柯里拉京调节巨噬细胞胆固醇代谢的作用及其机制.pdf

网络出版时间：网络出版地址：心血管药理学柯里拉京调节巨噬细胞胆固醇代谢的作用及其机制邓欣，孟达，吴静宜，姜丙通，杨轶洋，张雅琼，赵毅，黄丰，车彦云（云南中医药大学中药学院，云南 昆明 ；太原工业学院环境与安全工程系，山西 太原 ）收稿日期：，修回日期：基金项目：云南省科技厅 云南中医药大学应用基础联合研究专项项目重点项目（）；云南省科技厅 云南中医药大学应用基础联合研究专项项目面上项目（）作者简介：邓欣（），女，硕士生，研究方向：中药药效物质基础及其作用机制，：；车彦云（），女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药药效物质基础及其作用机制，通信作者，：文献标志码：文章编号：（）中 国 图 书 分 类 号：；摘要：目的探究柯里拉京（，）调节巨噬细胞胆固醇代谢的作用及机制。方法采用分子对接技术，预测 调节胆固醇代谢的蛋白靶点。结合 氧化修饰型低密度脂蛋白（，）诱导建立的 巨噬细胞泡沫模型评价其活性；采用实时聚合酶链式反应和免疫印迹方法检测胆固醇代谢相关基因和蛋白表达；并通过高脂饮食诱导 小鼠动脉粥样硬化（，）模型研究其活性及其机制。结果 与胆固醇代谢相关的 类清道夫受体（，）和 以及过氧化物酶体增殖物激活受体 （，）和细胞膜上的 结合盒转运体 （，）蛋白能形成氢键和疏水相互作用。细胞实验表明，（、和 ）降低巨噬细胞内 的含量，下调 的基因和蛋白表达，下调 的基因表达，并上调了 和 的基因和蛋白表达。动物实验表明，（、和 ）降低小鼠血清中的 含量，减少主动脉根部的斑块形成，降低了主动脉根部斑块中 、的荧光蛋白表达水平。结论 能够通过调节 、和 介导的胆固醇代谢，抑制巨噬细胞泡沫化，发挥抗 作用。关键词：柯里拉京；巨噬细胞；胆固醇代谢；基因表达；蛋白表达；动脉粥样硬化开放科学（资源服务）标识码（）：动脉粥样硬化（，）是一种以巨噬细胞源性泡沫细胞形成为特征的慢性炎症性疾病 。巨噬细胞源性泡沫细胞的形成与胆固醇代谢密切相关 。巨噬细胞募集修饰后的氧化低密度脂蛋白（，），通过 受体、类清道夫受体（，）和 介导的内吞作用进入胞内，同时，游离胆固醇还可以通过细胞膜上的 结合盒转运体 （，）和 （，），以及 类 （）进行反向胆固醇转运（，），当巨噬细胞内胆固醇吸收与排出失衡时，脂质过度沉积，泡沫细胞形成。因此，调节巨噬细胞内的胆固醇代谢，是预防和治疗 的有效方法。柯里拉京（，），别名诃子次鞣素或鞣云实精，是一种多酚单宁酸类化合物，广泛存在于老鹳草、叶下珠、白三叶草、龙眼、余甘子等植物中 。现代药理研究表明，具有抗肿瘤、抗 、降血压、抗病毒、保肝等药理活性 。体外细胞实验研究发现，可通过减轻氧化损伤或抑制血管平滑肌细胞增殖而有效抑制 进程 。此外，还可以通过抑制单核 巨噬细胞的 信号通路，减少促炎细胞因子的释放，从而减少 斑块的形成 。体内动物实验发现，能明显减少家兔和小型猪 斑块形成 。本课题组在前期研究中发现，余甘子总酚可以通过调控巨噬细胞胆固醇代谢发挥抗 的作用 。是余甘子中含量较高的水溶性鞣质 ，其是否可通过调控巨噬细胞胆固醇代谢发挥抗 机制尚未明确。因此，本研究拟基于分子对接技术预测 调节胆固醇代谢的作用靶点，结合细胞实验及动物实验探讨 抗 的活性及其机制。材料与方法 与胆固醇吸收、排出途径相关蛋白的分子对接在 数据库（：）里输入化合物单体的名称或者 编中国药理学通报 ；（）：号进行查询，并下载小分子 结构的 文件，应用 对小分子 结构进行 力场分析和能量最小化优化，并保存成 格式，再用 进行处理，通过计算电荷、合并非极性氢处理及设置小分子能旋转的键并保存成 格式。从 数据库（：）中获得靶点蛋白三维结构，运用 软件，去除蛋白中的配体和水分子，提取蛋白受体的结构。运行 进行加氢、计算电荷、合并非极性氢处理后保存成 格式文件。利用分子对接软件 进行对接处理，通过 运算生成 文件。