生物化学酶化学省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第三章 酶化学Enzymology第1页研究历史n1.1833年佩延（Payen）和Persoz从麦芽中抽提出一个对热敏感物质，这种物质能将淀粉水解成可溶性糖，被称为淀粉糖化酶（diastase）n2.巴斯德提出“酵素”一词，认为只有活酵母细胞才能进行发酵。现在日本还经常使用“酵素”一词（ferment）。第2页n3.1878年德国人库恩（Kuhne）提出“Enzyme”一词，意为“在酵母中”。n4.1896年德国人巴克纳（Buchner）弟兄用石英砂磨碎酵母细胞，得到了能催化发酵无细胞滤液，证实发酵是一个化学反应，与细胞活力无关。第3页n5.19米凯利斯（Michaelis）和门顿（Menten）利用物理化学方法提出了酶促反应动力学原理米氏学说，使酶学能够定量研究。n6.1926年美国人J.B.Sumner从刀豆中结晶出脲酶（第一个酶结晶），并提出酶是蛋白质观点。以后陆续得到各种酶结晶，证实了这种观点，萨姆纳因而取得1947年诺贝尔奖。第4页7.进入80年代后，核糖酶（ribozyme）、抗体酶、模拟酶等相继出现，酶传统概念受到挑战。1982年Cech等发觉四膜虫26S rRNA前体含有自我剪接功效，并于1986年证实其内含子L-19 IVS含有各种催化功效。今后陆续发觉各种含有催化功效RNA，底物也扩大到DNA、糖类、氨基酸酯。第5页第一节第一节 通论（通论（General Introduction）一一 酶是生物催化剂酶是生物催化剂1 酶概念：酶是活细胞产生含有催化作用蛋白质。它含有高酶概念：酶是活细胞产生含有催化作用蛋白质。它含有高度专一性、高效催化性、活性可调性和代谢性等催化特点。度专一性、高效催化性、活性可调性和代谢性等催化特点。2 酶概念提出及当前内涵问题（酶概念提出及当前内涵问题（Enzyme/Ribozyme）1982年，年，Cech首先发觉首先发觉RNA也含有酶催化活性，并提出也含有酶催化活性，并提出核酶（核酶（ribozyme）概念。）概念。1995年年Cuenoud等发觉等发觉DNA也有酶活性。也有酶活性。3 酶是蛋白质证据（酶化学本质）酶是蛋白质证据（酶化学本质）遇热、两性、变性、胶体性质、蛋白酶降解、测序、合成遇热、两性、变性、胶体性质、蛋白酶降解、测序、合成第6页二二 酶催化特征酶催化特征1 1 与普通催化剂相同点与普通催化剂相同点 反应前后不变；热力学上允许反应；缩短抵达平衡点时间反应前后不变；热力学上允许反应；缩短抵达平衡点时间;降低分子活化能。降低分子活化能。2 2 催化特征（与普通催化剂相同点）催化特征（与普通催化剂相同点）高效催化性高效催化性(10(108 8-10-101212/10/103 3)；高度专一性；活性可调性；高度专一性；活性可调性；代谢性；对环境非常敏感。代谢性；对环境非常敏感。3 3专一性特点专一性特点 专一性：对底物选择性要求。专一性：对底物选择性要求。类型类型 结构专一（键专一、基团专一、底物专一）结构专一（键专一、基团专一、底物专一）立体异构专一（几何异构；旋光异构）立体异构专一（几何异构；旋光异构）第7页催化剂催化剂每摩尔需活化能每摩尔需活化能无无18 000J18 000J胶态钯胶态钯11 700J11 700J过氧化氢酶过氧化氢酶2 000J2 000J过氧化氢分解反应所需活化能过氧化氢分解反应所需活化能第8页锁钥学说（Lock and key model)Fisher 首次提出首次提出(1894,德国）德国）第9页三点附着学说(Three point attachment theory)A.Ogster首次提出首次提出第10页 酶与底物结合诱导契合学说示意图酶与底物结合诱导契合学说示意图诱导契合学说诱导契合学说(Induced fit theory)Koshland 首次提出（首次提出（1958）第11页第二节第二节 酶分类和命名酶分类和命名一一 酶命名酶命名-ase-aseECEC：Enzyme commissionEnzyme commission1 1 习惯名（习惯名（Recommended nameRecommended name）19611961年以前年以前 底物（淀粉酶）；催化性质（脱氢酶）；起源（胃蛋白酶）底物（淀粉酶）；催化性质（脱氢酶）；起源（胃蛋白酶）2 2 系统名（系统名（Systematic nameSystematic name）底物：底物底物：底物 性质性质 酶酶 例子：谷丙转氨酶例子：谷丙转氨酶=L-=L-丙氨酸：丙氨酸：-同戊二酸氨基转移酶同戊二酸氨基转移酶 蛋白（：水）水解酶蛋白（：水）水解酶3 3 编号编号乳酸脱氢酶；乳酸：乳酸脱氢酶；乳酸：NADNAD+脱氢酶脱氢酶;EC;EC：1.1.1.271.1.1.27第12页二二 酶国际系统分类法酶国际系统分类法1 标准标准 大类大类-亚类亚类-亚亚类亚亚类-序号序号 第13页分类按反应类型（1）氧化还原酶（2）转移酶（3）水解酶（4）裂合酶（5）异构酶（6）合成酶按酶结构按酶组成单体酶寡聚酶多酶体系多酶融合(复合)体单纯酶结合酶第14页1.