菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定.doc

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定
15食安（1）班 张凯
摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。
关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性；
前 言
菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。[2]
本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。
1 实验材料与仪器
1．1实验材料与试剂
新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)]，10％三氯乙酸(TCA)。
1．2 实验仪器
722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；
TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；
D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；
DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；
可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；
AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；
BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；
DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；
HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
2 实验方法
2.1菠萝蛋白酶的粗酶提取
称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2.2盐析
-，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm离心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
2.3透析
将溶解液装入2.5 cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于 500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42- 未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2.4酶活力测定方法
取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下 ，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。
实验步骤按照表格中完成。
表1 酶活测定步骤
试剂(ml)
对照组
平行样品1
平行样品2
平行样品3
TCA
3
—
—
—
酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
激活剂
0.9
0.9
0.9
0.9
酪蛋白
1
1
1
1
37°C准确反应10min
TCA
—
3
3
3
A280nm OD值
粗提
—
0.791
0.818
0.868
盐析
—
0.823
0.907
0.986
透析
—
0.894
0.875
0.848
2.5蛋白质含量测定方法
将酶液稀释至一定程度，采用考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量（参照附录1）。
3实验结果与分析
3.1 蛋白质含量计算
3.1.1标准曲线的绘制
表X 0-1000ug/ml标准曲线的绘制
管号
1
2
3
4
5
6
1000μg/mL牛血清白蛋白
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白质浓度（μg/mL）
0
200
40
600
800
1000
吸光值（A595）
0
0.157
0.245
0.391
0.535
0.656
得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000μg/mL标准曲线。

图1 蛋白吸光值标准曲线
3.1.2样品的测定
准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。
3.1.3结果计算
由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×定容体积(mL)
样品蛋白含量(μg／g鲜重)＝──────────────────────────────────────
样品重量(g)
样品蛋白质含量（粗提纯）=（517.7×62）/20.00=1604.9（µg/g）
样品蛋白质含量（盐析）=（706×16）/20.00=564.8（µg/g）
样品蛋白质含量（透析）=（1017.7×13）/20.00=661.5（µg/g）
3.2酶活力计算
最后酶活结果取3次重复实验的平均值。
A280nm

0.001×0.1
×0.1
酶液活力（U/mL）= ×稀释倍数

步骤
空白
平行1
平行2
平行3
平均值
A280nm OD值
粗提
—
0.791
0.818
0.868
0.826
盐析
—
0.823
0.907
0.986
0.905
透析
—
0.894
0.875
0.848
0.872
粗酶液活力（U/mL）= =8257 U/mL
盐析酶液活力（U/mL）= =9053 U/mL
透析酶液活力（U/mL）= =8723 U/mL
3.3酶比活的计算
酶比活（U/mg· 蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量
粗酶比活（U/mg• 蛋白）= =5141.8（U/mg• 蛋白）
盐析酶比活（U/mg• 蛋白）= = 16029.3（U/mg• 蛋白）
透析酶比活（U/mg• 蛋白）= =13183.2（U/mg• 蛋白）
3.4酶纯化过程中回收率计算
回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100
= 〔（纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100
盐析回收率（%）=（9053×16.0）/（8256×62.0）=28.30%
透析回收率（%）=（8723×13.0）/（8256×62.0）=22.15%
3.5酶纯化倍数的计算
纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力
盐析纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力=16029.3/5141.8 =3.12
透析纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力=13183.2/5141.8 =2.56
3.6分析及讨论
将测定的数据整理计算分别填入下表，并菠萝蛋白酶的分离纯化效果进行分析和讨论。
表X 菠萝蛋白酶分离纯化表
步骤
总体积（mL）
总蛋白质含量（mg）
总活力（U/mL）
比活力（U/mg蛋白）
回收率（%）
纯化倍数
粗提
62
32.12
8256.67
5141.78
-
-
盐析
16
11.30
9053.33
16029.27
28.30
3.12
透析
13
13.23
8723.33
13183.21
22.15
2.56

