精子DNA碎片率与男性不育症患者的年龄、精液分析参数相关性研究.pdf

.1578生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.10.021临床实践精子DNA碎片率与男性不育症患者的年龄、精液分析参数相关性研究张永涛，琚保军2*，李霄，姚均超，李鲁豫，马苗苗1（河南中医药大学1.第一临床医学院；2.第一附属医院男科，郑州450 0 0 0）【摘要】目的分析男性不育症患者精子DNA碎片率(DFI)与年龄、精液分析相关参数的相关性。方法回顾性分析2 0 2 1年11月至2 0 2 2 年6 月至河南中医药大学第一附属医院男科门诊就诊的153例男性不育症患者的临床资料，根据患者精液常规检测结果分为两组：前向运动（PR)精子率为0.9 8%32.0 0%或精子浓度 40 10%/ml,其余精液参数指标正常者为少弱精子症组（n=74），精液各项参数指标均正常的为精液参数正常组（n=79）；同时，根据不同的DFI值分成3个亚组：DFI30%组、15%DFI30%组、DFI15%组，比较各组间精液检测指标；采用Spearman相关性分析，分析精子DFI与年龄、精子浓度、总精子数、PR精子率和精子总活力等各项指标的相关性。结果少弱精子症组精子浓度、精子总数、精子总活力、PR精子率均显著低于精液参数正常组（P0.05），而DFI值显著高于精液参数正常组（P0.05），且精子DFI15%的比例显著低于精液参数正常组（32.43%vs.65.82%，P 0.0 5）。与DFI30%组比较，DFI15%组精子浓度显著升高（P0.01）。Sp e a r m a n 相关性分析结果显示，纳人不育症患者的精子DFI与年龄（r=0.244,P=0.002）、精液量（r=0.164，P=0.042）呈正相关；精子DFI与精子浓度（r=0.254，P=0.0 0 2）、精子总数（r=0.169，P=0.0 37）、PR精子率（r=0.564，P0.001)、精子总活力（r=一0.58 5,P0.001)均呈成负相关。结论精子DFI能通过揭示DNA结构的完整性进一步研究精液参数正常时不育症患者的微观因素，精子DFI联合精液常规检测能更全面地反映出男性的生殖能力。【关键词】男性不育症；精子DNA碎片率；年龄；精液分析参数(J Reprod Med 2023,32(10):1578-1582)【中图分类号】R698+.2WHO定义男性不育症为夫妇同居1年以上，有正常性生活且未采取任何避孕措施，由于男方因素导致女法无法受孕 1。男性不育症的病因复杂，往往是多种病因引起。精液质量检测因其便捷的特点成为评估男性生育能力的基础检查 2 ，然而仅仅依靠精液常规检测参数并不能全面评估男性生育功能,约15%的男性不育症患者精液质量检测结果正常 3。考虑到精液质量检测指标只能观察到精子形态的完整性，并不能揭示精子所携带遗传物质的完整性，因此需要借助另一种实验室检查进一步评估精子中遗传物质的完整性。精子DNA碎片率(DFI)是反应男性生育能力的一个更有效的指标，它能从微观层面上揭示精子上的形态和功能的改变 2 。因为DNA的完整性对男性生殖有重要作用，精子DNA损伤不仅会影响精液质量，还能影响精子功能。本研究通过观察153例男性不育症患者DFI与年龄、精液量、前向运动(PR)精子、精子总活力PR精子十非前向运动（NP精子、精子浓度、精子【文献标识码】A总数之间的相关性，分析DFI是否能反映男性的生殖能力。一、研究资料与方法1研究对象：回顾性分析2 0 2 1年11月至2 0 2 2年6 月至河南中医药大学第一附属医院男科门诊就诊的153例男性不育症患者的临床资料。纳人标准：符合男性不育症诊断标准，年龄为2151岁；无遗传病史及家族史，有正常的性生活，无不良生活习惯；体格检查（阴茎、阴囊、睾丸、附睾、精索静脉）未见异常。排除标准：梗阻性无精子症；因女方因素（输卵管梗阻、排卵功能障碍、炎症等)导致的不孕；有阴茎发育异常、睾丸缺如、精索静脉曲张等发育异常的情况；伴有家族遗传病或染色体核型异常者。【收稿日期】2023-03-25；【修回日期】2 0 2 3-0 7-0 6【基金项目】河南省重点研发与推广专项（2 12 10 2 3110 8 5）【作者简介】张永涛，男，河南商丘人，硕士研究生，中医外科学男科专业：（*通讯作者，Email:）生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期本研究共纳人153例患者。根据患者精液常规检测结果分为两组：PR精子率为0.9 8%32.0 0%或精子浓度 40 X10个/ml,其余精液参数指标正常的为少弱精子症组（n=74)；精液各项参数指标均正常的为精液参数正常组（n=79)。2.仪器与试剂：赛司（SAS)精子分析系统（北京赛司医疗科技）；CYTEK流式细胞仪及基于流式细胞技术的精子染色质结构分析系统（SCSA；无锡厦泰生物科技）；离心机（安徽中科中佳）、恒温水浴箱、电子秤、量杯、pH试纸、移液枪；SAS精子检测板（无锡厦泰生物科技）；吖啶橙染色液（国为生物科技）。