检测细胞增殖毒性的原理及注意事项.docx

CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项
一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中具有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可运用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏实验

CCK8的优点：
· 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
· CCK-8法能快速检测；
· CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；
· CCK-8法的反复性优于MTT 法；
· CCK-8法对细胞毒性小；
· CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

CCK8的缺陷：
· 与MTT法相 比，CCK8和XTT的价格比较贵。
· CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：

检测方法
MTT法
XTT法
WST-1法
CCK8法
甲臢产物的水溶性
差（需加有机溶剂溶解）
好
好
好
产品性状
粉末
2瓶溶液
溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
现配现用
即开即用
即开即用
检测灵敏度
高
很高
很高
高
检测时间
较长
较短
较短
最短
检测波长
560-600nm
420-480nm
420-480nm
430-490nm
细胞毒性
高，细胞形态完全消失
很低，细胞形态不变
很低，细胞形态不变
很低，细胞形态不变
试剂稳定性
一般
较差
一般
很好
批量样品检测
可以
非常适合
非常适合
非常适合
便捷限度
一般
便捷
便捷
非常便捷

二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法

实验一：细胞增殖分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个反复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，假如不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有也许因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不同样。假如显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

实验二：细胞毒性分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个反复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，假如不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质
5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有也许因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不同样。假如显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

注：

· 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
· 假如待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸取即可。

三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项

· 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。
· 酚红和血清对CCK8法的检测不会导致干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。
· CCK-8在0-5℃下可以保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。
· 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增长误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
· 在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸取，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
· 金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会克制5%、15%、90%的显色反映，使灵敏度降级。假如终浓度是10 mM的话，将会100%克制。
· 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增长细胞数量和延长培养时间。