广西野生灵芝生物学特性及遗传多样性分析_韦娇君.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 928广西野生灵芝生物学特性及遗传多样性分析韦娇君1，王灿琴1，胡秀月2*，王晓国1，韦仕岩1，唐军1，罗阳兰1（1广西农业科学院微生物研究所，广西南宁530007；2田林县经济作物站，广西百色533300）摘要：【目的】对广西灵芝菌株资源进行生物学特性和遗传多样性分析，为广西野生灵芝种质资源的开发利用及新品种选育提供理论依据。【方法】以广西区内收集到的19个野生灵芝菌株和区外引进的5个灵芝菌株为试验材料，比较供试菌株菌丝体在不同温度、pH、碳源和氮源上的生长情况，筛选出灵芝最适生长条件，并利用SSR分子标记对供试菌株进行遗传多样性分析和聚类分析。【结果】24个灵芝菌株菌丝10 时均不生长；1530 均能生长，15 菌丝生长速度最慢，均低于1.26 mm/d；20和25 菌丝生长速度较快，分别为1.933.93 mm/d和4.025.92 mm/d；30 菌丝生长速度最快，均高于6.17 mm/d，35 只有2个菌株可萌发。8个菌株最适生长的pH5.0；16个菌株最适生长的pH8.0。13个菌株菌丝的最适碳源是果糖，6个菌株菌丝的最适碳源是蔗糖，3个菌株的最适碳源是葡萄糖；2个菌株菌丝生长的最适碳源有2种，为果糖和蔗糖；乳糖、麦芽糖和淀粉均不适合作供试灵芝菌株的碳源。以酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、牛肉膏、硝酸钾和蛋白胨为最佳氮源的分别有15、5、2、1、2和1个菌株，其中RSLZ-1901的最适氮源有3种，分别是酵母粉、硝酸铵和硫酸铵；CLZ-119的最适氮源为酵母粉和蛋白胨，尿素不适合作为灵芝的氮源。24个灵芝菌株间遗传相似性系数为0.490.93，在遗传相似性系数0.68时分为5个类群，表明各菌株间存在较大的遗传差异。【结论】灵芝菌株菌丝的生长速度和长势均与温度呈正相关，最适生长温度为30；8个菌株耐酸性较强；16个菌株耐碱性较强；最适碳源有果糖、蔗糖和葡萄糖；最适氮源有酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、牛肉膏、硝酸钾和蛋白胨。24个供试菌株的生物学特性及遗传多样性存在明显差异，表明其遗传多样性丰富，可用于广西灵芝种质创新及品种选育。关键词：野生灵芝；生物学特性；SSR；遗传多样性中图分类号：S567.31文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）03-0928-10收稿日期：2023-01-13基金项目：广西重点研发计划项目（桂科AB22035030）；广西农业科学院科技发展基本项目（桂农科2022JM57）；广西农业科学院基本科研业务专项（桂农科2021YT094）；广西田林县特色作物试验站资助项目（桂TS2022017）通讯作者：胡秀月（1969-），https:/orcid.org/0009-0008-9819-4777，高级农艺师，主要从事食药用菌研究及应用推广工作，E-mail：第一作者：韦娇君（1986-），https:/orcid.org/0009-0008-1843-169X，主要从事食药用菌研究工作，E-mail：Biological characteristics and genetic diversity of wildGanoderma lucidum in GuangxiWEI Jiao-jun1，WANG Can-qin1，HU Xiu-yue2*，WANG Xiao-guo1，WEI Shi-yan1，TANG Jun1，LUO Yang-lan1（1Institute of Microbiology，GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China；2Cash Crop Station of Tianlin，Baise，Guangxi 533300，China）Abstract：【Objective】In order to lay a theoretical foundation for the selection of wild Ganoderma lucidum resourcesdevelopment，utilization and breeding of new varieties in Guangxi，the biological characteristics and genetic diversity ofG.lucidum strains collected in Guangxi were analyzed.