植物生物技术.doc

绪论
1. 植物生物技术的概述：指生物技术在植物上的应用，包括植物组织培养技术、人工种子、细胞工程、基因工程等多个生物技术，主要是指植物基因工程和与之相关的植物组织细胞培养技术、分子标记育种技术等。
2. 生物技术的产生和发展：现代生物技术是以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。发展迅速
3. 植物生物技术的展望：植物生物技术被普遍认为是未来人类解决资源短缺不可或缺的技术，也是争取农产品高附加值的重要技术手段。
4. What is Biotechnology什么是生物技术：应用该技术通过添加来自另一生物的基因来修饰生物的生物功能
第一章 组织培养实验室建设与操作技术
1. 标准的组织培养实验室包括： 洗涤室（准备室）、配置室、灭菌室、接种室、培养室、观察室等。
2. 组织培养所用到的器具：镊子类、剪刀类、组培瓶、各类器皿、量筒、移液管、试剂瓶、容量瓶、试管以及移液管架、酒精、玻璃棒、
3. 培养基的配制：无机营养成分、有机营养成分、碳源、激素、琼脂、水。 其中无机营养包括大量元素、微量元素。有机营养包括氨基酸和维生素。 碳源有蔗糖、葡萄糖、果糖，以蔗糖为主。 激素包括生长素和细胞激动素
4. 植物生长调节物质：生长素：吲哚乙酸、NAA、2,4-D；细胞分裂素：控制植物细胞分化（比例高时——产生芽,比例低时——产生根）、赤霉素、脱落酸
作用：促进细胞生长和细胞分裂；
• 诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；
• 形成愈伤组织，促进生根；
• 与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。
5. 根据培养物的培养过程，培养基分为：初代培养基：用来第一次接种外植体的培养基；继代培养基：用来接种继初代培养物的培养基。 根据其作用不同，培养基分为：诱导培养基；增殖培养基；生根培养基。
6. 基本培养基：主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。
7. 完全培养基：基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。

8. 培养基的配制：计量、移液、取琼脂蔗糖备用、融化、混合、调pH、分装、包扎、培养基的灭菌
9. 灭菌工作的重要性：预防感染杂菌的需要；消除生物污染的需要；防腐与保存的需要
10. 灭菌的方法：a、物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微米）紫外灯、超声波等。
b、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等 。
11. 干热灭菌：适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃ 、40min或120℃ 、120min，如果发现芽孢杆菌，160℃ 、90～120min。
12. 湿热灭菌：适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃ 维持20～30min。注意点：加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖
13. 过滤灭菌：培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌 。灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。
14. 射线灭菌：主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20～30min。
15. 火焰灼烧灭菌：用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。
16. 消毒剂
消 毒 剂
使用浓度(%)
消毒时间(min.)
效 果
残液去除难易
乙醇
70-75
0.1-3
好
易
氯化汞
0.1～1
2～15
最好
最难
过氧化氢
10～12
5～15
较好
最易
抗菌素
4～50mgl-1
30～60
较好
较难
次氯酸钙/纳
9 ～ 10
5～30
好
易

1. 无菌操作技术
17. 实验器具和材料的准备
用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。
关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）
18. 外植体和外质体的灭菌：
取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。
打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。
用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。
19. 无菌操作的注意事项
（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。
（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。
（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。
（5）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。

第二章 胚胎培养
1. 植物胚培养：是指在无菌条件下，对植物的胚及胚器官如子房、胚珠和胚乳进行离体培养的技术。
2. 植物胚培养的类型：成熟胚培养：成熟胚为子叶期以后的胚，其在简单的培养基上即可萌发生长
3. 成熟胚培养过程：
种子——95%酒精消毒——选取完好种子——70%酒精浸数S——0.1%升汞或10%次氯酸钠浸泡——无菌水冲洗——种子培养几天——剥离种胚——接种在培养基上（MS、White培养基）
4. 成熟胚培养条件下：
（1）因成熟胚本身含有较多的营养条件，对培养基要求不高
（2）只含有大量元素和糖的培养基上，便可萌发成苗
（3）多数植物成熟胚的生长以12h/天光照为宜。
5. 幼胚培养：（子叶形成之前）对发育早期的胚进行培养。培养技术和条件要求较高。需要通过培养基向其提供足够的营养物质。
6. 看护培养（nurse culture）：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。
7. 影响胚培养的因素
培养基：无机盐、碳水化合物、植物激素的作用、天然提取物及某些蛋白制品、氨基酸和维生素、活性炭和PH
环境条件：温度、光照、pH、培养基形态
胚龄：胚的发育程度与萌发成活率呈正相关，胚的剥离以受精35天左右为宜；心形胚和鱼雷胚较好
8. 胚珠培养：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。
9. 胚珠培养类型: 未受精胚珠的培养和受精胚珠的培养
10. 胚珠培养的基本过程：胚珠的获取；培养条件；受精胚珠的发育
11. 子房培养：将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。 根据培养的子房是否授粉分为：授粉子房培养；未授粉子房培养
12. 子房培养的过程：子房的获取；子房的培养
子房性细胞——愈伤组织或胚状体——单倍体植株
子房体细胞——愈伤组织或胚状体——二倍体植株