3.标本收集及常规质量检测：禁欲2 7 d，以手淫的方式将精液收集到无菌量杯内，之后将标本置于37 恒温水浴箱，并记录液化时间 4。液化后使用SAS精子分析系统检测精子总活力、PR、精子浓度、精子总数等精液质量指标 5。4.DFI检测：取精液标本用吖啶橙染色液联合流式细胞仪（无锡厦泰生物科技）检测精子DFI及精子成熟染色质含量。将液化后的精液5l移入样本管中,加吖啶橙染色液试剂盒中的A液稀释至50l,终浓度为12 10/ml的精子细胞；再加B液10 0 l,准确计时30 s后加人C液30 0 l,制备完成后混匀，上机检测。精子核经过酸处理液处理后，组别例数少弱精子症74精液参数正常79组别例数少弱精子症74精液参数正常79注：与精液参数正常组比较，P0.05。2.不同DFI组间精液检测指标比较：将153例患者根据不同DFI值分成3个亚组:DFI15%组（n=76)、15%DFI30%组(n=50)和DFI30%组(n=27)。DF15%组的精子总活力和PR精子显著高于15%DFI30%组和 DFI30%组(P0.01);DFI15%组的精子浓度、精子总数显著高于DFI30%组(P0.01)(表 2)。:1579再经吖啶橙染色，异常精子核染色质成单链与染料吖啶橙结合成橙黄色或红色荧光；正常精子核染色质为双链与吖啶橙结合成绿色荧光。5.统计学方法：采用SPSS25.0软件进行数据的统计学分析。计量资料采用（土s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%)进行表示，组间比较采用单因素方差分析和两两比较法（Bonferroni）；相关性分析采用Pearson相关系数法，并采用显著性检验，相关系数（r)为0.30 0.50 时判为弱度相关，r为0.50 0.7 0 时判为中度相关，r为超过0.7 0时判为高度相关。显著性检验水准为=0.05。P0.05）；少弱精子症组精子浓度、精子总数、精子总活力和PR精子率均显著低于精液参数正常组（P0.05），而DFI显著高于精液参数正常组（P0.05);其中，少弱精子症组 DFI15%比例更低、DFI30%比例更高(P0.05)(表1)。表1不同精液参数组间精液检测指标比较（士s)，%年龄精子浓度/（X10%/ml）31.585.5749.1244.34*31.183.9477.31 51.57DFI/%25.6715.51*13.779.59精子总数/（10）186.15165.30*276.26184.64DFI15%15%DFI30%32.43(24/74)*36.49(27/74)65.82(52/79)29.11(23/79)3精子DFI与年龄、精液检测指标的相关性分析:Spearman相关性分析结果显示，精子DFI与年龄(r=0.244,P=0.002)、精液量（r=0.164,P=0.042)呈正相关；精子DFI与精子浓度（r=一0.2 54,P=0.002）、精子总数（r=0.169,P=0.037）、PR精子率(r=0.564,P0.001）、精子总活力（r=0.585，P0.001)均呈成负相关(图1)。精子总活力/%PR 精子率/%29.6212.23*20.438.27*60.8712.5447.1210.74DFI值占比DFI30%31.08(23/74)*5.06(4/79)1580组别例数DFI15%7630.763.8415%DFI30%2733.305.99注：与DFI15%组比较，P0.01；与15%DFI30%组比较，P0.01。A605040年30200.00C300.00250.00200.00100.0050.000.000.00E605030200.00生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期表2 不同DFI组间精液检测指标比较（士s)精子浓度/精子总数/年龄精液量/ml3.661.3572.4650.254.101.6763.2953.994.501.5539.6532.62*B10.0r=0.244,P=0.0028.06.0F4.0y=29.75+0.08x2.0：020.0040.00DFI/%r=0.254,P=0.002=81.34+0.9x20.0040.00DFI/%r=-0.564,P0.001V=47.1-0.66x。