【Method】The optimum growth conditions of 19 wild G.lucidumstrains collected in Guangxi and 5 cultivated G.lucidum strains collected from out of Guangxi were determined by compa-ring the mycelial growth rate at different growth temperatures，pH values，carbon sources and nitrogen sources.Geneticdiversity analysis of each stain was carried out using SSR molecular markers.【Result】The mycelium of the 24 collectedG.lucidum strains could grow at 15-30，but stopped growth at 10.The mycelial growth rate was the slowest at 15 for all strains（below 1.26 mm/d）；the growth rate increased at 20 and 25，ranging from 1.93 to 3.93 mm/d and 4.02to 5.92 mm/d respectively；the mycelial growth rate was the fastest at 30（higher than 6.17 mm/d for all strains）.Only2 out of the 24 strains could survive at 35.The optimal growth pH for 8 strains were5.0，and 8.0 for the rest 16南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（3）：928-937ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.0293期9290引言【研究意义】灵芝（Ganoderma lucidum）是我国著名的药用真菌（戴玉成等，2021），始载于 神农本草经，已被广泛应用了数千年（Bishop et al.，2015；Lin and Yang，2019）。灵芝含有丰富的生物活性物质，如多糖、三萜、不饱和脂肪酸和生物碱等（Zhouet al.，2012），具有抗肿瘤、降血压、降血糖和调节机体免疫力等功效（张瑞婷等，2018；Wu et al.，2019）。目前世界灵芝科物种有400多个分类单元，其中我国报道的约有100个（吴兴亮等，2004a，2004b，2004c；崔宝凯和吴声华，2020）。灵芝属于中高温型木腐菌，适于生长在热带和亚热带地区，而广西属于热带和亚热带季风气候，非常适合野生灵芝的繁殖生长。研究发现，广西灵芝有20个品种，位居全国第3，仅次于海南和云南（邢佳慧，2019）。随着对养生保健品需求量增长，保健品市场对灵芝的需求快速增加，但目前成功实现商业化栽培的灵芝菌株寥寥无几，部分菌株长年使用出现减产退化等现象。此外，由于缺乏法律知识和对野生资源的保护意识，导致一些野生灵芝种质受到严重破坏甚至濒临灭绝。而野生灵芝由于可能具有栽培灵芝所没有的优良性状，值得深入研究（解凡等，2018）。因此，开展广西野生灵芝的生物学特性和遗传多样性分析，对野生灵芝的驯化栽培及新品种选育具有重要研究意义。【前人研究进展】在食用菌的生物学特性研究方面，兰玉菲等（2016）筛选出3个灵芝菌株菌丝生长的最适碳源为蔗糖、葡萄糖和麦芽糖，最适氮源为酵母粉，最适温度为2530；陈旭等（2016）筛选出灵芝南GL11菌丝生长的最适碳氮源分别为淀粉和蛋白胨，最适pH和温度分别是6.0和30；莫伟鹏等（2017）研究发现，白肉灵芝（G.leucocontextum）菌丝体生长最适温度为25，最适pH为3.0，最适碳氮源分别是蔗糖和酵母粉；马博等（2019）研究发现，野生灵芝BSU01菌丝生长最适碳源为果糖或葡萄糖，最适氮源为酵母提取物，最适温度为30，最适pH为5.5；钱坤等（2022）研究发现，四川灵芝（G.sichuanense）菌丝生长的最适碳氮源分别为麦芽糖和牛肉膏，最适pH为7.0，最适温度30；以上研究结果表明，不同灵芝菌株菌丝生长的最适碳氮源、温度和pH均存在明显差异。在食用菌的种质资源鉴定和遗传多样性分析研究方面，内转录间隔区（ITS）序列分析是真菌物种分子鉴定的有效手段，也适于属内种间或种内差异较大的菌株间系统发育关系的分析，是传统形态鉴定方法的重要补充，如姚春馨等（2022）和胡佳等（2023）利用rDNA-ITS序列比对，并通过构建系统发育进化树分析野生菌株与栽培菌株之间的亲缘关系，有助于更好地对灵芝属菌株进行评价和利用。何金宇等（2020）和徐晓兰等（2020）通过SSR分子标记对灵芝种质资源进行遗传多样性分析，结果发现各菌株间存在着较大的遗传差异，区分出野生菌种及其后代与栽培菌种及其后代。刘潮等（2022）利用生物信息学软件对灵芝属真菌线粒体基因组特征、SSR分子标记等进行分析，结果显示灵芝属真菌的线粒体基因组在进化过程中发生明显的遗传变异，为灵芝属物种分类、分子进化和系统发育分析提供了理论依据。