氧化还原酶催化氧化还原反应，量最大一类酶，具氧化、产能、解毒功效。通式：通式：AHAH2 2+BBH+BBH2 2+A+A系统命名可分为19亚类，习惯上可分为4个亚类：(1)脱氢酶：受体为NAD或NADP，不需氧。(2)氧化酶：以分子氧为受体，产物可为水或H2O2，常需黄素辅基。(3)过氧化物酶：以H2O2为受体，常以黄素、血红素为辅基。(4)氧合酶（加氧酶）：催化氧原子掺入有机分子，又称羟化酶。按掺入氧原子个数可分为单加氧酶和双加氧酶。第15页2.移换酶类 催化功效基团转移反应，也叫转移酶 通式：通式：AR+BBR+AAR+BBR+A 按转移基团性质，可分为8个亚类，较主要有：(1)一碳基转移酶：转移一碳单位，与核酸、蛋白质甲基化相关(2)磷酸基转移酶：常称为激酶，多以ATP为供体。少数蛋白酶也称为激酶（如肠激酶）(3)糖苷转移酶：与多糖代谢亲密相关，如糖原磷酸化酶。(4)氨基转移酶：转移氨基，如AST ALT第16页3、水解酶类 催化底物水解反应，如蛋白酶、脂肪酶等。通式：通式：AB+HAB+H2 2OAH+BOHOAH+BOH 起降解作用，多位于胞外或溶酶体中。有些蛋白酶也称为激酶。可分为水解酯键、糖苷键、肽键、碳氮键等11亚类。第17页n4、裂合酶类n 催化从底物上移去一个小分子而留下双键双键反应或其逆反应。通式：通式：ABA+B ABA+Bn包含醛缩酶、水化酶、脱羧酶等。共7个亚类。第18页n5、异构酶类n 催化同分异构体之间相互转化。通式：通式：ABAB 其中：其中：A A、B B为同分异构为同分异构n包含消旋酶、异构酶、变位酶等。共6个亚类。第19页6、合成酶类 催化由两种物质合成一个物质，必须与ATP分解相偶联。也叫连接酶，如DNA连接酶。通式：通式：A+B+ATPAB+ADP+Pi A+B+ATPAB+ADP+Pi 或或 A+BAB+AMP+PPi A+BAB+AMP+PPi共5个亚类。第20页第21页第22页第23页第24页归纳归纳：氧：氧 转转 水水 裂裂 异异 合合第25页（二）按酶结构分类1.单体酶 由一条肽链组成酶称为单体酶2.寡聚酶：由多条肽链以非共价键结合而成酶3.多酶体系：一些功效相关酶组织在一起，形成一个酶系4.多酶融合(复合)体：一条肽链上有各种酶活性，称为多酶复合体第26页（三）按化学组成单纯酶及结合酶单纯酶：完全由蛋白质（氨基酸）组成，无辅助因子。属简单蛋白质，如水解酶第27页结合酶结合酶：属结合蛋白，除蛋白质外，还有非蛋白部分辅助因子：金属离子或有机小分子酶蛋白决定酶专一性；辅助因子决定催化反应性质和基团电子等传递第28页辅助因子分类辅助因子分类（按其（按其与酶蛋白结合紧密程度与酶蛋白结合紧密程度）辅酶辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤方透析或超滤方法除去。法除去。辅基辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，不能用紧密，不能用透析或超透析或超滤方法除去滤方法除去。第29页第三节第三节 酶催化作用结构基础酶催化作用结构基础一一 酶分子结构特征酶分子结构特征1 酶活性部位酶活性部位 活性部位（中心）：活性部位（中心）：与底物结合并与酶催化作用直接相与底物结合并与酶催化作用直接相 关部位称为酶活性部位（中心）。关部位称为酶活性部位（中心）。必需基团：必需基团：利用化学修饰将其改变能破坏酶活性相关基利用化学修饰将其改变能破坏酶活性相关基 团称为必需基团团称为必需基团第30页酶分子结构特征酶分子结构特征酶蛋白酶蛋白非必需基团非必需基团必需基团必需基团活性中心活性中心活性中心活性中心以外基团以外基团结合基团结合基团催化基团催化基团第31页酶活性中心示意图第32页酶活性中心酶活性中心酶活性中心酶活性中心第33页 活性中心氨基酸按功效可分为：结合部位结合部位：负责识别特定底物并与之结合。它们决定了酶底物专一性。第34页催化部位催化部位：起催化作用，底物敏感键在此被切断或形成新键，并生成产物。第35页AspHisSer胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶活活性性中中心心活性中心主要基团活性中心主要基团:His57,Asp102,Ser195第36页3 活性中心研究方法1.