精子核成熟度与精液质量的相关性分析.pdf

生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期:1335.DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.09.006精子核成熟度与精液质量的相关性分析宋明哲1，黄文思1.2，叶丽君1-2，彭月琴1，梁锦明，肖炜强，曾勇1.2（1.深圳中山泌尿外科医院泌尿外科，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳518 0 452.广东省围着床期生殖免疫工程技术研究中心，深圳518 0 45）【摘要】目的探讨精子核成熟度与精子数量、活力、形态学和DNA完整性的相关性。方法回顾性分析2 0 2 2 年1月1日至12 月31日在深圳中山泌尿外科医院行精子核成熟度检查的42 3例男性患者的临床资料，根据精子核成熟度不同将患者分为高成熟组（136 例）、中成熟组（2 42 例）和低成熟组（45例）。比较各组患者的精液常规参数（精子总数、精子浓度、前向运动精子百分率等）、DNA碎片指数（DFI）、顶体酶活性等，采用双变量、偏相关和线性回归分析精子核成熟度与精液质量的相关性。结果各组间精液常规参数比较：低成熟组的精子总数、精子浓度显著低于高成熟组（P0.05）；低成熟组和中成熟组的前向运动精子百分率显著低于高成熟组（P0.05），非活动精子百分率显著高于高成熟组（P0.05)；正常形态精子百分率随着核成熟度的降低而显著降低（P0.05），头部缺陷精子百分率随着核成熟度的降低而显著升高（P0.05）。低成熟组和中成熟组的DFI和高DNA染色（HDS）显著高于高成熟组（P0.05），低成熟组的HDS显著高于中成熟组（P0.05）外，精子总数、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率与精子核成熟度均呈正相关（P0.05），不活动精子百分率、头部缺陷精子百分率、DFI及HDS与精子核成熟度均呈负相关（P 0.0 5）。结论精子核成熟度与精子活力、形态学、DFI及HDS均存在一定相关性，尤其与HDS显著相关，提示精子核成熟度可以作为精液检查常规参数的补充，值得临床关注。【关键词】精子核成熟度；精子DNA完整性；精子形态学；精子活力；精子数量【中图分类号】R321.1Correlation analysis between sperm nuclear maturity and semen qualitySONG Ming-zhe,HUANG Wen-sil.2*,YE Li-junl-2,PENG Yue-qin,LIANG Jin-ming,XIAOWei-qiang,ZENG Yongl.21.Department of Urology,Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation,Shenzhen Zhongshan Institute for Reproduction and Genetics,Shenzhen ZhongshanUrology Hospital,Shenzhen 5180452.Guangdong Engineering Technology Research Center of Reproductive Immunology for Peri-implantation,Shenzhen518045Objective:To investigate the correlation between sperm nuclear maturity and semen quality includingsperm count,sperm motility,sperm morphology and sperm DNA integrity.Methods:The clinical data of 423 male patients who were detected sperm nuclear maturity inShenzhen Zhongshan Urology Hospital from 1st January 2022 to 31s December 2022 were retrospectivelyanalyzed.These patients were divided into high maturity group(n=136),medium maturity group(n=242)and low maturity group(n=45)according the level of sperm nuclear maturity.The semen routine【文献标识码】A【A b s t r a c t【收稿日期】2023-03-15；【修回日期】2 0 2 3-0 5-0 9【基金项目】深圳市科技计划项目（JCYJ20210324121807021）【作者简介】先宋明哲，男，湖北荆州人，学士，副主任医师，临床医学专业，（*通讯作者）1336parameters including total sperm count,sperm concentration and percentage of progressive sperm motility,and