除了上述基于分子水平的相关研究之外，陈雪凤等（2016）采用酯酶同工酶分析方法证实了10个广西野生灵芝菌株具有丰富的遗传多样性，strains.Fructose was the optimal carbon source for 13 strains，sucrose for 6 strains，glucose for 3 strains，and fructoseand sucrose for the last two strains.Lactose，maltose and starch were not suitable carbon sources for the tested G.lucidumstrains.Yeast powder was the optimal nitrogen source for 15 strains，ammonium for 5 strains，ammonium nitrate for 2strains，ammonium sulfate for 1 strain，beef extract for 2 strains，and potassium nitrate and peptone for 1 strain.The opti-mal nitrogen sources for RSLZ-1901 were yeast powder，ammonium nitrate and ammonium sulfate.The optimal nitrogensources for CLZ-119 were yeast powder and peptone.Urea was not suitable nitrogen source for G.lucidum.The level ofgenetic similarities among the 24 strains were 0.49-0.93.At a genetic similarity level of 0.68，the 24 G.lucidum strainscould be divided into 5 groups，indicating great genetic diversities among them.【Conclusion】The growth rate and vigorof mycelium of the selected G.lucidum strains are positively correlated with temperature，and the optimal growth tempera-ture is 30.Eight strains have strong acid resistance，and 16 strains have strong alkali resistance.The most suitable carbonsources include fructose，sucrose，and glucose；the best nitrogen sources are yeast powder，ammonium nitrate，ammo-nium sulfate，beef extract，potassium nitrate and peptone.These 24 selected G.lucidum strains from Guangxi show greatgenetic diversities and significantly different biological characteristics.The results indicate that the genetic diversity ofG.lucidum strains is rich and can be used for germplasm innovation and variety breeding in Guangxi.Key words：wild Ganoderma lucidum；biological characteristics；SSR；genetic diversityFoundation items：Guangxi Key Research and Development Plan Project（Guike AB22035030）；Basic Project ofScience and Technology Development of GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences（Guinongke 2022JM57）；Basic Scien-tific Research Project of GuangxiAcademy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT094）；Project of Special Crop TestStation in Tianlin，Guangxi（Gui TS2022017）韦娇君等：广西野生灵芝生物学特性及遗传多样性分析54卷南 方 农 业 学 报 930但该试验的样品数偏少，不能全面反映广西野生灵芝的多样性。