拉曼与红外光谱在结构生物学中的应用.doc

现代仪器分析技术在结构生物学中的应用 摘要：结构生物学是以生物大分子结构及其运动的测定为基础来阐明生命现象的科学。序列空间结构功能是Petsko提出的结构生物学中心法则。也就是说生物大分子三维结构测定是结构生物学的核心,其主要层次是三维结构。而对任何生物大分子发挥生物功能认识上的突破必然是建立在对其三维结构阐明的基础上。目前对大分子结构的解析的手段主要都是建立在红外光谱、紫外光谱、拉曼光谱、X-射线衍射以及核磁共振的基础上发展起来的。这里主要介绍红外光谱、拉曼光谱、X-射线衍射以及核磁共振在结构生物学中的运用。关键词：结构生物学；红外光谱；紫外光谱；拉曼光谱；X-射线衍射；核磁共振Abstract Structural biology is a branch of science that is based on the measurement of structure of biomacromolecule and its action.Sequence,spacial structure and function is central principle of structural biology proposed by Petsko.Namely，the measurements of three-dimensional structure of biomacromolecule is the core problems of structural biology,the important part is three dimensional structure.There is on exception that any cogniton of biomacromolecule must be on the foundation of illuminating three-dimensional structure.Currently,the based methods of measurement is infrared spectroscopy, ultraviolet spectrum,Raman spectrum,X-ray diffraction and nuclear magnetic resonance .Hence,infrared spectroscopy, ultraviolet spectrum,Raman spectrum,X-ray diffraction and nuclear magnetic resonance will be covered in this article.Key words：structural biology；infrared spectroscopy；ultraviolet spectrum；Raman spectrum；X-ray diffraction；nuclear magnetic resonance1 引言1.1 结构生物学结构生物学一直是分子生物学的重要组成部分，由于近年来的飞速发展 ，它已成为分子生物学的前沿和主流，并且从当前的发展趋势来看必将成为整个生命科学前沿和带头学科之一。在人类完成人类基因组工作草图绘制后，生命科学进入后基因时代，结构生物学将处在具有战略性的关键地位，在人类基因组测定之后，将进一步集中研究蛋白质的结构与功能 ,特别是蛋白质的三维结构，这是揭示基因组功能的基本途径。结构生物学自诞生之日起, 就以最直观、最可靠的特点成为人们研究和揭示生命活动微观分子机理的强大武器。经过近四五十年的发展，结构生物学融合了X光衍射、NMR、电子显微镜、原子力显微镜、分子光谱等一大批生物物理和生物化学的技术手段，实现了从早期的单一分子结构测定向研究大分子复合物功能与结构关系的跨越，进一步的系统生物学、细胞生物学和结构生物学等分支学科间的交叉融合，细胞成像等技术的渗透, 使得结构生物学家们开始思考和解决新的问题。单分子化学和三维重构结构生物学研究的重点在于对生物大分子的研究 ，那么结构生物学研究方法的进展尤其是生物大分子研究方法的研究就显得犹为重要。