油樟dna提取的研究--毕业论文设计.doc

宜宾学院YIBIN UNIVERSITY 本科毕业论文（设计）毕业论文题 目： 油樟DNA提取的研究 专 业： 生 物 科 学 学生姓名： 学生学号： 030601023 系 级 班： 生物工程03级1班 指导教师： 职称: 教 授 宜宾学院教务处制 摘要油樟是樟科樟属植物，本课题主要研究油樟根茎叶DNA的提取方法以及对根茎叶DNA提取效果进行对比分析。油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物,针对这一情况本研究在常规CTAB法的基础上做了进一步改进，成功提取出了高质量DNA。做的改进主要有：在CTAB提取缓冲液中加入2gPVP以除去酚类杂质；将DNA样品溶于TE缓冲液中保存时在样品中加入3lRNaseA，以除去RNA。用改进CTAB法提取的DNA得率和纯度都较高。用改进CTAB法提取的油樟根DNA得率小于油樟茎DNA的得率小于油樟叶DNA得率，由于植物各组织器官的基因组DNA是相同的，因此宜用更易研磨成细粉的油樟嫩叶来提取油樟DNA，用做科研和教学。关键词：油樟；DNA；CTAB（十二烷基三甲基溴化铵）；电泳；光吸收AbstractCinnamomum longepaniculatum belongs to laurel family and Lauraceae species. The topics studied mainly the method of extracting DNA and compared the DNA extracting methods from roots, branches of Cinnamomum longepaniculatum . Cells of Cinnamomum longepaniculatum contain a large number of polysaccharides, polyphenols, tannins, and other secondary metabolites. Based on conventional CTAB method, a serial of improvements were carried out and high-quality DNA was successfully obtained. The main improvements are: 2g PVP was added into CTAB extraction buffer to remove impurities phenols; 3l RNaseA into the samples when DNA samples preserved in TE buffer to remove RNA. Improved CTAB extraction of DNA yield and purity was higher. The DNA yield using improved CTAB extraction was roots stems leaves. Because genomic DNA is same, it is easier to extract DNA from leaves of Cinnamomum longepaniculatum for research.Keywords: Cinnamomum longepaniculatum; DNA; CTAB method of DNA; electrophoresis; absorbing value of light目 录摘要IAbstractII第1章 绪论1第2章 油樟根茎叶DNA的提取方法31.材料、药品、仪器31.1 材料31.2主要试剂溶液31.3 主要仪器设备42.实验方法和步骤42.1 常规方法的提取42.2改良CTAB法52.3 油樟根、茎、叶DNA提取的比较方法63.结果及分析63.1 0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析63.2 紫外光谱分析84.讨论104.1 CTAB法的基本原理104.2 几种主要试剂的作用与对比104.3 方法的探索及改进114.4 注意要点124.5 实验过程中遇到的问题及对策125.总结135.1135.2135.313参考文献14致谢15文献综述1619第1章 绪论图1-1油樟如图1-1油樟Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)是樟科樟属植物。高大乔木，叶互生，卵形、椭圆形或短圆形，先端长渐尖或急尖，基部楔形至近圆形，长5.5-12cm，宽3-6 cm，幼时即无毛，腹面暗绿色，有光泽，背面粉绿色，通常羽状脉，中脉两面凸起，侧脉约5-6对，两面凸起，脉腋腹面泡状隆起，背面有小窝孔，孔内有短毛，横脉和细脉背面较明显，叶柄长2-3 cm，无毛。