【本研究切入点】随着分子生物技术的发展，相比于酯酶同工酶和拮抗试验，SSR分子标记技术能更准确地分析样品间的遗传多样性。现已广泛应用于食药用菌，但对广西野生灵芝的研究较少。因此，本研究在陈雪凤等（2016）的研究基础上，增加了供试灵芝菌株数量，并利用SSR分子标记技术分析灵芝菌株的遗传多样性。【拟解决的关键问题】以广西区内收集到的19个野生灵芝菌株和区外引进的5个灵芝菌株为试验材料，比较供试菌株菌丝体在不同温度、pH和碳氮源上的生长情况，筛选出灵芝最适生长条件，并利用SSR分子标记对供试菌株进行遗传多样性分析和聚类分析，为广西野生灵芝的驯化栽培、种质创新及品种选育等提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料供试的灵芝菌株为广西区内收集的19个野生菌株和区外引进的5个栽培菌株（表1）。主要试剂：离心柱型DP305植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；6Loading Buffer、2Taq PCR Master Mix和GelRedTM购自生工生物工程（上海）股份有限公司。供试引物见表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2生物学特性试验1.2.1温度试验将供试菌株用直径5 mm的打孔器从菌落边缘取菌块转接至新的PDA培养基上，分别于10、15、20、25、30和35 恒温培养箱避光培养。1.2.2酸碱性试验PDA培养基用盐酸和氢氧化钠调节pH，配制成pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的培养基，将供试菌株用直径5 mm的打孔器从菌落边缘取菌块，接种至不同pH的培养基上，于28 恒温培养箱避光培养。1.2.3碳源试验碳源基础培养基为PDA培养基，分别用等量的蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖和淀粉代替基础培养基中的葡萄糖，配制成不同碳源的培养基，将供试菌株用直径5 mm的打孔器从菌落边缘取菌块，接种至不同培养基后置于28 恒温培养箱避光培养。1.2.4氮源试验氮源基础培养基是PDA培养基，分别加入酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、尿素和硝酸钾各3 g，制成不同氮源的培养基，将供试菌株用直径5 mm的打孔器从菌落边缘取菌块，接种至不同培养基后置于28 恒温培养箱避光培养。上述生物学特性试验前，供试菌株接种于PDA培养基上活化培养5 d后备用，每处理5个重复。在培养过程中观察菌丝的长势情况，菌丝开始长满平板时结束试验，拍照后采用“十”字交叉法测量菌落直径。菌丝长速（mm/d）=菌落半径/培养天数。1.3遗传多样性分析将供试菌株接种于PDA培养基活化培养5 d，用直径5 mm的打孔器从菌落边缘取菌块转接至铺好灭菌玻璃纸的PDA培养基上，28 避光培养6 d。用灭菌镊子将菌丝刮下后，采用离心柱型DP305植物基因组DNA提取试剂盒提取菌丝的基因组DNA。选择6个灵芝菌株来源的DNA样品对50对引物（何金宇等，2020）进行筛选，选出29对特异性强和多态性较好的引物（表2），对所有菌株进行PCR扩增。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。选择SSR扩增稳定清晰的条带，统计各引物扩增条带的数据，有条带记为1，无条带记为0；采用NTsys-pc2.10e中的非加权配对平均法（UPGMA）绘制系统发育进化树。序号Serialnumber123456789101112菌株编号Stain numberDMSRSLZ-4RSLZ-6JXLZ-7JXLZ-14TLZ011TLZ021TLZ-032TLZ-033RSLZ-15HLZ-4CLZ-6来源Origin南宁市上林县大明山柳州市融水县怀宝乡喷沟村柳州市融水县怀宝乡喷沟村崇左市大新县德天瀑布百色市靖西县湖润镇华利村百色市田林县平塘乡龙歪村百色市田林县八桂乡八修村百色市田林县那比村百色市田林县那比村柳州市融水自治县贺州市步头镇保和村四川省农业科学院类型Type野生野生野生野生野生野生野生野生野生野生野生栽培序号Serialnumber131415161718192021222324菌株编号Stain numberH1SJLZ-1902HLZ-2DMSLZ2020RSLZ-1902ZLZ-JDHLZ-JDCLZ-119RSLZ-1901SJLZ-1903RSLZ-9RSLZ-2003来源Origin上海市农业科学院柳州市三江县丹州镇贺州市步头镇保和村南宁市上林县大明山柳州市融水县四荣乡江苏省江都市天达食药用菌研究中心江苏省江都市天达食药用菌研究中心福建仙芝楼菌种中心柳州市融水县四荣乡荣地村柳州市三江县丹州镇柳州市融水县永乐乡四莫村柳州市融水县融水镇新安村类型Type栽培野生野生野生野生栽培栽培栽培野生野生野生野生表 1供试菌株来源及编号Table 1Source and strain number of G.lucidum test strains3期9312结果与分析2.1生物学特性分析结果2.1.1温度对灵芝菌丝生长速度的影响24个供试菌株在不同温度下培养5 d的菌丝长速有明显差异。