基于IL-6_STAT3信号通路探讨山楂酸对小鼠结肠癌CT26细胞增殖、凋亡的影响.pdf

基金项目:福建省自然科学基金面上项目(.)国家自然科学基金青年项目(.)作者简介:李智男硕士生研究方向:中药抗肿瘤药理:.通信作者:陈莉女硕士副教授研究方向:中药抗肿瘤药理:.基于/信号通路探讨山楂酸对小鼠结肠癌 细胞增殖、凋亡的影响李智陈莉(福建中医药大学药学院福建 福州)摘要:目的 从/信号通路探讨山楂酸()对小鼠结肠癌 细胞增殖、凋亡的影响 方法体外培养 细胞设置空白组、组 干预 后采用 法检测山楂酸对细胞活力的影响采用 检测 表达水平采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率采用 检测各组细胞中 通路相关蛋白的表达水平 设置空白组、(m)刺激组、不同浓度 与 共刺激组采用 检测各组细胞、蛋白的表达水平 设置空白组、组、磷酸酶抑制剂(正钒酸钠)组和 正钒酸钠组采用 检测各组细胞、蛋白的表达水平结果 与空白组相比 结果显示、浓度的山楂酸均能降低 细胞活力(.).结果显示、给药组细胞中 水平下降(.)流式细胞术结果显示、给药组细胞凋亡率增加(.)结果显示、给药组细胞中 通路相关蛋白、蛋白表达水平下降(.)正钒酸钠组能恢复 单独给药组中被降低的 蛋白水平(.)结论 可能通过降低 的表达水平抑制 的磷酸化从而降低抗凋亡蛋白 的表达促进肿瘤细胞凋亡抑制其增殖关键词:山楂酸结肠癌 细胞凋亡/信号通路中图分类号:.文献标志码:文章编号:():././():()/.(m).().(.).(.).药学研究 .(.).(.).(.).:/结肠癌()是一种常见的胃肠道恶性肿瘤为世界范围内五大主要癌症之一中国结肠癌发病率位居全国第 位死亡率居于全国第 位且发病率和死亡率仍在逐年上升 结肠癌的发病与遗传、饮食、肠道的慢性炎症等因素相关由于其发病早期症状较隐匿加大了早期发现、治疗的难度晚期生存预后较差 目前放疗、化疗、手术治疗是 的主要治疗方法近年来许多研究表明中药中的有效成分能抗肿瘤增殖及减少肿瘤的转移有利于提高患者生存期改善预后提高患者生存质量等优点成为当下结肠癌新药探索开发的热点山楂酸()是一种五环三萜酸存在于山楂、橄榄等多种天然植物中具有丰厚的药用价值 近年来相关研究显示其具有抗肿瘤、抗炎等生物活性 已有研究表明山楂酸在体内外表现出对结肠癌的治疗作用山楂酸可通过/信号通路抑制结肠癌细胞 与 的增殖与迁移阻滞人结肠癌 细胞周期至期激活 和 诱导肿瘤细胞凋亡同时山楂酸也能降低 二甲基肼诱导的结肠癌大鼠模型中肿瘤前生物标志物的含量 信号转导及转录激活因子()与多种恶性肿瘤的发生、发展关系最为密切备受研究者的关注 但目前国内外暂未有研究报道山楂酸对小鼠结肠癌 细胞中 信号通路的影响 本研究基于 信号通路探讨山楂酸对小鼠结肠癌 细胞增殖、凋亡的影响为深入研究山楂酸在抗结肠癌的基础研究和临床应用提供理论和实验依据 实验材料.实验细胞 小鼠结肠癌细胞()购自武汉普诺赛生物科技有限公司.实验试剂 山楂酸(宝鸡市辰光生物科技有限公司)磷酸酶抑制剂正钒酸钠(公司)磷酸盐缓冲液、青链霉素、培养基等试剂(公司)胎牛血清(公司)(公司)(公司)试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)、磷酸化()、淋巴细胞瘤基因()抗体(公司)内参肌动蛋白()抗体(公司)二抗(公司)抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)逆转录试剂盒(赛默飞公司)荧光染料定量预混液(南京诺维赞生物科技有限公司)无蛋白快速封闭液(上海雅酶生物科技有限公司).实验仪器 电子分析天平(岛津公司)超纯水装置(公司)/三气培养箱(上海力申科学仪器有限公司)多功能酶标仪(公司)小型槽式转印系统、电泳槽(公司)化 学 发 光 成 像 仪(公司)流式细胞仪(安捷伦公司)实验方法.细胞培养小鼠结肠癌 细胞用含 和 青链霉素双抗的 培养基培养于、的恒温培养箱中胰酶消化传代.