圆锥花序腋生，纤细，疏散，通常长10 cm以上，无毛，花梗长1-3 cm，无毛；花被长约2 mm，外侧无毛，内侧密被毛，裂片卵形，长1.5 mm，花后花被上部自花被管的顶端处整齐环裂脱落；雄蕊长约1 mm，被柔毛，第3轮的花丝基部有1对具短柄状的腺体，退化雄蕊长约0.5 mm，被毛，近心形；雌蕊无毛，子房近圆球形状，花柱较子房为长，柱头小，盘状。果阔倒卵状，顶端平或微凹，歪斜，稍扁，长9 mm，直径8 mm，果托碟状，全缘，直径约3.5 mm；果梗长4-5 mm，向上增粗。花期4-5月；果期8-9月1。油樟在四川有大量分布，产于叙永、宜宾、屏山、娥眉、雅安、邛崃等地。宜宾是油樟的分布中心。在经历了许多坎坷之后，油樟终于闪现出了它那金子般的光芒。1951年修建成渝铁路时，油樟被成批地砍伐用作枕木；1958年大办钢铁时，油樟竟老嫩不拘，被用作烧泡炭的燃料；1960年生活困难时，为了熬煮樟油，对幸存的樟树进行了掠夺性的采摘。这些事实都导致珍贵的油樟资源招到了大规模的破坏，幸好在1978年十一届三中全会以来，各项林业政策得到了落实，油樟林也逐渐得以恢复。1978年樟油产量增长为356t，比1959年的305 t，增长16.7%。到1985年宜宾县已有油樟林35130亩，采叶油樟树达到369万余株，全县树龄达到100年以上的油樟64株，200年以上的9株。1986年宜宾县被列为四川油樟基地2，由于大力发展油樟，到1995 年，宜宾全县油樟面积由1980 年的0.28 万hm2 发展到0.77 万hm2 ，樟油产量从1980 年的400 多吨 ，增加到1995 年的1200 t ，占全国同类产品产量的75 %，占全省产量的90 %，产品畅销日本、德国、法国、美国等50多个国家和地区，为国家创汇450多万美元3。宜宾县被称为全国保存和发展最好的天然香料油源基地。樟油粗加工的主产品1. 8-桉叶油素，被称为“中国桉叶油”4，1984 年被评为四川省优质产品。1999 年，为适应西部大开发的形势，增加长江上游绿色植被，加大力度保护油樟树这一独特资源，建设全国最大的木本香料油基地，宜宾县又决定到2001 年，用3 年时间，再营造0.30 万hm2 油樟树基地。油樟树具有生长快、材质好，萌发力强、干形通直，树形美观等特点，叶、枝、根、茎、花、果富含芳香油，是提炼天然香料的优良树种，也是目前全国保存和发展最好的天然香料油源。它含有18-桉叶油素、-萜品醇（松香醇）和香穗烯等40多种成分，经过深度加工可以提取多种重要的天然单离原料，是国防、轻工、香料、医药和高级电镀工业的稀有原料5。特别是从中提取的18-桉叶油素物性稳定、芳香纯正，在国际贸易中被称为“中国桉叶油”，在世界各国都属免检产品。为了充分开发利用油樟这一优势资源，国家科委于1996年将其列入了国家 “星火计划”和名特优经济林商品基地建设项目6。宜宾县地处金沙江和岷江下游“金三角”地带，是全国最大的油樟基地，樟油产量占全国的75%，占四川的90%，被中外客商誉为“油樟王国”。大力发展油樟，对农民致富、出口创汇、增加税收、绿化荒山以及维持长江上游的生态环境等都起着十分重要的作用。我们学校已经建立了以油樟为主要研究对象的“西南特色经济植物重点实验室”，为了从分子水平上对其做进一步的研究，本课题开始了初步的尝试，目的是为以后的分子生物学分析打下基础。第2章 油樟根茎叶DNA的提取方法由于DNA分子标记实验以及其他许多分子实验，是从研究生物个体的基因组，脱氧核糖核酸开始的，因此，能否得到高质量的基因组DNA自然成为DNA标记技术关键的一步，只有高质量的DNA，才能够获得理想的DNA条带。油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物。这些次生代谢产物, 不仅能干扰DNA 的提取过程, 影响DNA 的得率, 还能与DNA 发生不可逆的结合(尤其是多酚氧化后产物) , 影响DNA 的质量, 使提取的DNA 样品呈棕褐色, DNA 溶液粘稠, 这种不纯的DNA 既不能被内切酶酶切, 也不能作为PCR 模板, 不能用于常规的分子生物学分析和研究7 。因此, 如何从油樟中取得适于分子遗传分析和鉴定的高纯度基因组DNA 是对其进行分子生物学研究首先要解决的问题。虽然目前国内外针对多种顽拗植物基因组DNA 的提取进行了大量的研究, 提出了许多改进方法, 但这些技术方法只是针对某种或某类植物而言, 不同的顽拗植物所含的次生代谢物种类和含量不同, 因此改进的方法也存在差异, 不能普遍适用。要想得到高质量的DNA，在DNA提取过程中既要防止DNA的降解和变性，又要尽量保持其在生物体内的天然状态。要提取天然的具有生物活性的DNA，必须在温和的条件下，防止过酸、过碱和DNA酶的污染，避免剧烈振动与搅拌8。