生物物理省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物物理生物物理物理学家眼中生物物理学家眼中生物张文炳第1页二。研究内容研究内容：1。仅由20种氨基酸组成聚合物怎样形成有准确三位结构及特定生物功效？2。DNA怎样解构并准确复制及指导蛋白质合成？3。怎样感知外部世界？（声音，光，味。）4。肌细胞怎样把ATP化学能转化为力和运动？5。细胞膜怎样选择输运物质？6。生物物理技术第2页复杂性：全部生物系统必须：准确、储存和转化能量。自我复制（保留信息从上代到子代）必须有精细结构（复杂大分子积聚体）适应环境改变：功效和进化控制。研究策略：分解：把系统分解为部分再结合起来确定：每一部分是什么部分怎样组成整体每一部分怎样工作第3页1916-1916-1928-1928-1916-1916-University of London University of London London,Great Britain London,Great Britain Harvard University Harvard University Cambridge,MA,USA Cambridge,MA,USA Institute of Molecular Institute of Molecular Biology Biology Cambridge,Great Britain Cambridge,Great Britain Great Britain Great Britain USA USA Great Britain Great Britain Maurice Hugh Frederick Maurice Hugh Frederick Wilkins Wilkins James Dewey Watson James Dewey Watson Francis Harry Compton Francis Harry Compton Crick Crick for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962第4页Franklin,Rosalind Elsie(1920-58),British biophysicist.Born in London,she was educated in physical chemistry at Newnham College,Cambridge.Franklin conducted X-ray diffraction studies on the structure of the DNA molecule,the carrier of hereditary information,while working in the laboratory of British biophysicist Maurice Wilkins.This work enabled American biochemist James Dewey Watson and the British Francis Crick to determine the helical structure of the DNA molecule.第5页第6页 James Watson(left)and Francis Crick第7页NobelPrizeinChemistryfordiscoveriesconcerningchannelsincellmembranesPeter AgreRoderick MacKinnon第8页离子通道离子通道第9页离子通道特点离子通道特点对离子选择性对离子选择性:离子离子 直径、形状、电荷直径、形状、电荷 通透饱和性通透饱和性开关可控制性开关可控制性 不连续开放不连续开放 经过构型改变来确定开关经过构型改变来确定开关 构型有细胞内外环境调控构型有细胞内外环境调控K+channel(KCSA)第10页The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1963Sir John Carew EcclesAlan Lloyd HodgkinAndrew Fielding Huxleyfortheirdiscoveriesconcerningtheionicmechanismsinvolvedinexcitationandinhibitionintheperipheralandcentralportionsofthenervecellmembrane第11页单细胞电学模型胞外液：电阻 Ro胞内液：电阻 Ri膜电容Cm特征：双脂层结缘体 电荷内外分布膜电导特征：电阻离子通道RoRmCmRiRm第12页Nernst 平衡电位 Fick 定律（扩散）J=扩散流D=扩散系数 I=离子浓度dx=膜厚 Ohms 定律J=电场驱动离子流=速率Z=离子价 e.g.,Z for Na+=1;Z for Cl-=-1I 离子浓度V=跨膜电位 dv/dx=-E=电场 