1.2 现代仪器分析技术 现代仪器分析的方法很多，按照测量过程中所观测的性质进行分类，可分为光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、质谱分析法、热分析法、放射化学分析法和电镜分析法等；而现代仪器分析所采用的分析仪器是化学、光学、电学、磁 学、机械及计算机科学等现代科学综合发展的产物。而它在生命科学的运用已不可或缺，自上世纪70年代以来, 世界各发达国家都将生命科学及其有关的生物工程列为科学研究中最优先发展的领域，在欧、美、日等地区和国家具有战略意义的宏大研究规划“尤利卡计划”，“人类基因图”及“人体研究新前沿”中, 生物大分子的结构分析研究都占据重要的位置。当前采用以色谱、质谱、核磁共振、荧光、磷光、化学发光和免疫分析以及化学传感器、生物传感器、化学修饰电极和生物电分析化学等为主体的各种分析手段, 不但在生命体和有机组织的整体水平上, 而且在分子和细胞水平上来认识和研究生命过程中某些大分子及生物活性物质的化学和生物本质方面, 已日益显示出十分重要的作用。1.3 结构生物学研究的方法结构生物学的主要方法和技术基础全部来自现代物理、化学和数学的最新发展，尤其是物理学新的方法和技术。因此很多结构生物学家之前都是物理学家， 在这之中薛定谔的思想在生物学界具有巨大的影响力，影响了几代生物学家，其中DNA 结构的发现者沃森和克里克就是一个典型的例子。总得来说，结构生物学的主要研究方法有红外光谱、拉曼光谱、X-射线衍射以及核磁共振，当然也有电子显微学方法，但在此处不做介绍。2 红外光谱的结构生物学中的应用 红外光谱在结构生物学中的应用主要是傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）的运用，FTIR具有扫描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比、测定光谱范围宽的特点，并配备有功能很强的计算机系统，因而已经广泛应用于蛋白质、核酸等生物大分子的结构研究。此外，傅里叶变换红外光谱仪能在分子水平上直接了解所研究分子或体系的结构，得到基因生物功能信息；更重要的是红外光谱样品三态均可，用量少，不破坏样品结构，所以它即可以研究样品的表面结构，又可以研究样品的整体结构。因而，傅立叶变换红外光谱仪的发展实现了由化学领域发展到分子生物学和临床医学研究领域 , 从离体分析发展到在体无损分析1。此外，红外光谱学已从二维红外光谱学发展为三维红外光谱学，即二维红外光谱和时间分辨光谱。我们都知道生物大分子在行使其功能时不是处于静止的状态，而是在不断运动之中，所以仅知道其结构无法阐释这些生物大分子的功能。时间分辨光谱学 ， 又称频闪光谱学 ，它是将光谱仪器的快速多重扫描功能和计算机快速采集、处理数据的功能相结合，从而运用在与时间有关的领域2。时间分辨光谱主要研究物理或化学变化的中间过渡过程 , 即随时间的瞬变过程。 我们都知道，在人类完成人类基因图谱之后，生物学进入了后基因组时代，人们不在研究单一的基因而是要解释这些基因的功能，而基因的功能在很大程度上是有蛋白质分子体现出来的，虽然有很多的基因是以RNA的形式发挥其功能的，但最终都是在生物大分子上体现基因的功能。基因的功能都是以大分子之间相互作用的方式体现出来，要解释这些相互作用的方式，这些生物大分子的结构解析以及在时间上的结构变化显得尤为重要。这里主要介绍红外光谱在蛋白质中的运用。蛋白质的二级结构以及二级结构的一些功能一直是生化学家和结构生物学家研究的热点。由于二维红外光谱学在具有很好的分辨率，因而它在蛋白质的二级结构研究上具有巨大的优势。二维红外光谱对蛋白二级结构研究的主要内容是利用二维相关谱 ，对它们的二级结构进行解析 ，以及它们的二级结构在温度、压力等外界因素变化时发生的改变。但是在研究蛋白的二级结构时，尤其是酰胺 I带，酰胺II带以及酰胺 I 带时会面临谱峰严重重叠的问题，传统的红外光谱法只能采用分峰等数学方法加以解决，不过如果采用二维相关谱这些问题将会得到解决。此外，在研究的过程中，蛋白质每一种构象中的氨基官能团上的质子，与氘交换的速度是不一样的，所以为了激发样品比较好的一种方法是采用氢-氘交换3。3 拉曼光谱在结构生物学中的应用1928年印度物理学家拉曼和克利希南在研究单色光在液体中散射时，不仅观察到与入射光频率相同的瑞利散射，而且还发现两侧有强度很弱，且与入射光频率不同的散射光谱，这便是拉曼光谱。