采用常规CTAB法提取的油樟基因组DNA 质量很差,本研究就以油樟的根、茎、叶为实验材料,探讨提取高质量油樟基因组DNA 的方法。1.材料、药品、仪器1.1 材料采于宜宾县宗场镇孜岩村陆场主承包的油樟林，采取了幼嫩的油樟根、茎、叶，装入1.5mlEppendorf管和5ml离心管，立即置液氮罐中预冷，带回实验室后，保存于-70的冰箱中备用。1.2主要试剂溶液1.2.1 液氮;1.2.2 CTAB提取缓冲液（2）：100mmol/l Tris-Hcl(PH8.0),20mmol/l EDTA,1.4mmol/lNacl,2%(W/V)CTAB,4%(V/V)-巯基醇,2%(W/V)PVP;1.2.3 CTAB沉淀缓冲液（1）：50mmol/l Tris-Hcl(PH 8.0),10mmol/l EDTA,0.7mmol/lNacl,1%(W/V)CTAB,2%(V/V)-巯基乙醇;1.2.4 CTAB/Nacl溶液（10%CTAB/0.7mol/lNacl）:在80ml蒸馏水中溶解4.1gNacl,缓慢加入10gCTAB,同时加热搅拌，如果需要，可加热至65溶解9;1.2.5氯仿/异戊醇（24：1）;1.2.6电泳缓冲液（TAE）：A)50储存液（PH约8.5）:24.2gTris碱,5.7ml冰醋酸，3.72gEDTA,补加水至100mlB)1 工作液：40mmol/lTrisAc,1mmol/lEDTA;1.2.7琼脂糖凝胶：0.8g琼脂糖，0.5g/mlEB,补加1 TAE至100ml。1.3 主要仪器设备1.3.1通风橱1.3.2 HH-S数显恒温水浴锅1.3.3冷冻高速离心机1.3.4紫外分光光度计1.3.5CHN868PH计1.3.6立式电热压力蒸汽灭菌器1.3.7优普超纯水机1.3.8格兰仕微波炉1.3.9 BIO-RAD凝胶成像系统1.3.10电热恒温鼓风干燥箱2.实验方法和步骤2.1 常规方法的提取本研究参考精编分子生物学实验指南，采用常规CTAB法来提取油樟根、茎、叶DNA，具体操作程序如下：2.1.1在所需的CTAB抽提液中加入-巯基乙醇，使终浓度达4%（V/V），将此溶液及CTAB/Nacl溶液加热至65;2.1.2取新鲜幼嫩叶片（根或茎）约3g,迅速放入离心管中，置于液氮罐中预冷;2.1.3将样品从液氮罐中取出，放入预冷的研钵中，在研钵中不断倒入液氮，将叶片（根或茎）研磨成细粉;2.1.4迅速将研磨好的细粉装入试管中，加入12l预热的-ME/CTAB，混合使之充分湿润;2.1.5将试管置于65水浴中，保温80min,不时混匀;2.1.6待冷至室温后，用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，轻缓颠倒充分混匀，于4，12000rpm离心10min，回收上（水）相;2.1.7在回收的上层中加入1/10体积的65预热的CTAB/Nacl溶液，颠倒混匀;2.1.8用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，于4，12000rpm离心10min，回收上（水）相;2.1.9加入正好1.5体积的CTAB沉淀液，颠倒离心管混匀，如果沉淀可见，继续步骤2.1.11，否则于65预热30min;2.1.11加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，于4，12000rpm离心10min，沉淀DNA，用80%的乙醇洗涤沉淀物，干燥;2.1.12沉淀干燥后溶于100lTE缓冲液中，-20储存备用;2.1.13用0.8%的琼脂糖凝胶做电泳分析; 2.1.14用紫外分光光度计做紫外光谱分析。2.2改良CTAB法具体操作程序如下（所有步骤为严格的无菌操作）：2.2.1在12mlCTAB抽提液中加入480l-巯基乙醇,使终浓度达4%（V/V）。将此溶液及CTAB/NaCl溶液水浴加热至65；2.2.2取新鲜幼嫩根（叶片或茎）约3g，放入预冷的研钵中，不断倒入液氮将根（茎或叶）研磨成细粉；迅速将研磨好的细粉装入试管中，加入预热的-ME/CTAB，混合使之充分湿润；2.2.3将试管置于65水浴中，保温80min,其间不时混匀；2.2.4将样品转移至50ml离心管中，待冷至室温后，用等体积的氯仿/异戊醇抽提，轻缓颠倒充分混匀，于412000rpm离心10min,回收上（水）相；2.2.5在回收的上相中加入1/10体积的65预热的CTAB/Nacl溶液，颠倒混匀；2.2.6用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，于412000rpm离心，回收上（水）相；2.2.7加入1体积的CTAB沉淀液，颠倒离心管混匀，如果沉淀可见，继续步骤2.3.8，否则于65温浴30min；2.2.8加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，于4 12000rpm离心10min，沉淀DNA；2.2.9用80%乙醇洗涤沉淀物，干燥；2.2.10沉淀干燥后溶于加有2l 1mg/mlRNaseA的100lTE缓冲液中，4储存备用；2.2.11取油樟根、茎、叶DNA各7l，用0.8%(W/V)琼脂糖做凝胶电泳分析；2.2.12取10lDNA样品，稀释至2.5ml，测其A260和A280的吸收值。