菌丝在10 时均不生长；在1530 均能生长，15 时菌丝生长速度最慢，均低于1.26 mm/d；20和25 时的菌丝生长速度较快，分别为1.933.93 mm/d和4.025.92 mm/d；30 时菌丝生长速度最快，均高于6.17 mm/d。24个菌株在1030 的生长速度进行线性回归分析，结果如表3所示，斜率值为0.3190.412，回归系数为0.9390.992。温度为35 时，仅2个菌株CLZ-6和H1可萌发；所有菌株在35 培养10 d后转25 培养均可萌发，表明温度为1530 时，各菌株菌丝的生长速度和长势均与温度呈正相关，即温度越高长速越快，菌丝长势越稠密、健壮和整齐，说明各菌株菌丝的最适生长温度为30。2.1.2pH对灵芝菌丝生长速度的影响24个灵芝菌株菌丝在pH为4.011.0的PDA培养基上培养6 d的日平均生长速度见表4。TLZ021、DMSLZ2020、DMS、HLZ-4、SJLZ-1903和H1这6个菌株的菌丝日平均生长速度随pH增大呈规律性变化，其中DMSLZ2020、DMS、HLZ-4和SJLZ-1903随pH增大其菌丝生长速度呈先升高后降低的趋势，H1和TLZ021随pH增大其菌丝日平均生长速度呈先降低后升高的趋势，其他18个菌株的菌丝生长速度随pH增大并未呈规律性变化。DMSLZ2020和RSLZ-15在pH 5.0时，日平均生长速度最快，说明两者耐酸性较强；H1和TLZ021在pH为4.0和11.0时日平均生长速度均较快，说明两者既耐酸又耐碱；RSLZ-6在pH 11.0时日平均生长速度较快，说明其耐碱性较强。由表5可知，TLZ021、RSLZ-4、DMSLZ2020、JXLZ-7、TLZ011、RSLZ-15、RSLZ-1902和RSLZ-9最适生长的pH5.0，说明这些菌株耐酸性较强；其余菌株最适生长的pH8.0，说明这些菌株耐碱性较强。2.1.3碳源对灵芝菌丝生长速度的影响24个灵芝菌株菌丝在6种不同碳源培养基上培养5 d的日平均生长速度见表6。在6种碳源上菌丝日平均生长速度均较快的3个菌株分别是HLZ-2、ZLZ-JD和SJLZ-1903，这3个菌株在不同碳源培养基上的日平均生长速度均高于6.00 mm/d，其中SJLZ-1903在蔗糖和果糖培养基上的日平均生长速度为8.20 mm/d；对碳源适应性较弱且日平均生长速度最慢的菌株是JXLZ-7，引物名称 PrimerGL-gSSR-1GL-gSSR-2GL-gSSR-3GL-gSSR-4GL-gSSR-6GL-gSSR-9GL-gSSR-10GL-gSSR-11GL-gSSR-15GL-gSSR-16GL-gSSR-17GL-gSSR-19GL-gSSR-23GL-gSSR-25GL-gSSR-29GL-gSSR-31GL-gSSR-32GL-gSSR-33GL-gSSR-36GL-gSSR-37GL-gSSR-39GL-gSSR-41GL-gSSR-43GL-gSSR-44GL-gSSR-45GL-gSSR-47GL-gSSR-48GL-gSSR-49GL-gSSR-50正向引物 Forward primer5-TCTCGAAATACAACCTCGGC-35-AACCTCCAACCTCCAACCTC-35-GGAGCAGAGGTTGACCAAAA-35-GCATATACGGACCATCACCC-35-AGGTGGAAGGACAAACATCG-35-CTCGACCAGTTCCTCGAGAC-35-TGGATGCTGCGGTAGTAGTG-35-CCAATGCGCTCTCTAACCTC-35-GCCGCTGTCAAGTGAGTCTA-35-AGGAGGCGACTCGTAGACAA-35-AGTCCTGAGCAGAGCAGAGC-35-CTGTTGACATCTGGTGCGTT-35-TTCGTGAAATTCGATGGTGA-35-TATGCCTCGTCTCGTCTGTG-35-GACGAGCCTGAATCCAAGAA-35-GCTGTGGTCTTTGCCTTCTC-35-TCCGGGATTATGGTGTTCTC-35-CGACAATCGAAAGACGGAGT-35-GCTCAGCTCCTACAACGTCC-35-TCTCTACCTCCTTCATCCGC-35-AGGGGCAGAGGAAGATGACT-35-GATGGGTCAGTGTGCGTATG-35-AGTTGCGTTGAACGTATCCC-35-GGCCCTGGAATAAGTTAGGC-35-CCGGAAGTGTCGTAGTCGAT-35-CGACAACAGTTTCGTCCTCA-35-TCAGTCAACAGGTAGCACGC-35-GCAACTGCCACCTAGTAGCC-35-CCAACTGTACCCATCGATCC-3反向引物 Reverse