拉曼光谱和吸收光谱不同，拉曼光谱研究被样品散射的光，而不是吸收或发射的光。在结构生物学的研究中，人们通常采用X射线晶体学方法测定大分子的结构，然而这将会面临一系列的问题，因为X射线晶体学研究的对象是晶体，但很多生物大分子很难结晶，甚至无法得到晶体。此外，在生物大分子的结构中往往从一个区域到另一个区域常存在结构变化，这对常规的X射线晶体学方法是很棘手的，然而，如果利用拉曼光谱对其研究就不会存在这些问题4。大分子的正常结构是维持生命体正常功能的前题。而拉曼效应可以包含原子的位置、电子的分布以及分子间的相互作用，它是研究分子结构与功能最有效的方法之一。此外，激光共振拉曼光谱的灵敏度、所需样品的量少，而且可以得到大量的结构信息；它可对大分子的不同色团选择性共振激发，而且相互间不会受到影响。生物大分子的振动频率非常复杂，振动频率与分子中固定的分子群体中的几何分布和键的配置有关，而且它们能反应分子间的相互作用，分子的这些特性便可影响分子的拉曼光谱5。一般而言，超纯的核酸或蛋白质有30-40条拉曼光谱线出现在300-1700波数范围内，因而它可获得核酸的有序结构、碱基堆积以及蛋白质的主链构象：-螺旋、-折叠、回折结构、无规则卷曲、侧链残基的构型和所处环境等信息6。4 X-射线衍射在结构生物学中的应用 直到现在，单晶X射线衍射法是测定包括蛋白质在内的生物大分子结构的最常用、最基本的方法之一。它的特点是所研究的对象是晶体，所以在一定程度上存在局限性，尤其是对生物膜蛋白结构的解析，很多膜蛋白极难得到可运用于单晶X射线衍射的晶体，到目前为止，也只有数个膜蛋白得到中等程度分辨率的结构。但是，同步辐射光源的运用，极大地体现出它的意义；同时因为同步辐射光源亮度和准直性高，而且光谱分布宽，这极大地促进了结构生物学的发展。汉堡的DESY同步辐射实验室Rosenbaum于1971年最早运用同步辐射光源对肌肉进行X射线衍射研究7。于此同时，不少科学家利用同步辐射对蛋白质晶进行研究，并在斯坦福的SPEAR上进行了早起的尝试8,9。预计在以后的时间里，在结构生物学领域，单晶X射线衍射法依旧是蛋白质结构测定的主要方法之一。5 核磁共振在结构生物学中的应用核磁共振（NMR）是指核磁矩不为零的原子核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收特定频率的射频辐射的物理过程。与其它光谱学方法相比，核磁共振的优点是可以探测到每一个原子的共振频率。核磁共振波谱技术在结构生物学中的应用很广，可以用来研究生物高分子及其复合物在溶液中的三维结构和功能；研究动态的生物大分子之间以及与配基的相互作用；研究生物大分子的动态行为；除此之外还可用固体核磁共振或液体核磁共振技术研究膜蛋白的结构与功能10。它最大的优点是分辨率高，同时可以获得大量的分子结构信息，最重要的是它可以获得生物大分子在时间上的动态信息。但它也有自己的缺点，随着所研究的生物分子量的增大，其共振峰数目增多，分子运动相关时间变长，横向弛豫时间变短，因为线宽与横向弛豫时间的倒数成正比，所以随着分子量的增加，其谱峰增宽，这给谱峰认证带来很大的困难。但是核磁共振波谱技术在结构生学中依旧占据着很高的位置，其优势不可替代。6 结论与展望自人类完成人类基因组计划之后，生命科学步入了后基因组时代，即解析基因的功能。然而基因的功能表现为大分子的行为，而大分子的行为与其结构有着密不可分的关系，因此可以说大分子的行为是其结构在空间上的变化。要解析这些分子结构和行为，就表现为对仪器和技术的运用，而现代仪器分析技术为此提供了良好的分析平台。但现代的科学不再是单一的分析科学，而是综合解析的科学，所以对结构生物学的研究不仅需要单一技术的突破，还需要多种分析技术的联合运用，所以可以说结构生物学是生物分子结构与现代仪器分析技术的产物。参考文献1 吴瑾光 . 近代傅立叶变换红外光谱技术及应用( 上册) M .北京 : 科学出版社 , 199 4 , 1 2 : 17 1 -1772 王 琪,胡鑫尧.三维光谱学-二维红外光谱和时间分辨光谱(J).光谱学 与光谱分析,2000,20(2)：175-1793 Anne Nabet et al . 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