DNA fragmentation index(DFI)and acrosin activity etc.were analyzed.Then bivariate,partialcorrelation and linear regression analysis were used to assess the correlation between sperm nuclearmaturity and semen quality.Results:Comparing the difference of semen parameters among the groups showed that total spermcount and sperm concentration in low maturity group were significantly lower than high maturity group(P0.05).The percentage of progressive sperm motility in low and medium maturity group weresignificantly lower than high maturity group(P o.05),while percentage of immotile sperm wassignificantly higher than high maturity group(Po.05).The percentage of morphologically normalspermatozoa significantly decreased with reduction of nuclear maturity(P0.05),while the percentage ofsperm with head defects significantly increased with decrease of nuclear maturity(P0.05).The level onDFI and high DNA stainability(HDS)in low and medium maturity group were significantly higher thanhigh maturity group(P0.05),and HDS in low maturity group were significantly higher than mediummaturity group(P0.05).The correlation analysis results show that there was no significantlycorrelation between sperm nuclear maturity and sperm concentration after adjusting male age(P0.05),while sperm nuclear maturity was significantly positive correlated with total sperm count,the percentage ofprogressive sperm motility and the percentage of normal morphological spermatozoa(P0.05),whereasnegatively correlated with the percentage of immotile spermatozoa,the percentage of sperm with headdefects,DFI and HDS(P0.05).Conclusions:Sperm nuclear maturity has certain correlation with sperm motility,morphology,DFI andHDS,especially significantly with HDS.It suggested that sperm nuclear maturity can be used as asupplement of semen routine parameters,and is worthy of clinical attention.Key words:Sperm nuclear maturity;Sperm DNA integrity;Sperm morphology;Sperm motility;Sperm count(J Reprod Med 2023,32(09):1335-1341)精子发生晚期，精子染色质经历核蛋白组型转度可有助于精液参数异常的病因查找。然而，目前换过程，约8 5%的组蛋白被鱼精蛋白替换 11。鱼精缺乏检测精子核成熟度的明确指征。本研究通过苯蛋白是富含精氨酸和半胱氨酸的碱性蛋白。带正电胺蓝染色法评估精子核成熟度，比较不同精子核成荷的精氨酸与带负电荷的DNA紧密结合，以及蛋熟度组间精液参数的差异及其异常率的变化，同时白分子内和蛋白分子间通过半胱氨酸氧化形成二硫分析精子核成熟度与精液参数的相关性，以期为临键，使染色质高度凝聚，精子核随之缩小6 2 0床检测和解释精子核成熟度参数提供参考依据。倍 2-3,这是精子核成熟的表现。