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CDK2的研究进展摘要：CDK，即周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases)是与细胞周期进程相对应的一套Ser/Thr激酶系统。各种CDK沿细胞周期时相交替活化，磷酸化相应底物，使细胞周期事件有条不紊地进行下去。对CDK2蛋白结构的认识，特别是一些抑制剂与CDK2复合物的晶体学认识，极大的推动了小分子抑制剂的设计和开发。通过抑制剂对CDK2的作用，可以有效的抑制肿瘤等细胞的生长，从而达到治疗疾病的作用。关键词：CDK2 ,抑制剂，疾病治疗 CDK2 是完成 G1 期和进入S期一个非常关键的细胞周期蛋白依赖性激酶，CDK2 与 cyclinE 结合并活化，维持 G1后期 pRb 的磷酸化，保证细胞顺利 通过 G1 期并进入 S 期。在S 期初期，CDK2 与 cyclinA 结合使 E2F 转录因子钝化，而 E2F 的钝化是 S 期完成的前提条件，E2F活性的持续将导致细胞凋亡。因此，选择性地抑制 CDK2/cylin A 可能导致 E2F 浓度的升高，进而导致细胞S期停滞或凋亡。 1. CDK2 的蛋白结构 与大多数的蛋白激酶类似， CDK2 蛋白折叠呈 双叶状。体积较小的 N-末端区主要由 -折叠构 成，包括5 个反平行结构的 -长链和一个 C-螺旋。 体积较大的 C-末端区则主要由 -螺旋构成，并通过 柔性铰链与 N-末端相连接。而 ATP 的结合区就位 于这两个“叶状”之间的深裂，构成该深裂的螺旋环 是 CDK2 结构的独特之处，它决定着 ATP 或者蛋白 结合底物与 CDK2 的特异性结合，在细胞调控机制 中扮演着关键角色。图1. CDK2的3D图片 2. CDK2的作用机制 细胞周期蛋白依赖激酶2(Cyclin-dependent kinase 2, CDK2)属于CDK丝氨酸/苏氨酸激酶家族,是细胞G1/S期转换过程中的重要调控因子。CDK2可分别结合于Cyclin E和Cyclin A,随后CAK磷酸化其苏氨酸160位(Thr-160)而被激活,通过磷酸化众多底物而促进G1/S期的进程。然而除在细胞周期中发挥重要作用外,近年来CDK2也被发现在调控细胞自我更新和分化中起到关键作用。一些文献报道CDK2活性或表达可促进鼠神经母细胞瘤细胞、胚胎干细胞、小鼠中枢神经系统祖细胞和成年小鼠的髓鞘等的分化1。 CDK2蛋白水平下降所引起的全反式视黄酸(ATRA)诱导AML(acute myeloid leukemia)细胞分化作用的增加可能是通过促进ATRA对分化相关转录因子网络的调控而实现的。CDK2可作为UPS(ubiquitin-proteasome system)途径的底物而被降解,ATRA在诱导AML细胞分化过程中促进CDK2通过UPS途径发生降解。CDK2的降解能够促进ATRA诱导AML细胞分化的作用,且这种促进作用并非由促进细胞退出增殖周期所介导,而是通过直接调控分化相关转录因子的信号网络而实现4。CDK2在AML细胞分化过程中的全新调控方式和功能的研究,为进一步完善和开发新型的白血病分化诱导治疗策略提供了理论基础。图2.CDK2与ATP的结合位点3. CDK2 激活前后结合位点的变化 CDK2 单体与 cyclinA， cyclinE 结合或者 Thr160 的磷酸化而被激活， CDK2 激活后会引起空间多构 象的变化2，包括关键催化残基的再定位; 与 cyclinA 结合导致 C-螺旋( 包括保守的 PSTAIRE 序列) 朝向 ATP 结合区位移; 磷酸化作用使 CDK2 结构发 生再定向并产生多个肽段-底物结合位点等变化。单体 CDK2 与 cyclinA 结合并磷酸化后，激酶活 性部位的关键结构要素会发生重排从而使 CDK2 完 全被激活。对比 5-磺酸-靛玉红与磷酸-CDK2cyclin A、单体 CDK2 形成复合物的结构可以发现， 激活后的 CDK2 的 N-末端相对于 C-末端会发生旋 转，进而导致活性部位的深裂发生微小的拓宽，但其 腺嘌呤口袋区的结合位点仍是保守的。