酶分子侧链基团修饰法(1)非共价特异修饰法：(2)特异性共价修饰法(3)亲和标识法第37页2.动力学参数测定方法3.X射线晶体结构分析法4.定点诱变法第38页二二 酶原及酶原激活酶原及酶原激活没有催化活性酶前体称为酶原（没有催化活性酶前体称为酶原（zymogen）。）。由酶原转变成含有催化作用酶过程称为酶原激活（由酶原转变成含有催化作用酶过程称为酶原激活（activation）。）。这是一个化学改变过程，实质是形成活性中心过程。这是一个化学改变过程，实质是形成活性中心过程。第39页第四节第四节 酶催化作用机理酶催化作用机理一一 酶催化作用机理酶催化作用机理 降低分子活化能。降低分子活化能。有效碰撞有效碰撞-活化分子活化分子-活化能活化能 中间产物学说中间产物学说中间产物中间产物-过渡态过渡态 E+S=ES=EP P+S过渡态过渡态第40页n 中间产物学说及活化能n19Henri Wurtz提出第41页第42页怎样降低活化能？高效催化原因怎样降低活化能？高效催化原因邻近定位效应邻近定位效应张力与形变张力与形变普通酸碱催化普通酸碱催化共价催化共价催化金属离子催化金属离子催化第43页底物与酶邻近效应及定向效应邻近效应：指酶与底物形成中间复合物(ES)后，使催化基团与底物结合成同一个分子而使有效浓度得到极大提升。定向效应：指酶催化基团与底物反应基团之间正确取位所产生效应第44页n包含n反应基团之间、酶催化基团和底物反应基n团之间。活性中心内定向使反应变成份子n内反应第45页底物形变及诱导契合第46页第47页酸碱催化狭义：H+OH-参加催化广义：H+OH-供体或受体参加催化机制在机体内，多数处于中性条件，所以狭义酸碱催化所以占百分比很小，多数是弱酸弱碱参加反应第48页第49页第50页共价催化：又称亲核催化或亲电子催化亲核试剂或亲电子试剂能分别释放电子或汲取电子并作用于底物缺电子中心或负电中心，快速形成不稳定共价中间复合物 常见亲核基团有：Ser-OHCys-OH His-OH经典亲电子中心有：磷酰基、酰基、糖基第51页第52页金属离子催化金属离子催化提升水亲核性能提升水亲核性能第53页五五 几个酶结构事例（略）几个酶结构事例（略）第54页第五节 酶促反应动力学有哪些原因影响酶促反应呢？有哪些原因影响酶促反应呢？酶浓度、底物浓度、温度、酶浓度、底物浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂、激活剂、抑制剂一一 酶浓度影响酶浓度影响 底物浓度足够情况下：底物浓度足够情况下：v=kEV=kEt第55页二二 底物浓度对反应速度影响底物浓度对反应速度影响 （一）酶催化单底物反应（多底物非常复杂）（一）酶催化单底物反应（多底物非常复杂）第56页当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。SSV VVmaxVmax第57页当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。零级反应。SSV VVmaxVmax第58页伴随底物浓度增高伴随底物浓度增高反应速度不再成正百分比加速；反应为反应速度不再成正百分比加速；反应为混合级反应。混合级反应。SSV VVmaxVmax第59页 S 初速度 v0VmaxKm1/2Vmax_ 图5-14 底物浓度对酶促反应速度影响bca在酶促反应起始时阶段反应速率快速增高呈这种反应速率与底物浓度呈正比反应为一级反应（a段）。直线上升，第60页当反应体系中酶分子大部分与底物结合时，反应速率增高则渐渐变缓，即反应第二阶段为混合级反应(b段)。S 初速度 v0VmaxKm1/2Vmax_ 图5-14 底物浓度对酶促反应速度影响bca第61页底物浓度继续增加，全部酶分子均被底物饱和，反应速率不再增加，此时反应速率与底物浓度增加无关,反应为零级反应(c)，曲线出现平坦。S 初速度 v0VmaxKm1/2Vmax_ 图5-14 底物浓度对酶促反应速度影响bca第62页酶促反应速度V与底物浓度S关系第63页（二）（二）Michaelis-Menten方程和米氏常数方程和米氏常数 第64页米氏方程式推导起源于中间产物学说米氏方程式推导起源于中间产物学说 解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系最合理学说解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系最合理学说是中间产物学说。该学说认为酶促反应形成酶底物是中间产物学说。