第13页Einstein 关系Einstein 关系:离子迁移速率与扩散系数间关系R 为气体常数：R=8.314 J/（k mol)F 为Farady常数；F=96487 C/mol扩散和电场同时存在时：j=jdiffu+je第14页平衡时：j=0从膜外到膜内积分，得到：跨膜电位差：Vm=Vi Vo,Nernst 平衡电位第15页The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991Erwin NeherBert Sakmannfortheirdiscoveriesconcerningthefunctionofsingleionchannelsincells第16页电压钳技术试验设计依据试验设计依据：离子运动产生离子电流(I)取决于膜离子通透性,可兴奋膜含有电容(C)、电阻(R)特征,而离子电流大小与膜电阻即通透性相关,通常以膜电阻倒数即膜电导(G)来表示。因为 I=IR+IC 当膜电位(即电压V)固定时,IC=0 则 I=IR 因为I=VG 而V又是固定不变,所以跨膜电流 I 改变成为膜离子电导G量度。第17页膜片钳技术a)基本原理基本原理：微吸管接触胞膜和抽吸高阻封接(膜片与胞膜其它部位电学隔离)统计经一个或少数几个通道离子电流并进行通道功效分析。b)试验结果试验结果：第18页第19页生物分子折叠生物分子折叠折叠：从蛋白质序列确定结构。结构决定其功效错误结构病（疯牛病、帕金斯）第20页Levinthal悖论假设一个蛋白质由100个氨基酸残基组成，每个残基有三个状态，蛋白质构型数：31005x1047假设从一个构型到另一构型需10-10秒，随机搜寻全部构型需：5x104710-10=1.6x1030年而实际上，蛋白质折叠时间为毫秒到分蛋白质折叠非随机搜寻蛋白质折叠使自由能最小对于折叠：（系统包含水和蛋白质）第21页蛋白质折叠中能量熵减小，不利于折叠内能减小，利于折叠水作用非常主要，疏水作用是蛋白质折叠主要驱动力水结构及熵改变疏水侧基排出水，排出非折叠态笼中水第22页热力学知识焓（enthalpy):H=E+PVH=q-PV+w+PV+VP=qH=E+PV+VP（P=0，V0）E系统能量怎样储存？分子动能。在恒温下，不变。化学键和相互作用能。经过化学反应释放和增加。第23页熵和混乱度能量守恒不能作为一个进程是否发生标准这些过程是不可逆第24页熵表示其状态：S=kBlnW熵常数微观状态数对于孤立系统，最可能结果为熵最大判断一个过程是否自发发生：S0(自发发生）S0(非自发发生）第25页溶液稀释熵：H=0对1M蔗糖，水=55M对0.1M蔗糖54水550水55个位置550个位置1糖1糖W=一个糖分子放在55个位置数目W=一个糖分子放在550个位置数目通常：S10.1=Rln10=4.57cal/moloK第26页自由能描述一个系统（不论是否为孤立系统）是否自发反应结合焓和熵改变：G=HTS自发反应标准：假设H=0G=TSG0S0G0自发反应G0非自发反应G=0平衡态第27页小结对化学反应HS1）储存在键和相互作用势能改变1）描述混乱度2）平衡常数随温度改变2）平衡常数不随温度改变3）反应价键数目、类型及强弱3）反应构象、溶解有序无序转变4）4）反应趋于发生第28页蛋白质骨架构象柔软性对于折叠反折叠过程形成折叠态方法有多少？第29页自由度2：、假设每个自由度有2个值，每个残基有4个构象和对于由100个氨基酸组成蛋白质，构象数为：41001060当考虑排除体积效应，其数目为：W反折叠1016S0骨架构象=Rln1016=73cal/molKG0骨架构象=-TS=-22Kcal/mol(T=250C)对蛋白质，另外自由度也起作用第30页水对蛋白质折叠影响低水解高水解第31页RNA动力学与基因调控动力学与基因调控第32页RNA分子功效分子功效1958年，年，Crick提出了著名中心法则。阐述了提出了著名中心法则。阐述了DNA，RNA，蛋白质三者关键功效与关系。，蛋白质三者关键功效与关系。DNA是遗传信息存放载体，在是遗传信息存放载体，在RNA辅助下合成蛋辅助下合成蛋白质白质。第33页中心法则补充与完善中心法则补充与完善转录转录逆转录逆转录DNA复制复制RNA复制复制翻译翻译虚线表示催化调控作用虚线表示催化调控作用伴随研究深入，RNA生命意义逐步凸显：功效极其丰富，参加到生命活动各个方面。核酶核酶第34页RNA分子特点分子特点一样是主要遗传分子 逆转录与RNA复制结构多样，功效丰富 RNA催化作用参加生命活动多个方面 “RNA世界”学说第35页RNA分子结构分子结构由带有由带有A、U、G、C四种碱基核苷酸四种碱基核苷酸缩合而成长链分子。缩合而成长链分子。碱基之间能够形成碱基之间能够形成A-U，G-C，G-U三种碱基配对。三种碱基配对。UracilAdenineGuaineCytosine第36页一级结构、二级结构与三级结构一级结构、二级结构与三级结构按照按照RNA分子碱基间配对相互作用，分子碱基间配对相互作用，RNA结构能结构能够划分为：一级结构、二级结构和三级结构。