此外， PSTAIRE 螺旋和 Glu51 以及随后氨基酸残基与 ATP 磷酸化的再重组等都将导致磷酸化结合位点的改 变，尤其是 Lys33 的迁移会使 ATP 深裂加深并形成 其他的空腔。 Kontopidis 等4通过描述 CDK2 非活化态与活 化态构象的不同以及非活化态的构象特征，分别对 6 种 CDK2 抑制剂在 CDK2 单体( 未活化) 和 cyclinA/CDK2 复合物( 被激活) 中的 X 晶体衍射进行了 分析，发现二者结构中 E51， V64， D145， L148 等残基 的侧链以及 Gly 环上 1015 残基上的原子的位置发 生了改变。此外，起催化作用的赖氨酸、 K33 在二者 结构中呈现不同的构象，并由此依次引发 CDK2 与 cyclinA 结合并被活化、 PSTAIRE 的螺旋化、 E51 移 位并占据未活化 CDK2 的 L148 位等变化。CDK2 的 ATP 结合深裂中残基变化最大的是 D145， CDK2 被 cyclinA 激活后它发生了 12 的位移。由此，在 一定程度上证实 CDK2 单体的抑制剂配合物不完全 反映 CDK2 激活态时的构象。同时，这些抑制剂与 单体 CDK2 和 CDK2/cyclinA 的结合能差别进一步 揭示了结合模式不同所引起的蛋白构象变化，晶体 结构的分子间结合能证明 CDK2-抑制剂结合是否可 以完全反映实验所获得的抑制常数，但 CDK2/cyclinA 与抑制剂所形成配合物的结合能却能准确地与 体外试验数据对应。这些说明，仅以单体 CDK2 作为模板设计其抑制剂可能会影响抑制剂对活化态的 CDK2 的靶向作用以及所获得生化数据的构效关系 分析。 4. CDK2 对生殖细胞的影响 生殖细胞高度复杂的分化过程即是精子发生的过程,这个过程包括精原细胞增殖、分化、精母细胞形成、精子成熟等阶段,其中减数分裂期是生殖细胞特有的一个特殊过程,它的完成主要取决于精母细胞的结构变化及参与减数分裂的相关生物大分子的重要事件,包括同源染色体的识别、联会、配对、重组交换和交叉。减数分裂联会重组的启动、发生、完成的分子机制仍是目前面临重要科学议题和难题,众所周知这些分子事件的异常或紊乱都可能引起减数分裂停滞、精子发生异常最后则导致不育。在真核生物减数分裂时期端粒簇是一个广泛存在的现象。然而,特别在哺乳动物染色体配对、重组、分离的过程中,如何调控端粒簇的形成和解聚的分子机制仍然不清楚。研究发现CDK2(Cyclin-dependent kinase2),特别是p39CDK2,作为潜在的减数分裂特异性连接子优先与SUN1相互作用调控端粒簇的形成,但CDK2向它的活性形式磷酸化CDK2(phosphorylation-CDK2, p-CDK2)的转化调节了粗线期向双线期端粒簇的解聚3。进一步的研究结果表明,在减数分裂时期发现CDK2在联会复合体(SCP3)末端消失形成环状染色体且弥散分布在核内。从同源染色体重组到解联会,包含有CDK2/MLH1共定位的时空表达模式与p-CDK2/MLH1表达模式与此时期变化进程相匹配。这些结果表明CDK2及其p-CDK2活性形式的转化对调控减数分裂进程发挥着关键的功能。5. CDK2对肿瘤细胞的抑制作用 CDK2作为一种细胞周期蛋白依赖性激酶，在与特定的细胞周期蛋白Cyclins结合后被激活，然后使下游一些重要周期蛋白磷酸化，从而调控着细胞周期的运行。临床研究发现CDK2的过量表达会导致肿瘤的发生。 微小RNA（miRNA）在肿瘤发生中作为肿瘤抑制基因或癌基因发挥关键作用。 在正常细胞中，miR-5582-5p诱导癌细胞中的凋亡和细胞周期停滞。 GAB1，SHC1和CDK2被鉴定为miR-5582-5p的直接靶标。 CDK2通过影响miR-5582-5p的表达从而能够使细胞凋亡或细胞周期停滞。 miR-5582-5p的表达在肿瘤组织中比在结肠直肠癌患者的相邻正常组织中低，而靶蛋白的表达显示与miR-5582-5p的模式相反的模式。 