该学说认为酶促反应形成酶底物复合物（复合物（ES），即中间产物，然后此复合物再分解为），即中间产物，然后此复合物再分解为产物和游离酶。产物和游离酶。E +SESE +Pk1k2k3酶底物中间产物产物酶第65页 米氏方程式（米氏方程式（Michaelis equation）：）：Vmax 为最大反应速率（为最大反应速率（maximum velocity）S为底物浓度为底物浓度 Km 为米氏常数（为米氏常数（Michaelis constant）V 为不一样为不一样S时反应速率时反应速率 VmaxSKm+SV=第66页 米氏方程式推导以两个假设为前提：米氏方程式推导以两个假设为前提：稳态观念，当酶促反应趋于稳态时稳态观念，当酶促反应趋于稳态时ES生生成速率与分解速率相等。成速率与分解速率相等。酶促反应中酶促反应中S大大高于大大高于E，所以，所以S改改变在反应过程可忽略不计。变在反应过程可忽略不计。第67页（三）（三）Km和和Vmax意义意义1.当当反反应应速速率率为为最最大大速速率率二二分分之之一一时时，米米氏方程为：氏方程为：Km=S这表示这表示Km值等于酶促反应速率为最大速率值等于酶促反应速率为最大速率二分之一时底物浓度。二分之一时底物浓度。第68页2.一一些些酶酶K2K3，即即ES解解离离成成E和和S速速率率显显著著超超出出分分解解成成E和和P速速率率，K3可可忽忽略略不不计计，即即此此时时m近近似似ES解解离离常常数数Ks。在在这种情况下这种情况下Km可表示酶和和底物亲和力。可表示酶和和底物亲和力。第69页3.Km值是酶特征性常数，它与酶结构，酶值是酶特征性常数，它与酶结构，酶所催化底物和反应环境如温度、所催化底物和反应环境如温度、pH、离、离子强度等相关，而与酶浓度、底物浓度子强度等相关，而与酶浓度、底物浓度无关。无关。实际意义：实际意义：判断最适底物；推测天然底物；推断正逆向催化反应效率。判断最适底物；推测天然底物；推断正逆向催化反应效率。第70页（四）四）Km和和Vmax测测 定定 Lineweaver和和Burk将将米米氏氏方方程程作作双双倒倒数数变变换换处处理理，将将矩矩形形双双曲曲线线变变成成直直线线作作图图，便便可可较较轻轻易易地地用用该该直直线线求得求得Vmax和和Km。第71页2 双底物酶促反应动力学次序机制次序机制 有序次序机制有序次序机制 随机次序机制随机次序机制乒乓机制乒乓机制第72页三 温度对酶促反应影响 酶促反应速率最大时环境温度称为酶促反应最适温度酶促反应速率最大时环境温度称为酶促反应最适温度（optimum temperature）。）。温度对酶促反应速率影响 第73页四四 pH对酶促反应速率影响对酶促反应速率影响 酶催化活性最大时环境酶催化活性最大时环境pH称为酶促反应最适称为酶促反应最适pH(optimum pH)。各种酶最适各种酶最适pH不一样。不一样。n动动物物体体内内酶酶最最适适pH在在6.58之之间间，少少数数酶酶也也有有例例外外，如如胃胃蛋蛋白白酶酶最最适适pH为为1.8，精精氨氨酸酸酶酶最最适适pH为为9.8。n植物为植物为4.56.5。最最适适pH不不是是酶酶特特征征性性常常数数，它它受受底底物物浓浓度度，缓冲液浓度和种类及酶纯度等影响。缓冲液浓度和种类及酶纯度等影响。第74页 pH对酶促反应速率影响对酶促反应速率影响经典经典非经典非经典第75页 温度对酶促反应速率影响温度对酶促反应速率影响 pH对酶促反应速率影响对酶促反应速率影响经典经典第76页五五 激活剂影响激活剂影响 凡是能提升酶活性加速酶促反应物质都称为激活剂凡是能提升酶活性加速酶促反应物质都称为激活剂（activator）。）。1 无机离子无机离子 金属离子：金属离子：K+Na+Ca2+Mg2+Zn2+Fe2+阴离子：阴离子：Br-Cl-I-CN-PO34-2 小分子有机化合物小分子有机化合物 还原剂（抗坏血酸、还原剂（抗坏血酸、GSH等）、等）、EDTA3 生物大分子生物大分子 蛋白激酶系统；霍乱毒素激活腺苷酸环化酶蛋白激酶系统；霍乱毒素激活腺苷酸环化酶激活剂作用含有选择性。激活剂作用含有选择性。第77页六六 抑制剂影响抑制剂影响 抑制剂（抑制剂（inhibitor）使酶活力下降，但不引发酶蛋白变性作用称为抑制作用。使酶活力下降，但不引发酶蛋白变性作用称为抑制作用。能引发抑制作用物质叫做酶抑制剂。能引发抑制作用物质叫做酶抑制剂。抑制剂与酶分子上一些必需基团反应，引发酶活力下降，抑制剂与酶分子上一些必需基团反应，引发酶活力下降，甚至丧失，但并不使酶变性。甚至丧失，但并不使酶变性。凡使蛋白质凡使蛋白质变性变性而引发酶活力丧失作用称为失活作用。蛋而引发酶活力丧失作用称为失活作用。蛋白变性都能够失去活性，白变性都能够失去活性，变性剂变性剂没有选择性，而抑制剂普没有选择性，而抑制剂普通有选择性。