精子核成熟是保障资料和方法精子染色质结构稳定性的重要过程，这有助于染色质抵抗化学和物理损伤从而确保遗传物质高保真地传递给后代 2.41。核成熟度低的精子鱼精蛋白替换组蛋白不充分，致使组蛋白滞留过量从而降低染色质凝聚。这些精子易受氧化应激等的损伤，导致DNA碎片指数（DFI)升高，并可能存在膜结构、运动能力等的缺陷 5-7。有研究报道，精子核成熟度低还与精子浓度、总数和前向运动精子百分率(PR)降低以及形态学改变有关 8-9。因此，评估精子核成熟生殖医学杂志2 0 2 3年9月第32 卷第9期一、研究对象收集2 0 2 2 年1月1日至12 月31日在深圳中山泌尿外科医院进行精子核成熟度检测的男性患者506人次，剔除重复检测该项目的患者8 3人次，最终纳入42 3例男性患者为研究对象进行回顾性分析。纳人标准：同时进行了精子核成熟度及其他精液参数检测的患者。排除标准：精液浓度 30%）45例；中成熟组（15%核蛋白不成熟精子百分率 30%）2 42 例；高成熟组（核蛋白不成熟精子百分率 3910 条/每次射精，精子浓度1510 条/ml，前向运动精子百分率32%，正常形态精子百分率4%。2.苯胺蓝染色法分析精子核成熟度：使用苯胺蓝-伊红染色液试剂盒（深圳华康）检测核蛋白不成熟精子百分率，按照试剂盒说明书方法操作。取5l浓度为2 0 10 条/ml精子悬液采用拉薄技术涂片，涂片干燥后甲醇固定，苯胺蓝液染色，洗掉苯胺蓝液，伊红液染色，洗掉伊红液，干燥后在油镜下观察。由于不成熟精子的核蛋白主要为富含赖氨酸的组蛋白,苯胺蓝与赖氨酸结合生成紫蓝色化合物，精子被染成蓝色，而成熟精子核蛋白主要为鱼精蛋白则被伊红染成红色。计算核蛋白不成熟精子百分率（%）蓝色精子数/（蓝色精子数十红色精子数)X100%。3.精子染色质结构分析法测定DFI和高DNA染色（HDS)值：使用精子核完整性染色试剂盒（安徽安科生物)进行精子染色后，通过流式细胞仪（深圳迈瑞)检测绿色和红色荧光，计算DFI（%红色:1337.荧光精子数/（绿色荧光精子数十红色荧光精子数）100%和HDS（%)高绿色荧光精子数/（绿色荧光精子数十红色荧光精子数）X100%。D FI的正常范围为30%,HDS的正常范围为15%。4.精子顶体酶活性检测：使用精子顶体酶活性定量检测试剂盒（南京欣迪）联合酶标仪（BioTekEon，美国)检测顶体内精氨酸酰胺酶活性，该指标能间接反映顶体酶活性。精子顶体酶活性的正常范围为36 IU/10。5.活性氧荧光探针测定精子活性氧（ROS)水平：使用精子活性氧试剂盒（安徽安科生物）进行精子染色后，通过流式细胞仪检测荧光强弱，鉴别ROS含量正常精子和ROS过量精子，计算携带过量ROS精子的比例。ROS过量精子百分率的正常范围为 40%。三、统计学分析采用SPSS23.0软件进行统计分析。计量资料以均数土标准差（士s)表示，采用单因素ANOVA检验的最小二乘法进行组间比较；计数资料以百分率（%)表示，采用检验进行组间比较。采用皮尔逊双变量和偏相关分析精子核成熟度与精液质量的相关性；采用线性回归分析验证精子核成熟度与精液质量的相关性。P0.05为差异具有统计学意义。结果一、研究对象的基本情况本研究纳人的42 3例患者中，核蛋白不成熟精子百分率 15%（高成熟组）的136 例，占比32.15%；15%30%（低成熟组）的45例，占比10.64%。高成熟组的平均年龄为（35.49土6.18）岁，中成熟组为（34.43士5.8 8）岁，低成熟组为（33.2 0 士4.12)岁；低成熟组的平均年龄显著低于高成熟组(P0.05)。二、不同精子核成熟度组间精液常规参数及形态学比较各组间精液常规参数比较，低成熟组的精子总数、精子浓度显著低于高成熟组（P0.05)；低成熟组和中成熟组的PR显著低于高成熟组（P0.05），IM显著高于高成熟组（P0.05。正常形态精子百分率随着核成熟度的降低而显著降低（P0.05），头部缺陷.1338精子百分率随着核成熟度的降低而显著升高（P0.05），颈部和中段缺陷、主段缺陷精子百分率各组精子浓度/组别例数（X 10 条/每次射精）高成熟组136中成熟组242低成熟组45组别例数正常形态精子百分率高成熟组136中成熟组242低成熟组45注：与高成熟组比较，*P0.05，*P 0.0 0 1；与中成熟组比较，#P0.05。三、不同精子核成熟度组间精子DFI、顶体酶活性、ROS等参数比较低成熟组和中成熟组的DFI和HDS显著高于表2 不同精子核成熟度组间精子DFI、顶体酶活性、ROS等参数比较（土s)组别例数高成熟组136中成熟组242低成熟组45注：与高成熟组比较，*P0.05，*P 0.0 0 1；与中成熟组比较，#P0.001。四、不同精子核成熟度组间精液指标异常率比较比较各组间精液参数异常率（异常例数/总例数X100%)发现，低成熟组的精子总数、精子浓度和组别例数高成熟组136中成熟组242低成熟组45组别例数高成熟组136中成熟组242低成熟组45注：本表中各项参数异常率的计算以实际检测了该指标的患者例数为分母。与高成熟组比较，P0.05，*P 0.0 0 1；与中成熟组比较，#P0.05，#P0.05）。各组的精液常规参数及形态学结果详见表1。表1不同精子核成熟度组的精液常规参数比较（士s)精子总数/(X10条/ml)229.99234.7864.6055.47191.09173.8355.6151.15123.12156.20*36.4644.00*头部缺陷精子百分率5.322.3194.692.314.001.86*96.001.86*2.711.52*#97.291.52*#高成熟组（P0.05），低成熟组的HDS显著高于中成熟组（P0.05)（表2）。