酶联免疫吸附实验专家讲座.pptx

第一部分第一部分:基本试验原理基本试验原理基本原理 先将已知抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性，将待检标本和酶标抗原或抗体按不一样时骤与固相载体表面吸附抗体或抗原进行反应，用洗涤方法分离抗原抗体复合物和游离成份，然后加入酶作用底物催化显色，进行抗原或抗体定性或定量检测。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第1页第二部分:惯用试验方法一、间接法 此法惯用于测抗体。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含对应抗体）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测定（图1）。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第2页图1:间接法测抗体示意图固相抗原待测标本(含对应抗体)酶标抗抗体研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第3页第二部分:惯用试验方法二、双抗体夹心法 此法惯用于测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含对应抗原）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和底物显色进行测定（图2）。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第4页 图2:双抗体夹心法测抗原示意图研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第5页第二部分:惯用试验方法三、竞争法 此法惯用于测抗原和半抗原，也用于测抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分离，最终结合于固相酶标抗原与待测抗原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原颜色反应差数是待测抗原含量（图3）。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第6页图3:竞争法测抗原示意图研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第7页第三部分第三部分:方法特点和进展方法特点和进展 ELISA方法因为灵敏、特异，操作简便、灵敏、特异，操作简便、快速，试验设备要求较为简单，应用范围快速，试验设备要求较为简单，应用范围广泛，无放射性污染广泛，无放射性污染等优点，成为当前普及应用最广，发展最快免疫学技术之一。生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中应用常见技术（BAS-ELISA），其中ABC-ELISA法更为惯用，其基本原理为，固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素-酶标生物素复合物+底物显色。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第8页第四第四.一部分一部分:人人TNF-检测试验检测试验原理原理基本试验原理:双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-单抗包被于酶标板上，标本和标准品中人TNF-会与单抗结合，游离成份被洗去。同时加入生物素化抗人TNF-抗体和辣根过氧化物酶标识亲合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-抗体与结合在单抗上人TNF-结合而形成免疫复合物，游离成份被洗去。加入显色剂，若反应孔中有些人TNF-，辣根过氧化物酶会使无色显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A值，人TNF-浓度与A450值之间呈正比，可经过绘制标准曲线求出标本中人TNF-浓度。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第9页第四.二部分:试验试剂、材料和仪器设备试验标本试剂盒及其内容物试验材料仪器设备研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第10页试验标本人外周血(血清)1.搜集血液试管应为无热源和内毒素试管2.血浆抗凝剂为EDTA3.标本应清澈透明,如有悬浮物应离心除去4.防止溶血,高血脂5.标本搜集后若不及时检测,按一次用量分装,冻存于-20,防止重复冻融6.可依据实际情况,将标本作适当倍数稀释(提议做预试验,以确定稀释倍数)研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第11页试剂盒及其内容物1a 标准品1支(4000pg，冻干)4 1b 标准品和标本稀释液(粉红色)1瓶(15ml)4 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60l)4 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60l)4(避光)3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4 4 浓缩洗涤液 20(兰色)1瓶(15ml)4 5 显色剂1瓶(6ml)4 6 终止液1瓶(12ml)4 抗体包被板条812 或 86 4 封板胶纸1张 说明书1份 *:96/48 Test研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第12页试验材料与设备试验材料与设备1.加样器:0.5-10ul,2-20ul,20-200ul,200-1000ul2.吸头:10ul,200ul,1000ul3.酶标仪:450nm4.双蒸水或去离子水,坐标纸等研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第13页第四.三部分:试验方法与步骤1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未用完放回4。3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻干标准品(1a),静置15分钟后混匀，按说明稀释至所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完复溶标准品放入-20保留,稀释标准品不应重复使用。4、可依据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可做预试验，以确定稀释倍数)。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第14页第四.三部分:试验方法和步骤5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回46、除空白孔外，分别将不一样浓度标准品/标本100ul/孔加入板条对应孔中，标准品和标本应作双复孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37孵育90分钟。7、洗板4次。8、除空白孔外，加入1:100稀释生物素化抗体(2a)工作液 100ul/孔，封住板孔，37孵育60分钟。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第15页第四.三部分:试验方法和步骤9、洗板4次。10、除空白孔外，加入1：100稀释酶结合工作液(100 ul/孔).封住板孔,37孵育30分钟.11、洗板4次.12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37孵育10-20分钟。13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测A450值(5分钟内)。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第16页标 准 品 稀 释 方 法pg/ml1000pg/ml500pg/ml250pg/ml125pg/ml62.5pg/ml31.25pg/ml500lstd.500l500l500l500l500l研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第17页第四.四部分:结果判断与计算1、每个标准品和标本OD值应减去零孔OD值。2、绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品坐标点。经过标本OD值可在标准曲线上查出其浓度。3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第18页研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第19页第四第四.五部分五部分:注意事项注意事项(1)1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350l，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗4次。2、冰箱中取出浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，加热溶解后再配制。3、装量极少试剂(2a和3a)应先离心或用手甩几下，以使管壁液体沉于管底。4、不一样批号试剂盒组份不能混用。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第20页第四第四.五部分五部分:注意事项注意事项(2)5、检测标本如为组织培养液，应用培养液作为标准品/样品稀释液。研究生实验:酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验专家讲座第21页