primer5-AGTGCTGGTGTTCTGCTGTG-35-GGGTCGGACGAGTCTGAATA-35-GCGAGCACTTCTGTATCGGT-35-CTTGTCCTTTGTGCCACTGA-35-ATCACGAGCAACAACACTCG-35-CGTAAACGATCCCAGTCGAT-35-CTCGACTTGAACGCTGTTTG-35-CGACGCATCTCATTGCCT-35-ATTCAATGTTGACGTCGCAG-35-GCGAACGAGTAATCCGATGT-35-GTGCGCGGAGGAGTACAAC-35-TCAAACCATCGGTCCATACA-35-CATTAATCGCACAGCACACC-35-AACGCCGAACAAAACAGAAC-35-CCTCGGAGTAGAAGAACCCC-35-AGGACGACGAGAGTGTAGCG-35-GCTCTTCTGCTTTCGGTGTC-35-GTCACGCTTAGCAATGACGA-35-AAAGAAGAGAAGGGGGCGTA-35-TAGGGAAGTCAGCCATGACC-35-GCAGCAGAGAGGAAGGAAGA-35-CCGAAATGCCTAATGTTCGT-35-ATCCCTCCATTCTACCCCAC-35-CTCAGGACCCGAACAAGAAG-35-CCCTTCAGCAGGAGTCTGAG-35-GAAGAGGCATGTGTGAGCAA5-TCAATTTGGGCAGAAAGTCC-35-CGGAGAATACTGGCAACCAT-35-TGTAGGGAGGTGGACGGTAG-3表 2筛选出的SSR引物序列Table 2Screened SSR primer sequences韦娇君等：广西野生灵芝生物学特性及遗传多样性分析54卷南 方 农 业 学 报 932其在6种碳源培养基上的日平均生长速度低于5.00 mm/d。由表7可知，DMS、TLZ011、CLZ-6等13个菌株菌丝的最适碳源是果糖，RSLZ-4、RSLZ-6、JXLZ-14等6个菌株菌丝的最适碳源是蔗糖，JXLZ-7、TLZ021和TLZ032这3个菌株的最适碳源是葡萄糖；CLZ-119和SJLZ-1903菌株菌丝生长的最适碳源均有2种，为果糖和蔗糖，说明乳糖、麦芽糖和淀粉不适合作为供试灵芝菌株的碳源，不同灵芝菌株对蔗糖、果糖和葡萄糖适应性存在明显差异。2.1.4氮源对灵芝菌丝生长速度的影响24个灵芝菌株菌丝在7种不同氮源培养基上培养6 d的日均生长速度见表8。有16个菌株菌丝在尿素培养基上生长速度缓慢，有8个菌株菌丝不萌发，表明尿素不适合作为灵芝的氮源。24个灵芝菌株菌丝在其他6个氮源培养基上的生长情况显示，CLZ-6、HLZ-4、ZLZ-JD和RSLZ-1901这4个菌株在不同氮源培养基上的生长速度较快，日平均生长速度均高于6.40 mm/d，说明这4个菌株对氮源的适应性较强，其中，RSLZ-1901在酵母粉、硝酸铵和硫酸铵的日平均生长速度相同；对氮源适应性较弱且生长速度最慢的菌株是RSLZ-4，在不同氮源培养基上的日平均生长速度低于5.20 mm/d。由表9可知，以酵母粉、硝酸铵、硫酸菌株 StrainDMSRSLZ-4RSLZ-6JXLZ-7JXLZ-14TLZ011TLZ021TLZ032TLZ033CLZ-6HLZ-4RSLZ-15SJLZ-1902H1HLZ-2DMSLZ2020RSLZ-1902HLZ-JDZLZ-JDRSLZ-1901CLZ-119SJLZ-1903RSLZ-9RSLZ-2003pH 4.05.570.184.770.385.070.253.850.204.480.154.470.357.100.284.130.265.150.316.050.445.670.256.800.225.430.238.280.105.680.308.620.066.230.253.130.135.350.175.970.303.970.215.720.216.150.185.430.28pH 5.05.550.153.100.055.720.183.930.145.650.154.620.126.950.154.530.094.580.186.380.195.720.187.980.215.720.096.650.186.480.128.970.036.980.143.570.046.180.166.230.151.080.105.980.116.470.025.650.09pH 6.05.730.153.600.265.080.232.900.265.150.172.580.246.120.134.130.245.680.246.580.235.950.227.680.216.400.264.630.196.170.288.580.106.420.383.420.065.680.285.830.335.220.266.380.405.880.185.030.53pH 7.05.880.142.850.285.400.102.980.285.330.154.770.215.580.284.670.185.720.286.570.135.920.217.200.265.520.204.270.186.270.308.180.106.430.323.330.286.070.255.820.183.050.256.450.315.420.335.650.13pH 