13. 胚珠和子房培养的应用
（1）受精胚珠培养目的：一是打破种子的休眠； 二是挽救胚的发育，以获得杂交种。
（2） 未受精胚珠培养目的：获得单倍体植株。
（1）授粉子房培养目的：挽救子房内杂种胚的发育
（2）未授粉子房培养目的：获得单倍体植株；试管受精解决杂交育种中不亲和问题。
14. 影响胚珠和子房培养的因素
a) 基因型
b) 发育时期：越早培养基越复杂
c) 附带组织：花的其它器官。
d) 附加成分：外源激素等
15. 胚乳培养：是指将从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。
16. 胚乳培养过程
胚乳外植体制备:种子消毒---取出胚乳
培养:White或MS诱导培养基---25-27℃--暗或弱光
发育:诱导形成愈伤组织----再分化形成胚状体或不定芽---生根培养----植株。
17. 胚乳培养的应用
获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植株具有营养体大，无籽等特点。如无籽西瓜。
胚乳培养也会产生较多的混倍体，影响育种利用。但可用于染色体工程研究。
ü 稳定型：三倍体
ü 畸变型：除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体
18. 植物离体授粉：将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。
19. 离体授粉的类型
（1）. 离体柱头授粉（授于离体雌蕊的位置）
（2）. 离体子房授粉
（3）. 离体胚珠授粉
第三章 植物愈伤组织的诱导与分化培养
1. 植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力
2. 植物组织培养：就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。

3. 愈伤组织：植物外植体脱分化、经过细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
4. 愈伤组织培养：是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。
5. 愈伤组织培养的调控因素：外植体、培养基和培养环境。
6. 从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期、分裂期和分化期。
7. 形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。
8. 愈伤组织的形态发生方式:不定芽方式和胚状体方式。
9. 愈伤组织的形态发生：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。
10. 胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。
11. 愈伤组织的培养条件：温度、光照、湿度、培养基组成、PH值、渗透压。
12. 试管苗移栽时注意事项
（1）. 试管苗驯化和炼苗：瓶内驯化；瓶外驯化—定值到育苗容器和苗床，经过一段时间的保湿和遮光处理。
（2）. 根处理：蘸生长素（50mg /L NAA）和生根粉处理。
（3）. 选无风阴湿天气移苗。
（4）. 基质湿度不宜太高，基质水分过多，通气不良影响生根。
13. 植物器官的培养的分类
14. 植物组织培养的应用
1) 如利用茎、叶和花器培养建立的试管苗，可在短期内提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；
2) 利用茎尖培养可得到脱毒试管苗，解决品种的退化问题，提高产量和质量；
3) 将植物器官作诱变处理，用器官培养可得到突变株，进行细胞突变育种

第四章 茎尖培养和离体快繁
1. 类型及意义：类型：
1) 微茎尖(茎尖分生组织)培养： 指带有1～2个叶原基的生长锥，其长度不超过0.5mm。 目的是获得无病毒植株
2) 普通茎尖培养：指对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。 目的是快速繁殖。 技术简单,操作方便,易成活和分化,成苗时间短。
意义：无性系快速繁殖；培养无病毒苗，品种改良；理论基础研究。
2. 茎尖培养方法
1) 制备外植体：取1-2cm的枝条顶梢，去小叶---消毒---解剖镜下用解剖刀除去幼叶和叶原基，露出生长点，切下0.1-0.2mm长的茎尖(含1-2个叶原基)
2) 组织分离：用消毒的镊子将材料转到解剖镜下，一手用镊子将其按住，一手用灭菌后的解剖针将叶片叶原基去掉，露出生长点，切下顶端0.1-0.2mm长的茎尖来培养；若为快速繁殖，也可取0.5-1cm长的茎尖．
3) 培养基：一般为MS培养方法：
固体培养法：试管培养
纸桥培养法：含义：用酒杯状的滤纸代替琼脂，使杯底朝上塞入试管中，与液体培养基接触，将离体茎尖置于滤纸上方进行培养。
优点：培养基是液体培养基，营养物质能通过滤纸均衡而持久地供给外植体，有利于外植体的健康成长 ；缺点：操作工艺复杂 。
3. 组织分离：用消毒的镊子将材料转到解剖镜下，一手用镊子将其按住，一手用灭菌后的解剖针将叶片叶原基去掉，露出生长点，切下顶端0.1-0.2mm长的茎尖来培养；若为快速繁殖，也可取0.5-1cm长的茎尖．
4. 快速繁殖(微繁殖):用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。
5.快速繁殖特点：