通有选择性。第78页抑制作用类型抑制作用类型 非专一性不可逆抑制非专一性不可逆抑制 不可逆抑制作用不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制专一性不可逆抑制 抑制作用抑制作用 竞争性抑制竞争性抑制 可逆抑制作用可逆抑制作用 非竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制第79页1 1 不可逆抑制不可逆抑制(irreversible inhibition)(irreversible inhibition)这类抑制剂通常以这类抑制剂通常以共价键共价键与酶结合，不能用透析、超与酶结合，不能用透析、超滤等方法除去。多为非生物物质。滤等方法除去。多为非生物物质。按抑制剂选择性，又可分为：按抑制剂选择性，又可分为：专一性与非专一性不可逆抑制剂。常见：专一性与非专一性不可逆抑制剂。常见：（1 1）重金属离子、有机汞、有机砷化合物）重金属离子、有机汞、有机砷化合物 多与活性中心多与活性中心-SH-SH结合，抑制含结合，抑制含-SH-SH酶。酶。第80页（2 2）有机磷化合物）有机磷化合物 能与酶活性中心丝氨酸共价结合而使酶失去活性。如有能与酶活性中心丝氨酸共价结合而使酶失去活性。如有机磷农药、敌敌畏、敌百虫等。称为神经毒剂。机磷农药、敌敌畏、敌百虫等。称为神经毒剂。胆碱酯酶与中枢神经传到相关。分解乙酰胆碱为乙酰和胆碱胆碱酯酶与中枢神经传到相关。分解乙酰胆碱为乙酰和胆碱第81页（3 3）氰化物和一氧化碳）氰化物和一氧化碳 抑制呼吸链抑制呼吸链2 2 可逆抑制作用（可逆抑制作用（reversible inhibitionreversible inhibition）分成三种情况：分成三种情况：竞争性抑制作用（竞争性抑制作用（competitive inhibitioncompetitive inhibition）非竞争性抑制作用（非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibitionnoncompetitive inhibition）反竞争性抑制作用（反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibitionuncompetitive inhibition）第82页（1 1）竞争性抑制）竞争性抑制 抑制剂和底物竞争性与酶结合产生竞争作用。抑制剂和底物竞争性与酶结合产生竞争作用。第83页v=Vmax SKm(1+)IKi+S第84页特点特点抑制剂结构与底物类似，结合部位相同抑制剂结构与底物类似，结合部位相同,与与活性中心活性中心结合，结合，酶活性降低酶活性降低 Km增大。抑制剂浓度与其抑制程度成正比。增大。抑制剂浓度与其抑制程度成正比。Vmax不变。能够经过增加底物浓度方法克服抑制。不变。能够经过增加底物浓度方法克服抑制。双倒数直线相交于双倒数直线相交于纵纵轴轴第85页第86页第87页草酸盐草酰乙酸丙二酸戊二酸第88页（2）非竞争性抑制）非竞争性抑制 底物和抑制剂与酶都能够结合，形成三元复合物。底物和抑制剂与酶都能够结合，形成三元复合物。EE E EEEE第89页v=Vmax (1+)IKi+SKmKmS第90页特点：酶能够同时与底物和抑制剂结合，二者结构不一样，没有竞争。与酶活性中心以外基团结合，(大部分与巯基结合)抑制剂浓度与其抑制程度成正比，但不能经过增加底物浓度使抑制程度减小动力学参数：Km不变 Vmax变小，双倒数直线相交于横轴第91页非竞争性抑制双倒数曲线非竞争性抑制双倒数曲线 第92页（3）反竞争性抑制）反竞争性抑制第93页v=Vmax (1+)IKi+SKmKmS(1+)IKi反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用第94页特点：酶必须与底物结合后才能与抑制剂结合与酶活性中心以外基团结合抑制程度与I及S均成正比，不能经过增加底物浓度使抑制程度减小.相反，底物浓度越大，抑制作用越强。动力学参数：Km、Vmax均变小，双倒数直线是一组平行线第95页反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用第96页第97页七七 过渡态类似物过渡态类似物潜在抑制剂潜在抑制剂 E+S=ES-P+E第六节第六节 主要酶类及其活性调整主要酶类及其活性调整一一 多酶体系（多酶体系（multible enzyme）功效上相关一个酶按照一定次序组合在一起形成组功效上相关一个酶按照一定次序组合在一起形成组合体。效率高，方便调整。合体。效率高，方便调整。