DFI/%HDS/%10.308.625.102.6216.8614.98*7.815.22*18.5211.46*18.11 8.10*#表3不同精子核成熟度组间精液参数异常率比较（%）精子总数PR8.45(6/71)15.49(11/71)19.85(27/136)22.79(31/136)38.46(10/26)*42.31(11/26)*DFIHDS5.17(3/58)0.00(0/58)14.95(16/107)7.48(8/107)22.22(4/18)61.11(11/18)*#PR/%41.5219.3233.7318.31*29.3015.13*颈部和中段缺陷精子百分率11.603.0211.383.7711.722.01精子顶体酶/（IU/106）77.1742.7864.4145.4953.6023.93HDS异常率显著高于高成熟度组（P0.05），低成熟组的HDS异常率显著高于中成熟度组（P0.001），正常形态精子百分率的异常率随着精子核成熟度的降低显著升高（P0.05)（表3）。精子浓度33.80(24/71)45.59(62/136)53.85(14/26)精子顶体酶9.38(3/32)25.49(13/51)14.29(1/7)NP/%11.38 4.1510.714.929.304.45主段缺陷精子百分率10.053.1910.003.6710.232.79过量ROS精子比例/%19.9111.5522.3913.3120.3911.70正常形态精子百分率33.80(24/71)58.09(79/136)*84.62(22/26)*#ROS8.93(10/112)12.11(23/190)6.45(2/31)IM/%47.1120.8455.9220.77*61.4318.25*生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期五、精子核成熟度与精液质量的相关性分析组间差异具有统计学意义的精液参数与精子核成熟度的相关性，结果显示核蛋白不成熟精子百分率与PR和正常形态精子百分率呈负相关（P0.05），与IM、头部缺陷精子百分率、DFI和HDS呈正相关（P0.05)，与精子总数和精子浓度无显著校正年龄前参数r精子总数-0.116精子浓度0.103PR-0.166IM0.161正常形态精子百分率-0.346头部缺陷精子百分率0.346DFI0.181HDS0.553注：1rl0.3为微弱相关；0.3|rl0.5为低度相关；0.5|rl0.8为显著相关；lrl0.8为高度相关。通过线性回归进一步验证精子核成熟度与精液质量的相关性。线性回归结果同样显示核蛋白不成熟精子百分率与PR和正常形态精子百分率呈负相参数精子总数精子浓度PRIM正常形态精子百分率头部缺陷精子百分率DFIHDS注：B值：回归系数；*P0.05）；由于男方年龄是影响精液质量的主要因素之一，因此，校正男方年龄后再次分析精液参数与精子核成熟度的相关性，结果发现除精子浓度与精子核成熟度未表现出明显相关性（P0.05)外，其余精液参数均与精子核成熟度相关(P0.05），且相关系数绝对值（lrl)增大（表4）。表4核蛋白不成熟精子百分率与精液质量的相关性分析P0.0770.1180.0110.0140.0010.0010.0140.001关（P0.05)，与IM、头部缺陷精子百分率、DFI和HDS呈正相关（P0.05（表5）。表5核蛋白不成熟精子百分率与精液质量的线性回归分析结果B值-2.387-0.5460.3280.358一0.0 7 70.0770.2710.378校正年龄后-0.1320.1080.1760.174-0.3520.3520.2050.56095%CI(5.037,0.262)(1.232,0.139)(0.582,0.075)(0.073,0.642)(0.106,-0.048)(0.048,0.106)(0.056,0.486)(0.294,0.461)形成小体积的长形精子，使精子在女性生殖道高效游动；能有效保护遗传物质免受物理和化学损伤，抑制转录从而保障遗传物质的稳定性；还有助于受精后父源染色质快速解聚和重编程。与正常生育男性相比,男性不育患者精子核成熟度显著降低 1-12。P0.0440.1010.0070.0080.0010.0010.0060.001P0.0770.1180.011*0.014*0.001*0.001*0.014*0.001*.1340因此，评估精子核成熟度对男性不育的病因分析具有重要意义。目前，由于缺乏关于精子核成熟度临床适应症和治疗方案的专家共识，临床医生针对该指标的诊治存在较多疑惑，例如哪些患者需要检查，什么因素引起该指标异常，如何提高治疗效果等。因此，本研究通过分析精子核成熟度与精液质量的相关性，旨在为临床检测精子核成熟度的适应症及检测结果评估提供依据。本研究结果显示精子核成熟度与精子DNA完整性相关(P0.05),其中与HDS显著相关（表4、表5），且随着精子核成熟度降低HDS及其异常率显著升高（P0.05）。目前，关于精子核成熟度与HDS相关性的研究较少,两者相关的可能原因尚未阐明。