够划分为：一级结构、二级结构和三级结构。一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构第37页二级结构组成部分二级结构组成部分配对碱基堆积螺旋螺旋之间部分形成环结构第38页二级结构结构空间二级结构结构空间 一条一条RNA序列能够形成多少个二级结构，每个二序列能够形成多少个二级结构，每个二级结构是什么？级结构是什么？序列序列配对配对可能二级结构可能二级结构求解一条求解一条RNA序列所形成二级结构结构空间序列所形成二级结构结构空间第39页配分函数配分函数配分函数是体系内全部元在到达平衡状态时对体配分函数是体系内全部元在到达平衡状态时对体系状态描述系状态描述 第40页RNA 动力学与动力学与RNA功效功效MS2EquilibriumStructureKineticIntermediateStructure第41页RNA折叠动力学折叠动力学热力学：关心自由能稳定性，求解平衡状态“最终止果”。动力学：关心结构之间转变过程，求解到达平衡状态“中间过程”。第42页折叠过程特点折叠过程特点错误折叠结构出现，中间态作用。错误折叠结构出现，中间态作用。试管中试管中tRNAs，自剪切一型内含子和，自剪切一型内含子和5S rRNA 细胞内折叠与试管内折叠含有不一样现象。细胞内折叠与试管内折叠含有不一样现象。伴体、配体与转伴体、配体与转录折叠录折叠(RNA(RNA在转录过程中折叠方式，边转录边折叠在转录过程中折叠方式，边转录边折叠)第43页RNA折叠动力学各种研究方法折叠动力学各种研究方法 研究方法优 点缺 点分子动力学方法能提供微观结构信息。取样不完全。计算效率低，空间时间范围小蒙特卡洛方法方便模拟随机运动轨迹。取样不完全。采取约化单位，时间不明确。传统主方程方法解析方法，不会遗漏结构与运动轨迹。能够求解长时间尺度。构型空间变大时，计算变得很困难。第44页主方程方法主方程方法themtheigenvaluethemtheigenvector流入流出第45页自由能与转变速率自由能与转变速率NU第46页主方程主方程(Master Equation)流入流出第47页主方程方法限制和困难主方程方法限制和困难 构型空间急速扩大后计算效率问题。转录折叠过程中 RNA分子一边延长一边折叠。构型空间不停改变。第48页结合自由能曲面与主方程折叠动结合自由能曲面与主方程折叠动力学计算方法力学计算方法以双螺旋helix作为基本结构单元Helix之间交叠关系二级结构之间转变速率折叠动力学计算第49页以双螺旋以双螺旋helix作为基本结构单元作为基本结构单元传统主方程方法以碱基堆积(stack)为基本结构单元。以自由能曲面为基础，以helix作为基本结构单元，简化构型空间。第50页以以helixhelix为基本单元构建二级结构为基本单元构建二级结构以此结构为例，以stack为基本单元，包含21个stack；以helix为基本单元，包含3个helixABC第51页Helix之间交叠关系之间交叠关系完全兼容，部分兼容，不可兼容。第52页二级结构之间转变速率二级结构之间转变速率断开断开/形成一个形成一个helix速率速率 隧道路径隧道路径helix之间置换过程之间置换过程双臂交换双臂交换两条两条helix转换为另两条转换为另两条helix 第53页Helix折叠速率折叠速率零级近似：零级近似：一级近似：一级近似：二级近似：二级近似：第54页从多个从多个stack开始多通道过程开始多通道过程第55页模型验证模型验证虚线表示一级近似计算结果，+表示二级近似计算结果，实线表示完整主方程方法计算结果。第56页隧道路径隧道路径不可兼容helix之间交换路径第57页转变速率计算方法转变速率计算方法稳态分布近似(steady stable)第58页转变速率转变速率求解上面方程组得到第59页模型验证模型验证 序列G8A3C10A3G8，能够形成两个helix A和B。主方程：kAB=5.64310-7s-1公式：kAB=5.65810-7s-1 第60页 For the 87nt sequence:TPGTTG P(T)20 P CTTCPTP,P=5 CGACCTCAGCATCG P=5 CGATGCTGAGGTCG.纳米核酸开关纳米核酸开关第61页计算结果计算结果预测出中间态结构7会到达87%占据百分比，并会维持长达超出106秒时间（10天）第62页G11CWT丁肝病毒酶丁肝病毒酶（HDV）折叠动力学折叠动力学第63页确定折叠路径确定折叠路径 结构A转换成为结构B结构B转换成为结构A第64页HDV折叠路径折叠路径第65页G11C突变突变HDV序列折叠路径序列折叠路径第66页转录折叠转录折叠聚合酶按照从5端向3端方向转录RNA分子，每转录一个核苷酸就会将其释放到细胞内环境中，于是合成部分长度RNA分子就能够开始折叠了。这种边转录边折叠方式被称为转录折叠。大部分计算方法都是针对完整长度展开长链。而生物体内，RNA是边转录边折叠，而且这种折叠方式与RNA生命功效相关。比如四膜虫一型内含子RNA和核糖开关。