;重组质粒M D NA M a r k e rD L ;R e c o m b i n a n tp l a s m i d图双酶切鉴定重组质粒p C o l d p F i g I d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i dp C o l d p b yd o u b l ee n z y m ed i g e s t i n可溶性蛋白的纯化及鉴定按照H i sB i n dP u r i f i c a t i o nK i t的说明书对p C o l d p p T f 表 达 的H i s p 蛋 白 进 行 纯化,并进行S D S P AG E鉴定.结果显示含伴侣质粒p T f 的表达菌裂解上清可纯化到约 k u的目的蛋白,纯度较高(图 A).以鼠源抗H i s标签抗体作为一抗对蛋白进行W e s t e r nb l o t分析,结果显示与伴侣质粒共表达的可溶性目的蛋白可与H i s标签抗体结合,特异性良好(图 B).多克隆抗体的制备及鉴定采用间接E L I S A方法测定制备的p 多克隆抗体效价,其效价为 .W e s t e r nb l o t结果表明,分别在 k u和 k u处观察到H i s p 蛋白和G S T p 蛋白(图),表明经H i s p 蛋白免疫的小鼠血清可特异性地识别p 蛋白.多克隆抗体的应用评价通过W e s t e r nb l o t和间接免疫荧光检测多克隆抗体与真核表达的p 蛋白的免疫反应性,W e s t e r nb l o t结果显示多抗血清可特异性识别大小约为 k u的p 蛋白(图 A);间接免疫荧光检测结果显示,多抗血清能够在HE K T细胞中特异性识别表达的p 蛋白(图 B).动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)Ap C o l d p 的表达;Bp C o l d p p K J E 的表达;Cp C o l d p p G K J E 的表达;Dp C o l d p p G r o 的表达;Ep C o l d p p G T f 的表达;Fp C o l d p p T f 的表达;M蛋白分子质量标准;空载体诱导上清;空载体诱导沉淀;重组菌未诱导上清;重组菌未诱导沉淀;、重组菌诱导上清;、重组菌诱导沉淀AE x p r e s s i o no f p C o l d p ;BE x p r e s s i o no f p C o l d p p K J E;CE x p r e s s i o no f p C o l d p p G K J E;DE x p r e s s i o no f p C o l d p p G r o;EE x p r e s s i o no f p C o l d p p G T f;FE x p r e s s i o no f p C o l d p p T f ;MP r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h tM a r k e r;S u p e r n a t a n t o f i n d u c e de m p t yv e c t o r;P r e c i p i t a t eo f i n d u c e de m p t yv e c t o r;S u p e r n a t a n to fn o n i n d u c e dr e c o m b i n a n tb a c t e r i a;P r e c i p i t a t eo fn o n i n d u c e dr e c o m b i n a n tb a c t e r i a;,S u p e r n a t a n to f i n d u c e dr e c o m b i n a n tb a c t e r i a;,P r e c i p i t a t eo f i n d u c e dr e c o m b i n a n tb a c t e r i a图不同重组菌株中H i s p 蛋白表达的S D S P A G E分析F i g S D S P A G Ea n a l y s i so fH i s p p r o t e i n i nd i f f e r e n t r e c o m b i n a n te x p r e s s i o ns t r a i n sAS D S P A G E;B W e s t e r nb l o t;M蛋白分子质量标准;纯化蛋白;空载体诱导全菌;重组菌未诱导全菌;重组菌诱导全菌AS D S P A G E;B W e s t e r nb l o t;M P r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h tM a r k e r;P u r i f i e dp r o t e i n;I n d u c e de m p t yv e c t o r;N o n i n d u c e dr e c o m b i n a n tb a c t e r i a;I n d u c e dr e c o m b i n a n tb a c t e r i a图可溶性蛋白H i s p 的纯化与鉴定F i g P u r i f i c a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no f s o l u b l eH i s p p r o t e i n黄霞等:非洲猪瘟病毒p 蛋白可溶性表达及鉴定M蛋白分子质量标准;H i s p 蛋白;H i s p 蛋白;G S T p 蛋白MP r o t e i n m o l e c u l a rw e i g h tM a r k e r;H i s p p r o t e i n;H i s p p r o t e i n;G S T p p r o t e i n图多克隆抗体的W e s t e r nb l o t鉴定F i g W e s t e r nb l o t i d e n t i f i c a t i o no fp o l y c l o n a l a n t i b o d i e s讨论作为A S F V最主要的衣壳蛋 白,p 蛋白在A S F V感染的晚期阶段产生,在病毒结合与进入细胞过程中起着重要的作用.p 蛋白序列高度保守,可诱导机体产生较强的免疫应答.年清华大学向烨团队使用冷冻电镜解析了p 蛋白的三维结构,发现p 分子可形成稳定的三聚体,位于三聚体折叠片之间的插入片段形成一个螺旋桨样的顶部结构延伸向病毒外部,这极可能是细胞表面受体结合区域.这一发现使得p 蛋白成为目前最有前景的抗A S F V作用靶点之一.