（1）. 繁殖速度快；
（2）. 使用材料少，生产效率高，省时省工；
（3）. 节约空间有利于植物的工厂化生产；
（4）. 在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。

5. 茎尖微繁技术的过程

1) 无菌培养体系的建立、
2) 芽的增殖
3) 中间繁殖体的增殖
4) 诱导生根

5) 试管苗的移植

第五章 单倍体细胞培养
1. 单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。
2. 花粉和花药的培养(pollen and anther culture)：是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。
3. 花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。
4. 花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程
5. 离体培养小孢子发育的影响因素：

a) 植株基因型：裸子植物难，被子植物简单
b) 大白菜：早熟简单，晚熟难；
c) 培养基成分：MS.其次B5.N6培养基。
d) 植物生长条件和生理状态：幼年、开花初期。
e) 小孢子发育状态：单核期（多）。
f) 预处理：低温处理。
g) 培养条件：一般温度25℃，光照无或正常光照等。对不同物种，没有固定的模式。

6. 获得花粉的方法

A、机械挤压梯度离心法
花药消毒
用镊子或小玻璃杵子将花粉从花药中挤压出
用30%蔗糖离心收集悬浮上层的完整花粉粒
用培养基洗涤几次

B、自然散粉法
消毒后的花药接种在液体培养基中
一定温度下振荡培养
花粉自行散落到培养基中
除去花药壁
花粉重新培养在新鲜培养液中

7.花粉植株形态发生方式
胚胎发生途径：小孢子发育与合子发育相似，经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚等阶段，但没有胚柄。
愈伤组织发生途径：产生愈伤组织，分化出胚状体或不定芽。
7. 单倍体植株的鉴定
1、染色体直接计数法：细胞学鉴定，通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。

2、间接鉴定
植株形态学鉴定法：单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。
细胞形态学鉴定 ： 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。
扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）：主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1 cm2。
8. 水稻花药培养过程
旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍——剥去旗叶鞘，取出稻穗——10％漂白粉10 min——无菌水洗3次——左手持穗，右手用镊子取花药，放无菌培养皿中——用接种环接种到培养基上——培养5天，花药变褐，20天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长根，形成幼苗。
9. 花药和花粉培养的应用
1) 诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；
2) 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率;
3) 有利于隐性基因控制性状的选择
4) 遗传转化的受体材料
5) 克服远缘杂交后代不育。
第六章 原生质体培养和融合
1. 原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。
2.原生质体的酶分离法 ：收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有效。
（1）酶的种类及特点：分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂，以其所含的主要酶的作用分为： a、纤维素酶类； b、半纤维素酶类；c、果胶酶类 ；d、崩溃酶； e、蜗牛酶
（2）酶液的配制：酶的配比和浓度（见课本）、渗透压和稳定剂及PH。
2. 原生质体的纯化
1) 沉降法（过滤离心法）：低速离心使原生质体沉于底部。
2) 漂浮法：根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不同，分离出原生质体。
3) 不连续梯度离心法：在离心管中首先放入不同浓度的Ficoll溶液，构成不同梯度，在上部滴入1-2ml酶—原生质体混合液，在150g离心5min，不同比重的原生质体漂浮在不同的浓度梯度的界面上，用吸管吸出原生质体，悬浮洗涤备用。
3. 影响原生质体数量和活力的因素