20.0040.00DFI/%图1DFI与年龄、精液检测指标相关性分析图精子总活力/%PR精子率/%(X10%/ml)(X10)247.00167.46246.74216.56166.30126.87*60.000.00D1 000.00800.00600.00400.00200.000.0060.000.00F100.0080.00%/60.0040.0020.000.0060.000.0055.1218.2542.3415.05*25.7115.59*#r=0.164,P=0.042：y=3.6+0.02x20.0040.00DFI/%r=-0.169,P=0.037=2.75E-2.17x20.0040.00DFI/%r=-0.585,P0.001y=61.94-0.83x20.0040.00DFI/%41.8215.6231.2512.42*18.27 11.84*#60.0060.0060.00生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期三、讨论近几年的研究发现，男性精液质量呈现逐年下降的趋势，而且男性不育的发生率逐年上升。男性不育症是男科中一种较为常见的疾病,其致病原因复杂、影响因素较多,且临床上大多数患者以精液质量异常为主,其他症状不显。因此，通过了解精液中精子的浓度、活力等指标的精液常规检查，可以初步判断男性的生殖能力。但男性精液质量会受到多种因素的影响，仅仅依靠精液常规检查可能会影响到男性不育症的诊断。焦瑞宝等 门研究发现，选取81例不育症患者的精液分析，发现有36 例患者精液浓度与活力结果均正常，约占44.4%。王阳等 8 研究发现，548 例男性不育症患者精液检测结果正常的占 4.9 3%。目前研究发现，精子DNA链的完整程度对于评价精子质量、提高受精成功率和选取辅助生殖技术等都具有非常重要的作用。精子DFI是用来评价精子DNA完整性的主要指标之一。DNA损伤主要有单链断裂（SSB）和双链断裂（DSB)两种形式，但精子DNA损伤的机制尚未完全明确，现认为男性精子DNA损伤的机制主要分成内源性因素与外源性因素。外源性因素包括环境污染和不健康的生活方式，如长期吸烟、喝酒、熬夜和生殖系统病变(感染、精索静脉曲张、睾丸扭转等)9。内源性因素可分成：（1)在生精过程中发生细胞凋亡 10 ；（2 在包装过程中染色质发生异常 11；（3)在运输过程中受到氧自由基的影响 12 本研究结果显示，少弱精子症组精子浓度、精子总数、精子总活力、PR均显著低于精液参数正常组(P0.05),而DFI显著高于精液参数正常组（P0.05）。这说明DFI升高在一定程度上表现为精子质量下降，具体表现为精子浓度、精子总数、精子总活力、PR等精液指标下降。因此，可以从宏观精液指标（精子浓度、精子总数、精子总活力、PR精子率等指标)上初步评估男性生育能力，还能从DFI上揭示精子DNA的完整性，评估后期胚胎发育及是否出现反复性流产等情况。本研究发现，精液参数正常组精子DFI15%所占比例显著高于少弱精子症组（P0.05），而DFI30%所占比例显著低于少弱精子症组（P0.05），说明精子质量下降可能与DFI升高有关。既往研究发现，不管是外源性因素还是内源性因素均可导致 DFI升高 9-12 ,因此要注意生活方式的改变，如避免吸烟、喝酒、长期熬夜、:1581.久坐等不良生活习惯等。本研究根据不同DFI值将纳人患者分成3个亚组，比较各亚组间精液检测指标发现：与DFI15%组比较,15%DFI30%组和DFI30%组的总活力和PR精子率显著降低（P0.01)；与15%DFI30%组比较,DFI30%组的总活力和PR精子显著降低（P0.01）；与DFI15%组比较,DFI30%组精子浓度、精子总数均显著降低（P 0.0 5）。此结果与部分研究 13-14 结果不一致，这可能与其研究对象和方法不同有关。本研究发现，不育症患者精子DFI与患者年龄呈正相关，这与以往部分研究 14I结果相似。这应当与精子DFI随着年龄的增长而升高有关,DNA损伤修复机制并不能完全修复所有损伤，而且人体自我修复机制的能力会随着年龄的增长而不断下降 15,未能修复的DNA损伤一旦存留下来还会影响胚胎质量。本研究发现，精子DFI与精子浓度、精子总数、PR精子率、总活力等精液检测指标均呈负相关，此结果与曾兰等 16 1的研究结果相类似，提示精子DFI具有较好的重复性，可作为诊断男性不育症的指标 17。精子细胞凋亡异常、氧化应激反应、染色质异常均会导致精子DNA损伤，这些因素也会影响精子浓度、精子总数、精子形态,因此在诊断男性不育症患者时有必要关注患者的精子DFI。不育症患者的精子DFI变化趋势与精液常规检测指标的变化相符，说明精子DFI与精子形态直接相关，也表明精子DFI与精液常规检测指标（精子总数、精子浓度、精子总活力、PR精子率)存在着密切联系。本研究中精子DFI与精液检测指标中PR精子率、精子总活力呈负相关，说明精子DNA损伤可能是少弱精子症的主要因素之一,也可能是男性不育症的主要因素之一。在测定方法上，本研究选择了吖啶橙染色联合流式细胞仪的方法，避免了技术人员在颜色的判断上受到主观因素的影响。但精子DFI测定目前尚未制定统一规范,Evenson 等 18 1以生育率为指标将精子DFI阈值设定在2 5%30%。本研究按照DFI值分成3个亚组，分组依据与既往研究 19 相一致。