因此,p 蛋白的正确折叠将有 助于靶向病 毒 衣 壳 组 装 药 物 的研发.A W e s t e r nb l o t;B间接免疫荧光;M蛋白分子质量标准;p CMV m y c p ;p CMV m y cA W e s t e r nb l o t;BI n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c e;MP r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h tM a r k e r;p CMV m y c p ;p CMV m y c图多克隆抗体与真核表达蛋白反应性鉴定F i g I d e n t i f i c a t i o no f r e a c t i v i t yo fp o l y c l o n a l a n t i b o d i e sw i t he u k a r y o t i ce x p r e s s e dp r o t e i n s目前已有多项研究表明,利用大肠埃希氏菌表达系统可成功在体外诱导表达p 蛋白.李文傲构建了重组表达菌B L (p E T a p ),在尝试更换表达载体及降低诱导温度后仍未获得可溶性表达蛋白;曹云雷等 将A S F Vp 全长连入p C o l d表达载体,经mm o l/LI P T G于 诱导 h后,获得包涵体形式蛋白.分子伴侣是一类可通过去折叠、降解、标记目的蛋白的错误折叠,从而促进表达可溶 性 的 蛋 白 质,且 不 影 响 目 的 蛋 白 的 生 物 活性.N a nL等 和夏霖亚等 均发现分子伴侣可促进猫细小病毒及犬细小病毒在大肠埃希氏菌中的可溶性表达,但该技术并未应用于A S F Vp 蛋白的表达.故本研究将重组质粒p C o l d p 与种分子伴侣质粒共表达,并对诱导物L 阿拉伯糖浓度进行了摸索.结果显示p G T f 和p T f 伴侣质粒可促进p 蛋白的可溶性表达,且在L 阿拉伯糖浓度为g/L时,p T f 伴侣质粒促进p 蛋白可溶性表达效果最为明显.在对p C o l d p p T f 和p C o l d p p G T f 进行表达纯化时发现,经p C o l d p p G T f 获得的p 蛋白纯度及浓度都较低;而p C o l d p p T f 虽能获得高浓度的p 蛋白条带,但含有伴侣蛋白条带,通过优化纯化条件可提高p 蛋白的纯度.近年来,随着A S F V结构解析、编码蛋白鉴定等研究的突破,小分子药物的研发为A S F V的防控提供了新的思路.在抗A S F V药物研发中,药物作用靶 点 至 关 重 要.目 前 研 究 发 现 包 括p S R、p E R、p 以及p A R等在内的多种蛋白参与A S F V复制、转录和修复等过程,并在不同毒株中高度保 守,具 有 靶 标 药 物 研 发 前 景.其 中 就 以p S R等展开了药物筛选,虽然研究仅限于体外,但仍然为A S F V的防控带来了新希望.p 蛋白是现今解析较为明确的A S F V重要结构蛋白之一,但包涵体表达形式使得其难以应用于小分子药物的筛选.本试验通过将p C o l d p 与分子伴侣质粒共表达,成功获得了可溶性表达的p 蛋白,为小分子药物的筛选提供了候选蛋白.参考文献:李鹏昊,梁严予,王彦伟,等非洲猪瘟病毒K R和A L蛋白的可溶性表达及酶活力分析J生物技术通报,():动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)刘邦佐非洲猪瘟病毒p S R重组蛋白的表达与小分子抑制剂E 对其酶活性影响的初步评价D辽宁沈阳:沈阳农业大学,A L ON S OC,B O R C A M,D I XONL,e ta l I C TVv i r u st a x o n o m yp r o f i l e:A s f a r v i r i d a eJJG e nV i r o l,():Y E ZR,R O D RI GU E ZJM,NO GA LML,e t a l A n a l y s i so ft h ec o m p l e t en u c l e o t i d es e q u e n c eo fA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u sJ V i r o l o g y,():郭怡德,李冰,蔡汝健,等非洲猪瘟病毒蛋白功能研究进展J动物医学进展,():N E I L ANJG,Z S AKL,L UZ,e ta l N e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e st oA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u sp r o t e i n sp ,p ,a n dp a r en o ts u f f i c i e n t f o ra n t i b o d y m e d i a t e dp r o t e c t i o nJ V i r o l o g y,():GA R C I A B A R R E NOB,S AN ZA,NO GA L M L,e ta l M o n o c l o n a l a n t i b o d i e so fA f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s:a n t i g e n i cd i f f e r e n c e sa m o n gf i e l dv i r u si s o l a t e sa n dv i r u s e sp a s s a g e di nc e l lc u l t u r eJJV i r o l,():王艳芳,周雅坪,张新竹,等四种分子伴侣促进牛支原体膜蛋白在大肠杆 菌中可溶性表 达研究J中 国 农 业 大 学 学 报,():李文傲非洲猪瘟病P 蛋白单克隆抗体的制备D河北秦皇岛:河北科技师范学院,曹云雷,高飞,李国新,等非洲猪瘟病毒p 蛋白原核表达及多克隆抗体的制备J/O L中国动物传染病学报,:黄剑,徐晶晶,程雪飞,等非洲猪瘟病毒p 蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备J中国动物传染病学报,():L I U Q,MAB,Q I AN N,e ta l S t r u c t u r eo f t h eA f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u sm a j o rc a p s i dp r o t e i np J C e l lR e s,():柏玲,朱言柱,潘悦,等种分子伴侣对水貂阿留申病毒核衣壳蛋白V P 部分基因可溶性表达的影响J中国兽医学报,():NANL,L I UY,J IP,e t a l T r i g g e r f a c t o ra s s i s t e ds e l f a s s e m b l yo f c a n i n ep a r v o v i r u sV P p r o t e i ni n t ov i r u s l i k ep a r t i c l e si nE s c h e r i c h i ac o l iw i t hh i g hi mm u n o g e n i c i t yJ JV i r o