我们认为HDS是吖啶橙染料与精子DNA可接触性增加的结果，而染料与DNA可接触性的变化与染色质凝聚程度相关，苯胺蓝染色法是通过检测组蛋白水平间接反映染色质凝聚程度，这可能是HDS和苯胺蓝染色结果显著相关的原因。Zini等 13证实组蛋白H2B水平增加与HDS升高相关。近年来，有研究者发现HDS与评估精子核成熟度的苯胺蓝染色法、色霉素A3染色法和甲苯胺蓝染色法的检测结果弱相关 14，而且HDS随男性年龄增加而降低 15-16，因此有学者提出HDS不是评估精子核成熟度的可靠指标 17。Mnzo18提出HDS随年龄增加而降低是因为高龄引起的脂质过氧化和谷胱甘肽氧化是鱼精蛋白形成二硫键与DNA紧密结合所需。本研究结果与上述文献不一致的原因可能有：临床研究的研究对象、样本量和研究设计等不同可能导致结论存在差异；另外，本研究没有直接分析HDS精子群的核成熟度情况。之前有学者使用小鼠开展实验研究，结果提示DFI水平反映了染色质凝聚程度 5；人类精子相关研究也提示精子核成熟度与DFI显著相关 13。本研究中同样发现核蛋白不成熟精子百分率与DFI呈正相关，但相关性弱。精子组蛋白核型转换需要DNA结构的空间改变，内源性核酸酶在精子DNA断裂和修复中发挥重要作用，当内源性核酸酶系统效率不足时，必需的DNA断裂减少并且未被修复的DNA碎片增加，随后导致组蛋白核型转换异常和DFI增多 19。Noblanc等 2 0 提出核不成熟精子的染色质松散，易受氧化应激损伤，导致DFI升高，精子调亡增多。本研究旨在分析精子核成熟度是否与ROS有关，结果发现不同精子核成熟度组间的ROS无显生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期著差异，提示不同精子核成熟度患者的ROS可能是同质的；但低成熟组和中成熟组患者的DFI显著高于高成熟组，提示在相同ROS水平时，核成熟度低的精子可能对氧化应激的易感性更高，导致DFI升高。这也间接表明精子核成熟度对于DNA完整性十分重要。本研究结果显示精子核成熟度与正常形态精子百分率呈正相关（P0.05），与头部缺陷精子百分率呈负相关（P0.05），与颈部和中段缺陷、主段缺陷精子百分率无明显相关性，与Sellami等 19和Mohammadi等 14研究结果一致。这可能由于精子头部主要由细胞核和顶体组成，细胞核凝聚程度决定细胞核的大小，细胞核大小直接影响了头部的形态，而精子尾部（包括颈部、中段、主段和末段)的形成主要与细胞质脱落和细胞形态演变相关。近来的研究发现占精子头部面积超过15%的空泡区域富含组蛋白H3和与基因表达相关的表观遗传标记H3K4me3，但是缺乏鱼精蛋白2 和与基因沉默相关的表观遗传标记H3K27me3，提示精子头部缺陷与精子核成熟度低相关 2 1本研究结果提示精子核成熟度与精子活力（包括PR和IM)相关，但相关性弱。这可能由于染色质高度凝聚使精子头部体积缩小，有利于精子快速运动 2-3。但是，精子头部体积对精子活力的影响是有限的，因为精子尾部结构才是决定精子活力的主要因素 2 2 。本研究的优势：首先，与其他文献将患者分为精子核成熟度正常组和异常组相比，本研究将患者细分为高成熟组、中成熟组和低成熟组，有助于分析不同水平精子核成熟度患者的精液质量；其次，进一步比较了各组间不同精液参数的异常率，有助于深人探究精子核成熟度对精液质量的实质性影响；再次，本研究中每位患者的精液检测均使用同一份样本，尽可能保证了样本的同质性。但因为本研究为回顾性分析且样本量有限，研究结论可能存在一定局限性，后续需更大样本量的临床研究进一步深入探讨，还可以通过基础研究探讨精子核成熟度影响精液质量（尤其是HDS)的分子机制。综上所述，精子核成熟度与HDS显著相关，并且随着精子核成熟度降低HDS显著升高，提示在精子核成熟度达到异常值前就要关注HDS的变化。低成熟组的HDS和正常形态精子百分率异常率分别达到6 1.11%和8 4.6 2%，提示临床上可以根生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期据HDS和正常形态精子百分率判断是否需要检查精子核成熟度，以辅助病因查找。此外精子核成熟度与精子活力、精子形态学及DFI相关，但相关性弱，说明精子核成熟度对这些参数的影响有限。本研究结果提示精子核成熟度是反映精子染色质结构的相对独立因子，可以作为精液常规参数的补充。【参考文献】1Bao J,Bedford MT.Epigenetic regulation of the histone-to-protamine transition during spermiogenesis JJ.Reproduction,2016,151:R55-70.2Oliva R.Protamines and male infertilityJJ.Hum ReprodUpdate,2006,12:417-435.3Balhorn R.The protamine family of sperm nuclear proteinsLJ.Genome Biol,2007,8:227.4Smith TB,Dun MD,Smith ND,et al.The presence of atruncated base excision repair pathway in human spermatozoathat 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