细胞实验 药物与试剂 （）购自上海同田生物科技有限公司，经高效液相色谱法检测，纯度 ；辛伐他汀购自中国食品药品检定研究所；（）购自广东奕源生物科技有限公司；总胆固醇微量法检测试剂盒（，）（）和游离胆固醇微量法检测试剂盒（，）（）购自北京索莱宝生物有限公司；提取试剂盒（）购自日本 公司；逆转录试剂盒（）和荧光定量试剂盒（）均购自美国 公司；油红 染料（）购 自 美 国 公 司；噻 唑 蓝（）（）和 蛋白上样缓冲液（）均购自北京索莱宝生物有限公司；蛋白浓度测定试剂盒（）购自碧云天生物技术公司；抗体（）、抗体（）、抗体（）和兔二抗（）（）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；抗体（）购自美国 公司；抗体（）购自武汉塞维尔公司；化学发光检测试剂（）购自北京 公司。其他试剂均为分析纯。细胞来源与培养 巨噬细胞株购自深圳豪地华拓生物科技有限公司，用含 血清的 高糖培养基于 ，恒温培养箱中培养（血清和 培养基均采自 公司）。取对数生长期的细胞进行实验。法测定细胞增殖活性收集细胞调整密度为 ，接种到 孔板内（孔），后，分别加入、的 处理细胞 后，加入 刺激。每组设置 个复孔，后，更换为 培养基和 每孔，孵育 后，弃上清，加入 溶解 ，在 处的吸光度，计算细胞存活率。油红 染色观察细胞内脂质沉积的情况收集细胞调整密度为 ，接种到 孔板（孔），后分为正常组（）、模型组（）、低剂量组（：）、中剂量组（：）、高剂量组（：），分别加入相应剂量 培养 后，除正常组外，其余各组均加入 进行诱导，后采用油红 染色在显微镜下观察细胞内脂质积累情况，每孔加入 溶解油红染料，在 读取吸光度值 。酶法测定 巨噬细胞内胆固醇含量收集细胞调整密度为 ，接种到 孔板（孔），后分为正常组（）、模型组（）、阳性药物组（：辛伐他汀）、低剂量组（：）、中剂量组（：）、高剂量组（：），分别加入相应剂量 和辛伐他汀培养 后，除正常组外，其余各组均加入 进行诱导，后收集细胞，按试剂盒说明书操作，并计算 的比值。当 时泡沫细胞形成。实时聚合酶链式反应（，）检测 巨噬细胞胆固醇代谢相关基因的表达收集细胞调整密度为 ，接种到 孔板（孔），后按“”项下分组、给药以及诱导，后收集细胞，按 提取试剂盒说明书提取总 ，检测 、和 基因表达。引物设计如下 。（）（）免疫印迹（）检测蛋白表达收集细胞调整密度为 ，接种到 孔板（孔），后按“”项下分组、给药以及诱导，后收集细胞，按说明书提取蛋白，进行 、和 蛋白含量水平检测中国药理学通报 ；（）（一抗稀释浓度为：；二抗稀释浓度为：）。动物实验 材料与试剂周龄雄性 小鼠 只，体质量（），购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，质量合格证号：，许可证号：（京）；小鼠氧化三甲胺（，）酶联免疫分析试剂盒（）购自中国武汉酶免公司；五色套染染色液（）购自北京索莱宝生物科技有限公司；中性多聚甲醛（）购自北京雷根生物技术有限公司。分组及给药 只 小鼠适应性基础饲料喂养 周后，称质量后按随机数字法分为：正常组（）、模型组（）、阳性药物组（：）、低剂量组（：）、中剂量组（：）和 高剂量组（：）个组，除正常组以普通饲料喂养外，其余 组喂养含脂肪 、胆固醇 的高脂饲料。同时，正常组和模型组给予 羧甲基纤维素钠生理盐水溶液灌胃，其余 组按相应药物剂量灌胃 周。取材及检测指标最后一次给药结束后禁食不禁水 后，乙醚麻醉，眼球取血，分离血清用于 水平检测；打开小鼠腹腔，剥离主动脉，保存于多聚甲醛中，用于 染色和脂代谢相关清道夫受体 和 的免疫荧光染色。统计学分析数据均采用 分析，用珋 表示，使用 软件进行图像定量分析。多组间比较用 检验，两组间比较用 检验。结果 分子对接结果如 所示，与 （：）靶点蛋白对接能量为 ，分子对接结果显示配体能够通过 、等氢键与蛋白受体进行分子 蛋白质相互作用；与 （：）靶点蛋白对接能量为 ，分子对接结果显示配体能够通过 氢键与蛋白受体进行分子 蛋白质相互作用；与 （：）靶点蛋白对接能量为 ，分子对接结果显示配体能够通过 氢键与蛋白受体进行分子 蛋白质相互作用；与 （：）靶点蛋白对接能量为 ，分子对接结果显示配体能够通过 、氢键与蛋白受体进行分子 蛋白质相互作用。：；：；：；：细胞实验 对 诱导的 巨噬细胞源性泡沫细胞活性的影响使用 法检测 对 诱导的 巨噬细胞源性泡沫细胞活性的影响，如 所示，干预 后，明显降低细胞存活率（），对细胞存活率无明显影响，可选择 、和 作为处理细胞的安全浓度。