l,():夏霖亚,吴铭洁,王蕾,等种分子伴侣促进猫细小病毒样颗粒可溶性表达的研究J黑龙江畜牧兽医,():,周彦铸,朱羽婕,张彤彤,等抗非洲猪瘟病毒药物靶点及抗病毒活性物质研究进展J/O L病毒学报,:L I UB,C U IY,L UG,e t a l S m a l lm o l e c u l e i n h i b i t o rE e x h i b i t i n gt h ea c t i v i t ya g a i n s tA f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u sp S RJB i o o r gM e dC h e m,:S o l u b l eE x p r e s s i o na n dI d e n t i f i c a t i o no fA f r i c a nS w i n eF e v e rV i r u sp P r o t e i nHUANGX i a,KANGX i l o n g,HANS h u n z i,ME NGC h u a n g,P ANZ h i m i n g,J I AOX i n a n(J i a n g s uK e yL a b o r a t o r yo fZ o o n o s i s,Y a n g z h o uU n i v e r s i t y/J i a n g s uC o I n n o v a t i o nC e n t e r f o r t h eP r e v e n t i o na n dC o n t r o l o fI mp o r t a n tA n i m a l I n f e c t i o u sD i s e a s e sa n dZ o o n o s i s/K e yL a b o r a t o r yo fP r e v e n t i o na n dC o n t r o l o fB i o l o g i c a lH a z a r dF a c t o r s(A n i m a lO r i g i n)f o rA g r i f o o dS a f e t ya n dQ u a l i t y,M i n i s t r yo fA g r i c u l t u r e,Y a n g z h o uU n i v e r s i t y/J o i n t I n t e r n a t i o n a lR e s e a r c hL a b o r a t o r yo fA g r i c u l t u r ea n dA g r i p r o d u c tS a f e t yo ft h eM i n i s t r yo fE d u c a t i o n,Y a n g z h o uU n i v e r s i t y,Y a n g z h o u,J i a n g s u,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t oo b t a i ns o l u b l ep p r o t e i no fA f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s(A S F V),t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp C o l d p w a sf u s e da n de x p r e s s e dw i t hf i v ek i n d so fm o l e c u l a rc h a p e r o n ep l a s m i d s,a n dt h ee x p r e s s i o np r o d u c t so fd i f f e r e n te x p r e s s i o ns t r a i n sw e r e i d e n t i f i e db yS D S P AG E T h em i c ew e r e i mm u n i z e dw i t ht h er e c o m b i n a n tp r o t e i n H i s p t op r e p a r ep o l y c l o n a la n t i b o d y,a n dt h ei mm u n o r e a c t i v i t yo ft h ep o l y c l o n a l a n t i b o d i e sw i t he u k a r y o t i ce x p r e s s i o np r o t e i nw a sd e t e c t e db yW e s t e r nb l o t a n d i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y s A sr e s u l t s,t h es o l u b l ee x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i nH i s p w a so b t a i n e db yc o e x p r e s s i o nw i t hp a r t n e rp l a s m i d sp G T f o rp T f A f t e ri mm u n i z i n gm i c ew i t hs o l u b l eH i s p p r o t e i n,t h eH i s p p o l y c l o n a l a n t i b o d yw a so b t a i n e d,a n d t h e a n t i b o d y t i t e r r e a c h e d:T h e r e s u l t so fW e s t e r nb l o t a n d i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c es h o w e dt h a t t h ep o l y c l o n a l a n t i b o d ys e r u mc a ns p e c i f i c a l l yr e c o g n i z e t h ee u k a r y o t i ce x p r e s s e dp p r o t e i n I nc o n c l u s i o n,t h es o l u b l eA S F Vp p r o t e i ne x p r e s s e db yf u s i n gw i t hm o l e c u l a rc h a p e r o n eh a sg o o d i mm u n o r e a c t i v i t y,a n dc a np r o v i d et h ec a n d i d a t ep r o t e i nf o r t h ed e v e l o p m