8.06.250.174.150.224.250.263.500.234.950.362.370.355.230.254.120.245.680.206.650.206.120.146.420.136.430.385.430.155.820.198.080.106.180.244.750.225.870.216.780.283.900.106.550.223.550.225.680.20pH 9.05.680.323.680.255.020.243.020.374.430.252.600.305.700.174.080.085.670.126.100.156.320.196.950.286.500.537.050.286.600.268.000.266.230.213.850.306.680.286.400.305.030.256.700.356.100.266.000.36pH 10.05.770.324.120.206.730.212.830.155.800.173.600.265.830.214.770.155.900.266.500.235.350.237.380.245.600.268.330.066.220.147.630.156.400.264.570.216.820.186.630.155.770.216.720.255.930.325.780.20pH 11.03.620.164.320.196.780.243.770.155.270.352.850.236.070.214.270.215.280.135.770.124.350.186.200.264.470.318.550.052.900.267.830.256.270.212.670.214.420.285.400.365.280.184.720.134.200.174.400.10菌株StrainTLZ033RSLZ-15JXLZ-7TLZ021TLZ032RSLZ-1902TLZ011RSLZ-6H1SJLZ-1902HLZ-4RSLZ-9线性回归方程Linear regression equationy=0.319x-3.604y=0.325x-3.755y=0.330 x-3.831y=0.335x-3.848y=0.337x-3.773y=0.343x-3.943y=0.344x-3.936y=0.345x-3.792y=0.352x-4.181y=0.356x-3.727y=0.361x-4.110y=0.369x-4.293回归系数Regression coefficient0.9700.9750.9710.9740.9710.9760.9780.9880.9390.9600.9750.963菌株StrainDMSLZ2020CLZ-119RSLZ-4HLZ-2JXLZ-14HLZ-JDCLZ-6RSLZ-2003SJLZ-1903DMSRSLZ-1901ZLZ-JD线性回归方程Linear regression equationy=0.372x-4.102y=0.375x-4.390y=0.382x-4.403y=0.384x-4.197y=0.393x-4.485y=0.397x-4.509y=0.397x-4.540y=0.400 x-4.588y=0.408x-4.367y=0.408x-4.590y=0.410 x-4.487y=0.412x-4.752回归系数Regression coefficient0.9890.9710.9730.9820.9680.9770.9800.9780.9920.9830.9840.974表 4供试菌株菌丝在pH培养基上的日平均生长速度（mm/d）Table 4Daily average growth rate of mycelium of the tested strains on different pH media（mm/d）表 3菌丝生长速度与温度之间的线性关系Table 3Linear regression analysis between strain growth rate and temperaturey：生长速度；x：温度y：Growth rate；x：Temperature3期933铵、牛肉膏、硝酸钾和蛋白胨为最佳氮源的分别有15、5、2、1、2和1个菌株，其中RSLZ-1901的最适氮源有3种，分别是酵母粉、硝酸铵和硫酸铵；CLZ-119的最适氮源为酵母粉和蛋白胨。2.2SSR分子标记分析结果本研究筛选出29对特异性强和多态性较好的SSR引物，从24株供试菌株共扩增出220个条带，其中有209个多态性条带，多态性比例为95%，表明供试灵芝菌株具有丰富的遗传多态性。供试灵芝菌株的扩增DNA片段条带大小为1002000 bp。图1为引物GL-gSSR-50对24个供试菌株的PCR扩增结果图谱。基于SSR分子标记的供试菌株聚类分析结果如图2所示。24个灵芝菌株遗传相似性系数为0.490.93，在遗传相似性系数0.68时，可分为5个类群，类群包括11个菌株（DMS、RSLZ-15、RSLZ-1902