1) 供试材料
2) 酶的种类，组合和酶解时间
3) 渗透压稳定剂：糖醇或可溶性糖、无机盐类组成的有机溶液
4) 质膜稳定剂
4. 影响原生质体培养的因素

原生质体活力
原生质体起始密度
渗透压稳定剂
培养基成分
培养条件
植物材料和基因型

5. 原生质体融合：也称体细胞杂交，就是分离下来的不同亲本杂交的原生质体，在人工控制下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。
第七章 体细胞无性系变异
1. 体细胞无性系变异：外植体—脱分化– 再分化过程—产生的再生植株中表现出的变异。
2. 体细胞无性系变异的筛选与检测
筛选原理建立在有区别地杀死正常型细胞的基础上：
1) 正筛选：杀死正常细胞
2) 负筛选：先使正常细胞生长，抑制突变细胞。而后用药物杀死分裂细胞。（亚硝酸盐和核苷酸类似物）
3) “绿岛”法：用某种化学物质作用于植株叶片，使细胞发生突变，叶片局部呈现绿色斑点，切下这部分进行组织培养，通过培养细胞的再分化，使抗性细胞分化成完整植株。
4) 抗病细胞突变体：在离体条件下直接以毒素为选择压力筛选抗病细胞突变体，再进一步生出抗病植株
检测：形态学鉴定； 生物化学鉴定：蛋白质水平；
细胞学鉴定：核型，染色体结构和数目； 分子水平鉴定：RFLP，RAPD，SSR等
3. 影响体细胞无性系变异的因素和应用
因素：基因型、外植体来源、再生途径、培养基成分、温度 、促进染色体变异、组织原有的倍数性
应用：
a) 农艺性状改良方面：株高突变体的筛选与应用、生育期形状的改良、产量性状的改良、育性性状突变体、优良恢复系突变体
b) 品质改良方面：蛋白质含量变异体、储藏蛋白变异体、氨基酸含量变异体

c) 抗性改良方面：抗病突变体的筛选、抗除草剂突变体、耐盐突变体、抗旱突变体、抗寒突变体、抗金属离子胁迫突变体

第八章 分子生物学基本实验技术和部分已知序列基因克隆
1. 分子生物学实验室设备：
2. 电泳：是带电荷的胶体颗粒在电场中的移动
3. 电泳的三要素：净电荷、电场、支持介质
4. 凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）
5. 电泳分离生物大分子的原理：由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，它们泳动的方向和速度也不同。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离和鉴定的目的。
6. 迁移率：是指带电颗粒在单位电场下泳动的速度。
7. 影响迁移率的内、外在因素
内因：静电荷的多少；大小和形状
外因：电场强度 、溶液的pH值 、溶液的离子强度 、温度的影响 、支持物的影响 、电渗
8. 质粒DNA的构象

9. 琼脂糖凝胶电泳和电泳缓冲液
琼脂糖（agarose）是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。

10. 溴化乙锭：一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA
11. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis）：以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。
12. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理：分子筛效应和电荷效应
13. 破碎细胞的方法

a) 高速组织捣碎机捣碎
b) 玻璃匀浆器匀浆
c) 超声波处理法
d) 液氮研磨法
e) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）
f) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）

14. 核酸浓度的测定
测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0
1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。
2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；
3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等
测RNA：纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。
1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；
2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。
15. 核酸的保存
(1) 对DNA：① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存；
② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2) 对RNA ：① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存;
② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;
③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
16. DNA片段的回收：方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。 
17. Polymerase chain reaction –PCR：聚合酶链反应-PCR：使用变性，退火至引物和DNA聚合酶指导的DNA合成的循环扩增DNA区段的方法
18. 引物设计：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）

19. 核酸探针的标记与分子杂交：切口平移法、随机引物标记法、末端标记法
20. 分子克隆的基本技术路线
a) 分离制备目的基因或DNA片段；
b) 目的DNA与载体在体外进行连接；
c) 重组DNA分子转入宿主细胞；
d) 筛选及鉴定阳性重组体；
e) 重组体的扩增。
21. What is Gene cloning? 什么是基因克隆？
就是制作它的许多副本
基因可以是天然基因的精确拷贝
 基因可以是天然基因的改变版本
22. Why Clone DNA? 为什么要克隆DNA？
（1）. 可以分离特定基因并确定其核苷酸序列
（2）. 可以鉴定和分析DNA的控制序列
（3）. 可以研究蛋白质/酶/ RNA功能
（4）. 可以鉴定突变，例如 与特定疾病相关的基因缺陷
（5）. 生物体可以“设计”用于特定目的，例如 胰岛素产生，抗虫性等
23. Why is DNA Cloning Important? 为什么DNA克隆很重要？
DNA克隆用于寻找基因，绘制基因并在物种之间转移它们
克隆技术用于寻找遗传疾病的携带者，进行基因治疗，并创造抗病植物
24. How is DNA cloned? （Cell-based DNA cloning；Cell-free DNA cloning (PCR)）如何克隆DNA？
基于细胞的DNA克隆;无细胞DNA克隆（PCR）
25. Recombinant DNA technology重组DNA技术：DNA片段与自我复制载体连接以产生在宿主细胞中复制的重组DNA分子的技术
26. What’s Needed to Clone DNA? 克隆DNA需要什么？
1) 一种在特定位点切割DNA的方法
2) 用于克隆DNA的载体分子
3) 可以复制（克隆）DNA的地方
27. Restriction enzymes限制酶：在特定位点切割DNA的细菌酶