对 诱导的 巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质沉积的影响 用油红 染色检测 对 诱导的 巨噬细中国药理学通报 ；（）（珋 ，）胞源性泡沫细胞内脂质沉积的影响，如 所示，与正常组相比，模型组细胞可观察到红色脂滴明显增加，细胞部分分化；与模型组相比，（、）明显抑制了细胞内脂滴的增加，减轻细胞分化程度。如 所示，用异丙醇将细胞内染料洗下，在 波长处检测其吸光值，对脂质含量进行定量后发现，模型组吸光值最高，（、）吸光值呈梯度递减。使用酶联免疫法检测 对 诱导的 巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量，如 所示，模型组细胞内 含量明显升高（）；如 所示，含量无明显变化；如 所示，模型组中 ，表明 （珋 ，）：（）；：；：；：；：；，中国药理学通报 ；（）巨噬细胞源性泡沫细胞建模成功。与模型组相比，阳性药物组明显降低了 的含量（），并且明显抑制了巨噬细胞的泡沫化（），与模型组相比，（、和 ）均明显降低细胞内的 的含量（），（、和 ）中 均 ，表明 （、和 ）均可明显抑制巨噬细胞的泡沫化（）。对 诱导的 巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇代谢相关基因表达的影响采用 检测促进胆固醇代谢相关基因表达。如 所示，与正常组相比，模型组 和 的基因表达明显升高（），对 和 的基因表达无明显影响。与模型组相比，阳性药明显降低了 和 的基因表达（或 ），对 和 的基因表达影响不明显。与模型组相比，（、和 ）明显下调了 的基因表达（），（）对 的基因表达影响不明显，（、）明显下调了 的基因表达（），（、）对 和 的基因表达影响不明显，（）明显上调了 和 的基因表达（）。对 诱导的 巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇代谢相关蛋白表达的影响采用 检测促进胆固醇代谢相关的蛋白表达。如 所示，与正常组相比，模型组 的蛋白表达明显升高（），和 的蛋白表达明显降低（），蛋白表达无明显变化。与模型组相比，阳性药明显降低了 的蛋白表达（），、的蛋白表达无明显变化。与模型组相比，（、）明显下调了 的蛋白表达（或 ），（）明显上调了 和 的蛋白表达（）。动物实验 对高脂饮食诱导的 小鼠主动脉根斑块的影响如 所示，正常组主动脉根部血管结构完整，未见明显病变；模型组内膜明显增厚 （珋 ，）：；：；：；：；，中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：，；：；，（珋 ，）且有大量的泡沫细胞堆积，血管结构被破坏，说明造模成功；阳性药物组与 给药组主动脉根部内膜和血管结构均有不同程度改善，泡沫细胞减少。对高脂饮食诱导的 小鼠血清 的影响如 所示，与正常组相比，模型组小鼠血清中的 含量明显升高（），与模型组相比，阳性药明显降低了小鼠血清中的 含量（），（、）明显降低了小鼠血清中的 含量（或 ）。（珋 ，）；，对高脂饮食诱导的 小鼠主动脉根斑块胆固醇吸收的影响如 所示，与模型组相比，阳性药物组主动脉根部斑块中 表达水平均明显下调（），表达水平不明显，（、和 ）都明显降低了主动脉根部斑块中 、的蛋白表达水平（或 ）。讨论动脉壁膜内巨噬细胞中的脂质过度沉积，是引起 病变的重要原因之一。脂质的沉积与胆固醇的吸收和排出异常密切相关。研究表明，巨噬细胞内 胆固醇的吸收受 和 调控 ，胆固醇的排出依赖于 驱动泵调控。和 作为一类常见的 驱动泵的 超家族，被认为是该过程最关键的调节蛋白，两者相互配合共同完成巨噬细胞胆固醇的 过程 。同时还发现，缺乏 和 蛋白的小鼠，主动脉 病变加重，其斑块内巨噬细胞中有过量胆固醇蓄积 。表明调控胆固醇代谢，是预防和治疗 的重要途径。目前，临床现有的他汀类药物，虽然可以明显降低体内胆固醇水平，但与贝特类药物联用时会引起严重的不良反应 。