第98页二、同工酶（二、同工酶（Isoenzyme）功效相同但分子结构不一样酶称谓同工酶。功效相同但分子结构不一样酶称谓同工酶。同同一一个个属属中中由由不不一一样样基基因因或或等等位位基基因因编编码码多多肽肽链链所所形形成成单单体体、纯纯聚聚体体和和杂杂交交体体，能能催催化化同同一一个个化化学学反反应应，但但其其酶酶蛋蛋白白本本身身分分子子结结构构、性性质质及至免疫学性质均不相同一组酶。及至免疫学性质均不相同一组酶。存存在在于于生生物物同同一一个个属属或或同同一一个个体体不不一一样样组组织织中中，甚至同一组织、同一细胞中。甚至同一组织、同一细胞中。第99页H HH HH HH HH HH HH H MMH HH HMMMMH HMMMMMMMMMMMMMMLDHLDH1 1 (H(H4 4)LDHLDH2 2(H(H3 3M)M)LDH LDH3 3(H(H2 2MM2 2)LDHLDH4 4(HM(HM3 3)LDHLDH5 5 (M(M4 4)乳酸脱氢酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶第100页 用于解释发育过程中阶段特有代谢特征；同工酶谱改变有利于对疾病诊疗；同工酶能够作为遗传标志，用于遗传分析研究。第101页三、抗体酶也叫催化性抗体（catalytic antibody），是一个含有催化功效抗体分子。第102页四、四、模拟酶模拟酶模拟酶是依据酶作用原理，利用有机化学合成方法，人模拟酶是依据酶作用原理，利用有机化学合成方法，人工合成含有底物结合部位和催化部位非蛋白质有机化合物。工合成含有底物结合部位和催化部位非蛋白质有机化合物。五五 固定化酶固定化酶第103页六 酶活性调整 能够经过改变其催化活性而使整个代谢反应速度或方向发生改变酶就称为限速酶或关键酶。第104页限速酶限速酶/关键酶关键酶(rate-limiting enzyme/key enzyme)1.1.催化非可逆反应催化非可逆反应特特点点2.2.催化效率低催化效率低3.3.受激素或代谢物调整受激素或代谢物调整4.4.常是在整条路径中催化初始反应酶常是在整条路径中催化初始反应酶5.5.活性改变可影响整个反应体系速度和方向活性改变可影响整个反应体系速度和方向第105页酶活性调整方式：酶活性调整方式：酶酶活性活性调整调整(快快)酶酶数量数量调整调整(慢慢)第106页一、酶活性调整（一）别构(变构变构)调整1.定义：酶分子非催化部位与一些化合物可逆地非共价结合后发生构象改变，进行改变酶活性状态，称为别构调整。别构酶：含有别构作用酶。别构剂：能使酶发生别构作用物质第107页2.分类：相同（均为底物）：同促效应（相同（均为底物）：同促效应（相同（均为底物）：同促效应（相同（均为底物）：同促效应（homotropic effecthomotropic effecthomotropic effecthomotropic effect）不一样（效应调整物）：异促效应不一样（效应调整物）：异促效应不一样（效应调整物）：异促效应不一样（效应调整物）：异促效应（heterotropic heterotropic heterotropic heterotropic effecteffecteffecteffect）依据配体结合依据配体结合依据配体结合依据配体结合后对后对后对后对后继后继后继后继配配配配体影响体影响体影响体影响依据依据依据依据配体配体配体配体性质性质性质性质正正正正协同协同协同协同效应效应效应效应（positive cooperative effectpositive cooperative effectpositive cooperative effectpositive cooperative effect）负负负负协同协同协同协同效应效应效应效应（negative cooperative effectnegative cooperative effectnegative cooperative effectnegative cooperative effect）第108页当变构酶一个亚基与其配体（底物或变构剂）结合后，能够经过改变相邻亚基构象而使其对配体亲和力发生改变，这种效应就称为变构酶协同效应。别构激活剂别构抑制剂第109页3 判断用饱和比值Rs（CI：协同指数）来表示：Rs81 1/nn:代表协同系数（Hill系数）正协同效应:n1 RS81负协同效应:n81位点被位点被90%90%饱和时底物浓度饱和时底物浓度位点被位点被10%10%饱和时底物浓度饱和时底物浓度第110页4.别构酶特点（1）普通是寡聚酶，由多亚基组成，包含催化部位和调整（别构）部位，即活性中心和别构中心（2）含有别构效应。