法检测细胞活力 将处于对数生长期的 细胞消化收集细胞计数 调整细胞浓度后以 /孔的密度接种到 孔板中(/孔)放回培养箱中继续培养过夜 次日吸弃培养基分为空白对照组、山楂酸(、)组每孔加入 相应浓度的药物放回培养箱中继续培养 后每孔加入 的 工作液 再放回培养箱继续孵育 后使用酶标仪在 波长下检测每孔的吸光度()值并根据公式计算细胞活力细胞活力给药处理组吸光度值/未给药空白组吸光度值.流式细胞术检测细胞凋亡率将处于对数生长期的 细胞消化收集细胞并计数 调整细胞浓度后以 孔的密度接种到 孔板中放回培养箱中继续培养过夜 次日吸弃培养基分为空药学研究 .白对照组、山楂酸(、)组加入药物干预 后收集细胞根据细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色避光染色一段时间后上机检测细胞凋亡率.检测 表达水平 将处于对数生长期的 细胞消化收集细胞并计数 调整细胞浓度后以 孔的密度接种到 孔板中让细胞生长贴壁过夜后吸弃原培养基分为空白对照组、山楂酸(、)组加入药物处理 后用 抽提试剂盒提取细胞总 测定 浓度后取适量 进行逆转录逆转录取 上样检测.检测细胞蛋白表达水平将处于对数生长期的 细胞消化收集细胞并吹打混匀制备成单细胞悬液并计数 调整细胞浓度后以/孔的密度接种于 孔板中放回培养箱中继续培养过夜 次日吸弃培养基分为空白对照组、山楂酸(、)组加入药物干预 后收集细胞裂解后提取细胞总蛋白测定浓度后加入 蛋白上样缓冲液于 变性 后根据蛋白浓度定量结果吸取蛋白样品经 凝胶电泳电泳结束后将蛋白转膜至 膜上无蛋白快速封闭液封闭 封闭结束后加入相应的一抗 孵育过夜 次日使用 缓冲液洗膜 次室温孵育二抗 缓冲液洗膜 次 滴加 显影液曝光显影使用 软件分析条带灰度值.统计学方法 实验数据计量资料均以均数标准差()表示并采用 .软件进行分析 各组数据符合正态性检验时组间比较采用单因素方差分析()各组数据不符合正态性检验时组间比较采用非参数检验.表示具有显著差异.表示具有极显著差异 实验结果.不同浓度山楂酸对 细胞活力的影响与空白组相比 细胞经不同浓度山楂酸处理 后细胞增殖活力降低且呈现剂量依赖性、浓度的山楂酸能降低 细胞活力(.).不同浓度山楂酸对 细胞凋亡的影响 如图 所示与空白组相比 细胞经不同浓度山楂酸处理 后、山楂酸能显著增加 细胞凋亡率(.)低浓度山楂酸(、)则对细胞总凋亡率无显著影响图 山楂酸对 细胞凋亡的影响 注:与空白组比较.不同浓度山楂酸对 细胞中 表达水平的影响 与空白组相比 细胞经不同浓度山楂酸处理 后 表达水平降低且呈现剂量依赖性、浓度的山楂酸能显著降低 细胞中 的表达水平(.).不同浓度山楂酸对 细胞中、蛋白表达水平的影响 如图 所示与空白组相比 细胞经不同浓度山楂酸处理 后、山楂酸能显著降低细胞中 蛋白的表达(.)同时如图 所示山楂酸也能够抑制 刺激后 细胞中 蛋白的表达水平且在、有显著差异图 山楂酸对 细胞中 蛋白表达水平的影响 注:与空白组比较.图 山楂酸对 诱导的 细胞中 蛋白表达水平的影响 注:与空白组比较.与 刺激组比较.不同浓度山楂酸对 细胞中、蛋白表达水平的影响如图 所示与空白组相比 细胞经不同浓度山楂酸处理 后 细胞中、蛋白表达水药学研究 .平没有明显变化、浓度的山楂酸能显著降低 蛋白的表达水平图 山楂酸对 细胞中 蛋白表达水平的影响图 山楂酸对 细胞中 蛋白表达水平的影响 注:与空白组比较.磷酸酶抑制剂正钒酸钠影响山楂酸对 细胞中 蛋白水平的抑制作用如图 所示与单用山楂酸组相比 山楂酸 正钒酸钠组细胞中 蛋白的表达水平有所忧复且与空白组细胞中 蛋白表达水平相当图 山楂酸、正钒酸钠对 细胞中 蛋白表达水平的影响 注:与山楂酸 组比较.讨论结肠癌是第三种最常见的恶性肿瘤影响着全球数百万人 美国癌症协会发表的统计数据显示:结肠癌的发病率为.死亡率已经达到 了.