28. Plasmids质粒：天然存在的染色体外DNA。质粒是环状dsDNA；质粒可以通过限制酶切割，留下粘性末端；可以通过将新的DNA片段连接到质粒的粘性末端来构建人工质粒
29. Plasmids useful as cloning vectors must have：？用作克隆载体的质粒必须具有
复制者（复制起点）
选择标记（抗生素抗性基因）
克隆位点（插入外源DNA不会破坏复制或使必需标记失活的位点）
30. Steps in the Process of Cloning？克隆过程中的步骤？
a) 用限制酶切割DNA，产生的片段以特定序列结束
b) 片段与由相同酶切割的载体分子混合，DNA连接酶与重组DNA分子结合
c) 将具有插入的DNA片段的质粒载体转移到细菌细胞中，重组质粒复制并产生重组DNA分子的许多克隆
31. DNA can be inserted into a E.coli cell：热激转化法；电激转化法
32. 基因已知序列和部分已知序列克隆基因：PCR法、文库筛选法
33. 载体准备：载体DNA——酶切，纯化——去磷酸化——连接
34. 文库筛选法：通过使用探针筛选文库，可以从文库中回收特定基因的克隆
35. 阳性克隆的筛选

a) 抗性筛选
b) 杂交筛选
c) 蓝白斑筛选
d) PCR筛选
e) 酶切筛选
f) 非重组质粒致死筛选

36. Cloned Libraries克隆图书馆：来自一个来源的克隆DNA序列的集合是文库
37. Genomic library construction基因组文库构建：
38. Finding a Specific Clone in a Library在图书馆中找到特定克隆：通过使用探针筛选文库，可以从文库中回收特定基因的克隆
39. Southern blot：Southern印迹：一种将DNA片段从凝胶转移到膜过滤器的方法
40. DNA sequencing DNA测序：一种确定DNA片段核苷酸序列的技术，基因组项目中使用的基本方法
41. 质粒：广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有
载体：指能传递能量或运载其他物质的物体。
42. 如何从一个巨大的基因组DNA中捉到目的基因DNA片段？

43. Gene cloning with PCR：可以通过PCR克隆技术在体外将不同来源的的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其他载体，构建重组DNA分子，再导入到受体细胞中进行扩增和繁殖，经过筛选，把含有目的基因的转化子细胞再扩增提取获得大量DNA。
44. 重组质粒的筛选：插入片段长度鉴定、插入片段方向性鉴定、DNA测序测定
45. 基因文库：一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。
46. 探针：核酸探针,是一段带有检测标记,且顺序已知的,与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。
第九章 植物遗传转化
1. 农杆菌质粒载体系统和转化
诱导信号 信号传递 诱导表达
植物伤口——酚类物质诱导信号——信号受体（VIR A）——VIR G——激活激活virB、virC、virD、
VIR D核酸内切酶 VIR D2 、 VIR D4 、VIR B、 VIR E2等
virE 、virH表达——T-DNA单链分子释放——转移到寄主细胞——整合到植物染色体中
2. 植物遗传转化方法
3. 植物遗传转化载体的种类及特点。

4. 天然Ti质粒不能直接用作克隆和转化外源基因的载体的原因？
① T-DNA区内存在不利于植物遗传转化的基因
② Ti质粒分子量过大，一般160～240kb，有的甚至达800kb，在基因工程中难以操作。
③大型Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不易通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因。
④ Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。
⑤ Ti质粒在大肠杆菌中不能复制。
5. 载体Ti质粒应具备的结构
① 选择标记基因。如新霉素磷酸转移酶基因，它能使转化的植物细胞获得对卡那霉素的抗性。
② DNA复制起始位点。它使Ti质粒能在大肠杆菌中复制（用于克隆），而植物转化载体还同时带有可在土壤根癌农杆菌中进行复制的复制起始位点（用于转化）。
③ T-DNA右边缘序列。它对于T-DNA的整合必不可少。目前使用的大多数克隆载体都含有两端的边缘序列。
④ 多克隆位点。为能方便克隆基因，人们在载体的左右T-DNA边缘序列之间设计了一段DNA序列，包含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点。
6. 叶盘转化法转移基因的一般程序