指酶和一个配体（底物，调整物）结合后能够影响影响酶和另一个配体（底物）结合能力。（3）位于代谢关键分子点上（4）动力学：S形曲线第111页别构酶常为多个亚基组成寡聚体，具别构酶常为多个亚基组成寡聚体，具 有别构效应，动力学曲线为有别构效应，动力学曲线为形。形。变构激活变构激活变构激活变构激活变构抑制变构抑制变构抑制变构抑制 变构酶形曲线变构酶形曲线变构酶形曲线变构酶形曲线S S S S V V V V 无变构效应剂无变构效应剂无变构效应剂无变构效应剂 第112页 别构模型（1）协同模型（对称模型、齐变、WMC模型）1965年由年由Monod、Wyman和和Changeux提出。提出。S SSSS SSS SST状态（对称亚基）状态（对称亚基）R状态（对称亚基）状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基对称亚基对称亚基齐步改变齐步改变113第113页关键点：亚基组成数目确定，地位相同，对称每个亚基只有一个结合位点每种亚基有两种状态，无杂合状态变构后对称不变第114页 序变模型（KNF模型）1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer提出。提出。SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序改变依次序改变第115页关键点：配体与亚基结合后才诱导状态改变,配 体不在时只有一个构象状态构象改变序变序变进行，存在杂合态效应可正可负第116页举例：天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)第117页ATCase结构及其催结构及其催化链别构过分作用化链别构过分作用无催化活性构象无催化活性构象(T-型型)CCCCC C R R R R R R有催化活性构象有催化活性构象(R-型型)CC CCC CR R R R R RATP（正效应剂）（正效应剂）CTP（负效应剂）（负效应剂）第118页（二）共价调整（二）共价调整 在其它酶催化作用下，一些酶蛋白肽链上一些基团可与某种化学基团发生可逆可逆共共价价结合，结合，从而使酶在活性活性形式与非活性非活性形式之间相互转变，此过程称为共价修，此过程称为共价修饰。饰。第119页 常见类型常见类型常见类型常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化乙酰化和脱乙酰化乙酰化和脱乙酰化乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化甲基化和脱甲基化甲基化和脱甲基化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化腺苷化和脱腺苷化腺苷化和脱腺苷化腺苷化和脱腺苷化第120页第121页共价调整特点：放大效应酶处于活性及相对非活性状态第122页（三）酶原激活酶原从前体蛋白质变成活性酶过程称为酶原激活糜蛋白质酶胃蛋白酶胰蛋白酶凝血酶第123页二、酶数量调整（一）合成速度调整诱导酶：在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶底物或底物类似物第124页 结构酶：指正常细胞内存在酶，它含量较稳定，受外界原因影响很小。主要受基因和代谢双重调控（二）降解速度调控：第125页第七节酶活力及酶工程第七节酶活力及酶工程一一 酶活力和测定酶活力和测定1.1.定义：定义：用在一定条件下，酶催化某一反应用在一定条件下，酶催化某一反应反应速度反应速度表示。表示。反应速度快，活力就越高。反应速度快，活力就越高。表示方法：单位时间、单位体积中底物降低许或表示方法：单位时间、单位体积中底物降低许或产物产物增加量。增加量。第126页2.国际酶学会标准单位：(1)IU 在特定条件下，1分钟内能转化1mol底物所需酶量，称一个国际单位（IU）。特定条件：25 pH及底物浓度采取最适条件 (2)Kat (也称催量单位)1972年在最适条件下，每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需酶量要求为1 Kat单位Kat 和IU关系：1Kat=6x107IU第127页3.其它表示方法(1)酶比活力 (Specific activity)每毫克酶蛋白所含有酶活力。酶比活力是分析酶纯度是主要指标。单位：U/mg蛋白质。有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。