图x 菠萝蛋白酶活对比图
4 实验结论与讨论
本次实验菠萝蛋白酶经过了粗提纯、盐析及透析三个步骤的分离纯化，结果得到粗提纯的蛋白质浓度最高，透析后蛋白质浓度最高，盐析次之；理论上，粗酶蛋白浓度应该比偷袭盐析低。原因可是盐析和偷袭操作不当导致菠萝蛋白酶损失严重，或者盐析后的沉淀无法完全溶解也可能导致溶液中蛋白质含量降低。
盐析以及透析后菠萝蛋白酶的活力比粗酶高，这可能是因为未盐析透析之前，菠萝蛋白酶受例如金属离子等因素影响，导致蹙眉的酶活力和酶比活比盐析和透析低。
由菠萝蛋白酶分离纯化表可知，盐析和透析得到的酶回收率都不高。可能是实验中加入的硫酸铵并没有充分溶解，导致局部硫酸铵含量过高，使得蛋白酶变性失活，最终影响蛋白酶的回收率。
在纯化倍数上，盐析的纯化倍数比透析的纯化倍数要高一些，这是与两个处理环节得到酶活力及蛋白质含量有关，盐析后酶的浓度比透析的高，所以盐析的纯化倍数会更高。
【思考题】
1.如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活？
酶的变性失活主要与有机溶剂、金属离子、高温、高酸碱等因素有关。所以在分离纯化时注意：①不能用自来水配制透析液；②不使用不清洁的仪器设备；③控制反应温度，避免高温。
2.常见的酶活性表示方法有那些（如：U/mL酶液；U/mg蛋白质; U/g干重或鲜重；U/g 酶粉 等）？它们各有什么含义，适用哪些场合？
U/mL酶液用来表示每单位体积酶液中的酶活力情况，适用于表示液体酶中的酶活力大小。U/mg蛋白质用来表示单位质量样品中的酶活力情况，适用于表示含一种或多种蛋白的样品中的酶活力大小。U/g干重或鲜重用来表示每克原始样品中的酶活力情况，适用于原始样品的酶活力表示。U/g 酶粉表示每克酶粉中的酶活力情况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。
3.蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些变性了？哪些没有变性？
沉淀蛋白质常用的方法：单宁沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂法、重金属法、生物碱试剂法。其中有机溶剂法、单宁沉淀法、重金属法、生物碱法往往会使蛋白质变性，等电点沉淀法通常不会使蛋白质变性。
4.实验中硫酸铵盐析为什么要选择0%~30%饱和度？
在0-30%的饱和度范围内，菠萝蛋白酶的酶回收率随着饱和度的增大而增大，当超出这个范围时菠萝蛋白酶的回收率降低。因此，本次实验选择在盖饱和度范围内进行盐析处理。[3]
参 考 文 献
[1]吴茂玉,马超,乔旭光,宋烨,赵岩.菠萝蛋白酶的研究及应用进展[J].食品科技,2008(08):17-20.
[2]陈伟杰. 菠萝皮蛋白酶的制备、特性及应用的研究[D]. 锦州医科大学, 2016.
[3]梁宏宇. 菠萝蛋白酶提取方法的研究[D].广西民族大学,2012.
8 / 8
.
原始数据
1.测定体积
步骤
总体积（mL）
粗提取
61+1
盐析
15+1
透析
13
2.考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量

步骤
空白组
平行1
平行2
平行3
A595nm OD值
粗提
—
0.321
0.481
0.487
盐析
—
0.434
0.456
0.360
透析
—
0.621
0.678
0.478
3.酶活测定

步骤
空白
平行1
平行2
平行3
A280nm OD值
粗提
—
0.791
0.818
0.868
盐析
—
0.823
0.907
0.986
透析
—
0.894
0.875
0.848