第67页占据百分比继承关系占据百分比继承关系 当构型空间扩大时，怎样将前一步几率分配结果继承到下一步中去。相邻步骤之间不一样结构占据百分比继承关系 对于类型a,b,c：P(l+1)bigin=P(l)end对于类型d：P(l+1)bigin=0第68页转录过程中形成结构转录过程中形成结构Sequence:5 GGAACCGUCUCCCUCUGCCAAAAGGUAGAGGGAGAUGGAGCAUCUCUCUCUACGAAGCAGAGAGAGACGAAGG NativestateTranscribedfrom5:1Dconsistedof2helixesPaandPb(100%)。Transcribedfrom3:2RconsistedofPcandPd(90%),10%of1R；mutationUasC:2Roccupy50%。第69页折叠折叠vs转录转录第70页转录速率与结构转录速率与结构第71页折叠vs转录折叠第72页突变序列折叠行为突变序列折叠行为 D稳定性下降，于是相同时间窗口内，D占据百分比下降。250nt/s第73页核糖开关调控机制核糖开关调控机制核糖开关是近年来发觉一类主要非编码RNA调控系统，经过与配体小分子相互作用引发RNA分子构象改变，在转录与翻译水平对基因表示进行调控。第74页addAaddA核糖开关和核糖开关和pbuEpbuE核糖开关核糖开关第75页核糖开关荧光吸收改变试验核糖开关荧光吸收改变试验 完整长度addA核糖开关都会保留结合构型与配体分子结合。完整长度pbuE不会保留结合构型。受体单元长度受体单元长度完整长度完整长度第76页pbuE核糖开关转录折叠过程 第77页Pausing10sat73nt转录暂停与调控转录暂停与调控第78页 靶靶mRNA与与siRNA结合动力学与结合动力学与siRNA效率效率siRNA：（1）细胞外注入（2）形成完全配对（3）切断靶mRNAmiRNA：（1）细胞内产生（2）在植物细胞中：形成完全配对，切断靶mRNA（3）在动物细胞中：形成部分配对，抑制翻译过程第79页siRNA设计设计面临挑战面临挑战怎样确保设计出siRNA拥有可预期高精度和高效率？怎样防止siRNA脱靶效应？第80页靶mRNA结构稳定性与siRNA效率之间存在很强线性关联Ameres et al.Cell()关于靶关于靶mRNAmRNA结构影响结构影响siRNAsiRNA效率争论（效率争论（1 1）第81页siRNA效率不能完全由靶mRNA结构稳定性决定Westerhout et al.Nucleic Acids Res()关于靶关于靶mRNAmRNA结构影响结构影响siRNAsiRNA效率争论（效率争论（2 2）第82页靶靶mRNA初始结构初始结构结合位点靶mRNA初始结构是热力学平衡分布二级结构集合第83页+ESWE*ES1iES+ZippingZippingESjESlES1i酶多重催化模型酶多重催化模型第84页RISC-mRNA相互作用模型相互作用模型RISC与与mRNA识别过程识别过程仅能够发生在仅能够发生在siRNAseed区域？区域？Jinek,M.and J.A.Doudna()siRNAseed区域暴露在RISC外部siRNAseed区域：siRNA 5端2-7nt第85页RISC与与mRNA识别过程不但发生在识别过程不但发生在siRNAseed区域区域设定RISC与mRNA识别过程只发生在siRNAseed区域试验结果第86页造成上述现象原因造成上述现象原因Seed区域完全相同非Seed区域存在差异第87页RISC与与mRNA识别识别过程过程还还发生发生在在siRNA非非seed区域区域同时考虑RISC与mRNA在siRNAseed区域和非seed区域结合位点c=S0=2.610-10 kc=0.2s-1 第88页假如将RISC-mRNA相互作用过程视为siRNA-RNA杂交过程RISC-mRNARISC-mRNA相互作用过程不一样于相互作用过程不一样于siRNA-mRNAsiRNA-mRNA杂交过程杂交过程试验结果第89页造成上述现象原因造成上述现象原因MOD12和MOD14结构稳定性差异主要来自于发夹环差异，不过发夹环对siRNA-RNA杂交动力学过程贡献非常小第90页焓变差异：-9.8kcal/mol熵变差异：-32.2e.u.Parker et al()Seed区域非Seed区域RISCRISC中蛋白质对核酸杂交影响中蛋白质对核酸杂交影响第91页RISCRISC与靶与靶mRNAmRNA在在seedseed区域结合速率快区域结合速率快于非于非seedseed区域（区域（seedseed效应效应）不考虑RNA序列，将蛋白质引发熵焓改变平均分配到seed区域7个碱基堆积上，即 第92页蛋白质表示率也与靶蛋白质表示率也与靶mRNA结构相关结构相关Seed区域非Seed区域第93页模拟模拟siRNA脱靶效应脱靶效应第94页siRNA脱靶效应不能仅仅依靠降低脱靶效应不能仅仅依靠降低siRNA剂量来消除剂量来消除siRNA脱靶效应能否经过siRNA剂量来调整由靶mRNA结构来决定。第95页