第128页(2)(2)酶转换数酶转换数(TN)亚基或催化中心活性定义：每mol 活性亚基或 活性中心 在一秒内转化底物 mol 数，称为转换数TN也叫催化常数Kcat第129页二、酶活力测定方法：（一）终点法：测反应完成所需要时间（二）动力学方法1.比色法2.量气法3.滴定法4.分光法分光法5.放射法6.酶偶联分析法7.电化学法第130页三、酶纯度三、酶纯度：比活力比活力=活力单位数/毫克蛋白（氮）纯化倍数纯化倍数=每次比活力第一次比活力产率产率%（回收率）（回收率）=100每次总活力第一次总活力第131页四、酶分离纯化 酶分离普通标准酶分离普通标准（胞内、胞外；低温）（胞内、胞外；低温）详细过程选材破碎抽提分离纯化第132页方法1.依据溶解度不一样:（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法）；2.依据酶与杂蛋白分子大小差异：（凝胶过滤法、超离心法）；3.依据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质不一样（吸附分离法）；第133页4.依据带电性质（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法）；5.依据酶与杂蛋白稳定性差异（选择性变性法）；6.依据酶与底物、辅因子或抑制剂之间专一性亲和作用（亲和层析法）。第134页五、酶工程主要内容：研究酶生产、纯化、固定化技术、酶分子修饰和改造及工农业、医药卫生等领域应用分化学酶工程及生物酶工程第135页（一）化学酶工程天然酶化学修饰酶固定化酶第136页酶固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）物理（吸附法与包埋法）或化学化学方法（共价偶联法与交联法）方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一个不溶于水状态。吸附法吸附法：使酶被吸附于惰性固体表面，或吸附于离子交换剂上。包埋法包埋法：使酶包埋在凝胶格子中或聚合物半透膜小胶囊中。偶联法偶联法：使酶经过共价键连接于适当不溶于水载体上。交联法交联法：使酶分子依靠双功效基团试剂交联聚合成“网状”结构。第137页固定化酶固定化酶 将将水水溶溶性性酶酶用用物物理理或或化化学学方方法法处处理理，固固定定于于高高分分子子支支持持物物(或或载载体体)上上而而成成为为不不溶溶于于水水，但但仍仍有有酶酶活活性性一一个个酶酶制制剂剂形形式式，称固定化酶称固定化酶(immobilized enzyme)。包埋法包埋法 吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法第138页化学酶工程化学酶工程 亦称初级酶工程亦称初级酶工程 主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成化学修饰化学修饰 固定化处理固定化处理 化学合成法化学合成法 自然酶自然酶化学修饰酶化学修饰酶固定化酶固定化酶 化学人工酶化学人工酶 改进酶性质以及提升催化效率及降低成本改进酶性质以及提升催化效率及降低成本研究和应用研究和应用第139页固定化酶固定化酶-指被结合到特定支持物上并能发挥作用一指被结合到特定支持物上并能发挥作用一类酶。是化学酶工类酶。是化学酶工 程中含有强大生命力主干。程中含有强大生命力主干。四种方法四种方法 吸附吸附 交联交联 共价结合共价结合 包埋包埋优点：优点：（1）、能够用离心法或过滤法很轻易地将酶与反应液）、能够用离心法或过滤法很轻易地将酶与反应液 分离开来。在生产中十分分离开来。在生产中十分 方便有利方便有利（2）、能够重复使用）、能够重复使用,达上千次达上千次,节约成本节约成本（3）、稳定性能好）、稳定性能好人工酶人工酶-模拟酶生物催化功效，用化学半合成法或化模拟酶生物催化功效，用化学半合成法或化学全合成法合成酶称人工酶学全合成法合成酶称人工酶 第140页生物酶工程生物酶工程 在化学酶工程基础上发展起来，是以酶学和在化学酶工程基础上发展起来，是以酶学和DNA 重组技术为主当代分子生物学技术相结合产物。重组技术为主当代分子生物学技术相结合产物。亦称高级酶工程。亦称高级酶工程。三个方面：三个方面：（1）用）用DNA重组技术大量地生产酶（重组技术大量地生产酶（克隆酶克隆酶）（2）对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（）对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶突变酶）（3）设计新酶基因，合成自然界不曾有过能稳定）设计新酶基因，合成自然界不曾有过能稳定 催化效率更高新酶催化效