肿瘤细胞的异常增殖和凋亡减少是其恶性发展的基础故肿瘤治疗的关键是抑制其增殖和促进其凋亡 本研究结果显示经山楂酸处理后的 细胞活力降低细胞增殖抑制率呈浓度依赖性升高流式细胞术结果显示经山楂酸处理后的 细胞凋亡率增加同时 结果显示山楂酸能够显著下调 下游抗凋亡蛋白 蛋白的表达水平 以上结果说明山楂酸可影响 细胞的恶性生物学能够抑制其异常增殖并诱导凋亡且有一定的浓度依赖性吸烟、饮酒过度、食炎症性肠病等是诱发结肠癌的危险因素这其中慢性炎症与结肠癌的发病密切相关 有研究发现在结肠癌患者的血清和肿瘤组织中发现了高表达的 且其表达水平与患者的肿瘤大小、转移情况、预后和生存率均有关 是一种促炎性细胞因子与细胞表面的 结合受体蛋白()结合后可引发经典信号通路途径在细胞质中募集并激活 激酶蛋白而后磷酸化其受体酪氨酸残基 继而激活 的磷酸化 磷酸化的 形成同源二聚体并发生核转位后可结合并激活靶基因的转录最终调节 靶基因的表达实现其各种生物学功能 的异常活化与多种恶性肿瘤的发生与发展密切相关已有大量研究表明抑制 活化已成为抗肿瘤治疗有效手段的潜力 本研究结果显示 细胞经山楂酸处理后细胞中 的水平降低同时细胞中 蛋白的表达水平显著下降这提示山楂酸能够降低细胞中 的表达水平并进一步抑制 的活化 同时山楂酸也能够有效抑制 所诱导的 细胞中的 磷酸化 在许多血液性和实体肿瘤中高度活化肿瘤细胞中的蛋白酪氨酸激酶()直接募集 激酶()使 发生磷酸化而活化随后活化的 促使 的 位点磷酸化而活化 为了进一步深入探究山楂酸是如何影响 的活化本研究检测了经山楂酸处理的 细胞中 上游激酶、蛋白的表达水平结果显示山楂酸对上游激酶、的蛋白表达水平没有影响 于是后期实验引入了磷酸酶抑制剂正钒酸钠进一步探究山楂酸对 活化的影响结果显示磷酸酶抑制剂可以逆转山楂酸对 活性抑制显著上调 蛋白的表达水平 以上实验结果提示山楂酸抑制 的活化可能是通过促进磷酸酶降解 蛋白来实现的与上游激酶 无关综上所述山楂酸能够抑制 细胞增殖诱导细胞凋亡且呈现一定的浓度依赖性其可能是通过抑制 信号通路相关蛋白的活化来实现的这为山楂酸体外抗结肠癌提供了一定的实验依据但其体内外抗结肠癌活性与机制值得进一步深入探究(下转第 页)药学研究 .法研究进展.中国现代中药():.孙萍李新朋薛涛等.金莲花药理作用及临床应用研究进展.中国药房():.刘少楷.塞罕坝金莲花茶农产品地理标志品牌化策略研究.福建茶叶():.蔡红业刘海松郑国华等.金莲花化学成分和药理活性研究进展.世界科学技术中医药现代化():.曾小燕李鸿霞梁纪强等.中药多糖体外抗氧化作用研究进展.亚太传统医学():.卞娅葛广波丁侃.中药多糖抗病毒机制研究进展.上海中医药大学学报():.李旭张雪燕杨世培等.中药多糖抗衰老作用机制研究进展.中国实验方剂学杂志():.周艾玲王段珩岳晓蕾等.中药多糖抗肿瘤作用研究进展.中国实验方剂学杂志():.陈锋张帆郝二伟等.中药多糖防治糖尿病及其并发症的作用机制研究进展.中国实验方剂学杂志():.代云云谢晓蓉王鹏波等.中药多糖降脂作用机理的研究进展.中药药理与临床():.赖梦亭肖平方悦悦等.中药多糖免疫调节作用机制研究进展.中草药():.国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版(一部).北京:中国医药科技出版社:.刘宇戴沅霖马越等.金银花粗多糖提取工艺优化及其抗氧化活性评价.食品工业科技():.刘旭东张玉超朱思洁等.枳椇果梗多糖的提取工艺优化及其抗氧化性.食品工业科技():.饶娜王树林曹欣欣等.金莲花多糖的分离纯化及其抗氧化活性研究.神经药理学报():.(收稿日期:)(上接第 页)参考文献:.:.():.():.张小凤王雅楠石彩冬等.中药复方治疗结肠癌研究进展.山西中医():.罗康宁刘昌化.山楂酸通过调控 损伤修复逆转结人结肠癌 细胞 氟尿嘧啶耐药.中药材():.周芳亮胡梅胡晶等.山楂酸通过/通路诱导鼻咽癌 细胞自噬研究.中草药():.():.():.():.():.():.:.():.杨雅钧许立拔王孝勋等.基于/信号通路探讨对叶百部总生物碱对人结肠癌 细胞增殖、凋亡的影响.广西医学():.章尤权沈冬祎罗秀等.基于/信号通路探讨熊果酸对人结肠癌 细胞增殖和凋亡的影响.福建中医药():./.():.(收稿日期:)药学研究 .