肿瘤内注射miR-5582-5p模拟物或miR-5582-5p在肿瘤细胞中的诱导表达抑制HCT116异种移植物中的肿瘤生长。在胃癌的研究中，采用瞬时转染的方法将各个质粒转染入胃癌细胞株MGC-803内,分别用Neomycin和Puromycin筛选出过表达及沉默表达BAG3基因的稳定转染胃癌细胞株。通过CCK8和平板克隆形成实验检测细胞增殖,通过流式细胞仪及WB检测c-PARP分析细胞凋亡,通过荧光素酶实验检测FOXO1转录活性的改变,通过细胞免疫荧光及核质分离检测FOXO1的细胞内定位变化。结果表明BAG3在胃癌组织、癌旁组织中均有表达,其主要定位在细胞质。与癌旁组织相比,BAG3在胃癌组织中的表达明显下调,且BAG3的表达量与Cyclin A/CDK2的表达量呈负性相关。Cyclin A/CDK2可以磷酸化BAG3的S291位点。BAG3 S291位点磷酸化导致其蛋白质稳定性降低,即蛋白质的半衰期变短。胃癌细胞中BAG3发挥着抑制细胞增殖的作用,若S291位点持续磷酸化后抑制细胞增殖更为显著。过表达BAG3的胃癌细胞株对于奥沙利铂诱发的凋亡更为敏感。BAG3介导FOXO1入核并促进其靶基因P27,Bim的转录活性。因此，BAG3在胃癌组织中的表达明显下调,Cyclin A/CDK2的表达量明显上调。Cyclin A/CDK2通过磷酸化BAG3的S291位点使其蛋白质的半衰期缩短26。结果表明CDK2具有新型肿瘤抑制功能及其对肿瘤控制的潜在适用性。6. 展望 近年来，对于肿瘤等疾病的研究日新月异，取得了巨大的进展。相对于传统发治疗方法，通过抑制细胞的生长分化来达到治疗目的的方法能显现出巨大的优势。在这一过程中CDK2发挥着很重要的作用。通过抑制CDK2的表达能够很明显的抑制细胞的生长，使细胞在进行分裂时停留在G1期，从而阻断细胞增殖。在未来的研究中，寻找能有效抑制CDK2等的抑制剂将是一项非常重要的一件事情。参考文献：1 KNTOPIDIS G，MCINNES C，PANDALANENI SR，et al Differential binding of inhibitors to active and inactive CDK2 provides insights for drug designJ Chem Biol，2006，13( 2) : 201 2112 呼格吉乐,张军力,段美庆,王俊瑞,高乃康. CDK2干扰RNA对人脑胶质瘤细胞质蛋白质组的影响 J. 中华临床医师杂志(电子版). 2012 (14) 3 GALONS H，OUMATA N，MEIJER L Cyclin-dependent kinase inhibitors: a survey of recent patent literatureJ Expert Opin Ther Pat，2010，20( 3) :377 404 4 ECHALIER A，ENDICOTT JA，NOBEL MEM Recent developments in cyclin-dependent kinase biochemical and structural studies J Biochim Biophys Acta， 2010， 1804( 3) : 511 519 5黄宪章,张战锋,谢诗园,李朝霞,李林,陈炜烨,何敏,庄俊华. pPICZA-CDK2重组质粒的构建及表达 J. 实用医学杂志. 2011 (16) 6Wenjing Liu,Lu Wang,Weidong Zhao,Gendi Song,Rener Xu,Guishuan Wang,Fei Wang,Wenqing Li,Jie Lian,Hui Tian,Xiaorong Wang,Fei Sun. Phosphorylation of CDK2 at threonine 160 regulates meiotic pachytene and diplotene progression in miceJ 2014,Developmental Biology(1).