为了进一步探究精子DFI与精液常规指标的趋势相近”这一推测，本研究将少弱精子症组和精液参数正常组中的DFI值分别计算比例，发现少弱精子症组中DFI15%占比为32.43%（2 4/7 4），显著.1582低于精液参数正常组中DFI25%时会导致临床妊娠率显著降低(P0.05)。因此,对于不育症患者检查精子DFI不仅可以在DNA结构完整性上揭示男性不育症的微观因素，还可以对妊娠结局做出预测。综上所述，精子DFI与精子浓度、精子总数、PR精子率、精子总活力等精液检测指标直接相关；此外,即使精液指标表现为正常的不育症患者，精子DFI也会出现变化，因此在微观层面上更好地解释了精液常规检测指标正常者中不育症的影响因素；精子DFI也能为妊娠结局做出预测。结合精液常规检测和其他精子检测指标，根据患者情况采取精子DFI检测可更客观、更全面地反映男性的生殖能力。但本研究样本量不足，时间跨度过短，数据分析方法不足，还需加大样本量、拉长时间跨度、深入分析数据，并进行不同地域之间的比较。【参考 文献】1潘伯臣，孙莹璞，孙海翔，等。弱精子症病因及临床诊疗专家共识 生殖医学杂志，2 0 2 332：157-16 9.2倪吴花，AshokAgarwal,孙莹璞，等精子DNA碎片检测的临床专家共识J生殖医学杂志，2 0 2 3,32：17 0-18 03Lu WH,Gu YQ.Insights into semen analysis:a Chineseperspective on the fifth edition of the WHO laboratorymanual for the examination and processing of human semenJJ.A s i a n JA n d r o l,2 0 10,12:6 0 5-6 0 6.4 卢文红，蔡靖，孙莹璞，等精液分析质量控制方法专家共识J 生殖医学杂志，2 0 2 3,32:1-8.5 Bjorndahl L,Kirkman Brown J;other Editorial BoardMembers of the WHO Laboratory Manual for theExamination and Processing of Human Semen.The sixthedition of the WHO laboratory manual for the examinationand processing of human semen:ensuring quality and生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期standardization in basic examination of human ejaculatesJ.Fertil Steril,2022,117:246-251.6 黄君艳，庞敏，仲远，等。宿迁地区2 0 12 2 0 14年10 6 8 例育龄期男性精液质量和不孕不育的关系研究 门中国性科学，2016,25:80-82.7焦瑞宝，唐吉斌，冯恒孝，等，不育患者精子DNA完整性与精液参数关系的临床研究 J安徽医学，2 0 13，34：8 0 4-8 0 6.8王阳，冯京全，柏明见548 例男性不育患者精液检测结果分析.中国医学装备，2 0 14，11：159-16 0.9 Yang H,Li G,Jin H,et al.The effect of sperm DNAfragmentation index on assisted reproductive technologyoutcomes and its relationship with semen parameters andlifestyleJ.Transl Androl Urol,2019,8:356-365.10吴婷男性不育症精液检验与血清中抗精子抗体的相关性研究J.九江学院学报（自然科学版），2 0 19，34：9 3-9 5.11Qiu Y,Yang H,Li C,et al.Progress in research on spermDNA fragmentationLJJ.Med Sci Monit,2020,26:e918746.12Rashki Ghaleno L,Alizadeh A,Drevet JR,et al.Oxidation ofsperm DNA and male infertilityJJ.Antioxidants(Basel),2021,10:97.13熊旭升，周竹君，李雪燕，等.男性精子DNA碎片指数与精液参数的相关性分析 J。中国性科学，2 0 2 1，30：17-2 1.14周雪，周艳芬，孙国海，等，男性精子DNA碎片指数与精液常规参数的相关性研究 J中国性科学，2 0 2 1，30：6-10.15朱家红，高洋，付涛，等精子DNA损伤对胚胎卵裂模式及胚胎发育的影响 J生殖医学杂志，2 0 2 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