1) 用打孔器取直径为2mm的叶盘
2) 叶盘与根瘤土壤杆菌共培养
3) 培养在饲养平皿滤纸上的叶盘
4) 转移到含卡那霉素的长芽培养基中生长
5) 转移到生根培养基中生长
6) 移栽再生植株

7. 根癌农杆菌Ti质粒介导转化的基本程序

8. 直接转化法：PEG转化法、基因枪转化法、电击穿孔转化法、显微注射转化法、其它转化方法。
9. 利用种质系统转化：借助植物自身的生殖系统以及细胞结构来实现转化的目的。如：花粉管通道法、生殖细胞浸泡法和子房注射法等。
10. 花粉管通道法：利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，进一步整合到基因组细胞的过程。
11. 主要植物细胞转化方法的比较

12.常用报告基因有哪些：β-葡萄糖酸酶基因（gus）、绿色荧光蛋白基因（gfp）
12. 植物遗传转化过程

挑单克隆——摇床培养——测OD600——收集细胞——用液体LB培养基重悬细胞——将预培养的外植体放入菌液中共培养——离心机100rpm，30min——取出外植体在无菌滤纸中吸干菌液——共培养——在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成芽——诱导生根
13. 转基因植株的检测：Sourthern杂交、PCR法、抗性检测
14. Gateway vector：Gateway表达载体
第十章 分子标记、遗传图谱、图位克隆和辅助育种
1. 分子标记：标记是与生物体的某种特性相关的DNA分子
2. 遗传图谱：某一物种的染色体图谱（也就是我们所知的连锁图谱），显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置，而不是在每条染色体上特殊的物理位置
3. 图位克隆 （Positional cloning (Map based cloning)）：该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。
4. 分子标记辅助育种：利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的
5. Marker is a piece of DNA molecule that is associated with a certain trait of a organism标记是一种DNA分子，与生物体的某种特性有关
6. Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 随机扩增多态性DNA（RAPD）
基于PCR的标记物，具有10-12个碱基对，随机扩增几个片段，扩增的片段在EtBr检测的琼脂糖凝胶中运行，不稳定的扩增导致重复性差
7. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 限制性片段长度多态性（RFLP）
用限制酶消化的基因组DNA，通过电泳分离DNA片段并转移到尼龙膜上，通过Southern杂交将膜暴露于用P32标记的探针，胶片暴露在X射线下
8. Amplified Fragment Length polymorphism (AFLP) 扩增片段长度多态性（AFLP）
限制性核酸内切酶消化DNA，适配器的连接，扩增结扎片段，通过电泳和可视化分离扩增的片段
AFLP具有稳定的扩增和良好的重复性
9. SSR: Simple Sequence Repeat or Microsatellite SSR：简单序列重复或微卫星
基于PCR的标记，具有18-25个碱基对引物
SSR多态性基于否。 重复单位和超变量
SSR具有稳定的扩增和良好的重复性
SSR易于运行和自动化

10. SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) SNP（单核苷酸多态性）：指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的80%以上
11. Application of Molecular Markers.分子标记的应用

1) 品种鉴定
2) 具体标志物 - 诊断
3) 了解关系
4) 分析多样性
5) 构建遗传连锁图谱并标记经济上重要的基因
6) 标记辅助选择例如 基因渗入，QTL分析

12. Bulk segregation analysis--混合分组分析法：用于QTL或基因定位的一类分析方法。
13. Bulk Segregant Analysis – How to set-up an experiment批量分离分析 - 如何设置实验
1) 从单个杂交中创建分离种群（例如，F1或BC后代）
2) 表现后代并鉴定具有极端特征表型的个体
3) 构建显示最极端特征表型的个体的DNA大量
4) 使用数百到数千个DNA标记对父母和大块进行基因型分析
5) 确定那些区分批量和父母的标记
14. Physical map物理地图：基于物理距离; Mb（Mega base）特定克隆DNA序列的物理位置
15. Construction of BAC library BAC图书馆的建设
a) 细菌人工染色体（~1992，Melvin simon）
b) 基于F质粒的大肠杆菌克隆载体
-pBeloBAC11，pIndigo536
c) 用于详细分析复杂基因组的强大工具
d) 用于基因组分析，包括基因克隆