因此，寻找可以调节胆固醇代谢的天然小分子化合物，具有重要的中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：；：；：，临床意义。本研究基于课题组前期发现的余甘子总酚可通过调节巨噬细胞胆固醇代谢来发挥抗 作用，应用分子对接技术筛选其中可能具有调节胆固醇代谢中国药理学通报 ；（）的活性成分，初步推测余甘子总酚中含量较高 为候选分子，采用细胞模型进行筛选与评价，并结合动物模型进行了活性评价和作用机制探讨。软件是以对接能量的高低来判断结合程度的，能量值越小，与有效化合物结合的亲和力越大，与清道夫受体 和 以及 和 蛋白对接能量值均低于 ，表明该药对的调节胆固醇代谢的蛋白有很好的结合性，可调控胆固醇的吸收与排出机制。本课题组进一步用 诱导 巨噬细胞进行研究，结果显示，可以减少巨噬细胞内的脂滴生成，在抑制巨噬细胞泡沫化的同时，降低了巨噬细胞内的胆固醇含量，提示 可以通过调节巨噬细胞胆固醇代谢来抑制泡沫细胞的形成。为了解 调节巨噬细胞胆固醇代谢的机制，本研究结合分子对接结果，从基因和蛋白层面进行了研究，实验结果表明，中、高剂量（、）明显下调了清道夫受体 在巨噬细胞中的基因和蛋白表达；对另一个清道夫受体 仅基因层面明显下调其表达，蛋白层面对其调控不明显，基因与蛋白结果不一致，推测 在翻译转录过程中受到干扰，从而导致其表达结果有差异。广泛存在于人单核细胞中 是参与调控胆固醇外排受体 表达的重要核受体之一 。研究结果发现，低、中剂量（、）均不调控 和 在巨噬细胞中的基因表达，但下调了蛋白表达，基因与蛋白结果不一致，推测 和 在翻译转录过程中受到干扰，从而导致其表达结果有差异。高剂量（）明显升高了 和 在巨噬细胞中的基因和蛋白表达，推测 高剂量促进胆固醇排出相关蛋白 和 的表达，基因与蛋白结果一致，提示 不仅可以抑制胆固醇的吸收，高剂量组还可以促进胆固醇的排出。为明确 对胆固醇吸收抑制的影响，本研究采用高脂饮食诱导的 小鼠 模型来研究 对斑块内 和 的影响。染色结果发现，高脂饮食诱导 周的 小鼠，与正常组相比较，模型组主动脉根部出现了明显的泡沫细胞堆积及斑块，提示 小鼠 模型构建成功；给予 中、高剂量（、）治疗后的小鼠主动脉根部泡沫细胞以及斑块明显减少，提示 有较好的抗 作用。现代药理研究表明，可激活巨噬细胞 和 受体的表达，刺激对 的摄取来促进泡沫细胞 的 形 成 。本 实 验 检 测 小 鼠 血 清 中 的 含量水平后，发现给予 中、高剂量（、）治疗后的小鼠 含量水平明显下降，提示 可通过调节胆固醇吸收发挥抗 作用。进一步对小鼠主动脉根部进行免疫荧光染色，发现 呈剂量依赖性明显下调了清道夫受体 和 表达水平，提示 可通过抑制胆固醇吸收，发挥抗 作用。综上所述，能够通过抑制巨噬细胞胆固醇吸收，同时又促进巨噬细胞胆固醇排出来调节胆固醇代谢，从而抑制巨噬细胞泡沫化，减少 斑块形成。参考文献：，：，：，：（），（）：，（）：陈一燕，陈崇宏柯里拉京对叔丁基过氧化氢损伤 细胞的保护作用 中药药理与临床，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：刘韬，吴希军，朱万芸，等 对家兔动脉粥样硬化斑块及 损伤的血管内皮细胞 表达的影响 昆明医科大学学报，（）：，（）：，：孟达，邓欣，饶高雄，等 余甘子总酚对 巨噬细胞源泡沫细胞胆固醇代谢的影响研究 中药药理与临床，（）：中国药理学通报 ；（），（）：尹可欢，罗晓敏，丁翼，等余甘子及其活性成分肝保护作用及机制的研究进展 中草药，（）：，（）：王洋，姜允嘉，成钟，等 腺苷酸基琥珀酸活化 抑制肝细胞内脂质蓄积的作用机制 中国医药生物技术，（）：，（），（）：，：，（）：杨安宁，王磊，周龙霞，等 、甲基化在 致 单核源性泡沫细胞胆固醇流出中作用研究 中国药理学通报，（）：，（）：，（）：王寅州分析他汀类药与其他药物联用时所致不良反应的特点及合理用药措施 中国医药指南，（）：，（）：唐尚书，唐朝克 调控与动脉粥样硬化 生理科学进展，（）：，（）：李轶男，裴汉军氧化三甲胺促进动脉粥样硬化的研究进展 心血管病学进展，（）：，（）：，（，；，）：（）（），（），（），（），（，），（，），：；中国药理学通报 ；（）