2.3 油樟根、茎、叶DNA提取的比较方法本研究设置了单因素变量对照,从DNA的浓度和得率两方面来对比评判提取油樟根茎叶DNA的难易程度，如表2-1:表2-1单因素变量法对比油樟根茎叶DNA选择因子根茎叶材料油樟根(2g)油樟茎(2g)油樟叶(2g)药品相同相同相同仪器相同相同相同DNA提取方法相同相同相同凝胶电泳分析方法相同相同相同紫外光谱分析方法相同相同相同DNA浓度计算方法相同相同相同DNA得率计算方法相同相同相同3.结果及分析3.1 0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析3.1.1 用常规CTAB法所提根茎叶DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析：图3-1 常规CTAB法提取的油樟根茎叶DNA凝胶电泳图谱M:DL2000 1: 根DNA 2: 茎DNA 3: 叶DNA结果分析:由图3-1可以看出,常规CTAB法提取的DNA质量较差，表现为DNA样品浓度较低，有严重的污染，说明该方法有待改进。3.1.2 用常规CTAB法所提DNA样品污染物研究结果及分析:图3-2 加RNaseA前后油樟根茎叶DNA凝胶电泳图谱M:DL2000 1-3: 未加RNaseA根茎叶DNA 4-5: 加入RNaseA后根茎叶DNA 结果分析:由图3-2可以看出,加入RNaseA前(如图3-2中编号1-3),在250-1500bp处有明晰的条带，加入RNaseA后(如图3-2中编号4-5)则该条带消失，说明在250-1500bp处的清晰的条带为RNA条带，用常规CTAB法提取的DNA中有严重的RNA污染。3.1.3 用改进CTAB法所提根茎叶DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析：图3-3 油樟根茎叶DNA的凝胶电泳图谱 M：DL2000 1：根DNA 2：茎DNA 3：叶DNA结果分析:由图3-3可以看出,DNA无降解也无蛋白质和RNA污染，改进CTAB法较常规CTAB法所提油樟根茎叶DNA质量明显提高，具体表现为DNA的浓度和纯度大幅度提高；DNA根DNA茎2，说明油樟根茎叶的DNA质量很低，有较严重的RNA污染。3.2.2 改进CTAB法所提取油樟根、茎、叶DNA紫外光谱结果及分析:表3-2改进CTAB法所提油樟根茎叶DNA紫外光谱分析表 A260（Abs）A280（Abs）A260/A280DNA浓度(g/ml)DNA得率(g/g)根0.0140.0081.7517587.5茎0.2000.1091.8325001250.0叶0.6730.3751.8984134206.5注:据公式DNA=A260稀释倍数50（g/ml）计算出：DNA根=175g/ml DNA茎=2500g/mlDNA叶=8413g/ml据公式DNA得率(提取率)(g/g材料鲜重)=DNA浓度/取材量(g)计算出：根DNA得率=87.5g/ g茎DNA得率=1250.0g/ g叶DNA得率=4206.5g/ g结果分析:由表3-2看出,改进CTAB法较常规CTAB法所提油樟根茎叶DNA质量明显提高，具体表现为DNA的浓度和纯度大幅度提高：改进CTAB法提取的油樟叶油樟A260/A280的比值在1.7-1.9之间，说明油樟根茎叶的DNA质量都比较高，无较大的RNA污染和蛋白质污染；DNA根DNA茎DNA叶,根DNA得率茎DNA得率叶DNA得率。显示在单一变量对照下，所提取油樟的根DNA的浓度和得率依次小于茎DNA的浓度和得率小于叶DNA的浓度和得率，说明提取油樟根DNA的难度大于茎DNA的难度大于叶DNA的浓度。4.讨论4.1 CTAB法的基本原理由于植物染色体DNA与组蛋白等结合成为脱氧核糖核蛋白复合体（deoxy-ribonuleoprotein, DNP）,存在于细胞核中，因而，从细胞中提取DNA时，首先需要把DNP抽提出来，其次把蛋白质除去，然后除去细胞中的糖，核糖核酸（RNA）及无机离子等，从中分离出DNA。DNP和核糖核蛋白复合物（RNP）在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响不同，DNP在高盐溶液（0.7mol/lNacl）中可以稳定存在，但如果降低盐浓度，DNP的溶解度也随之降低，当盐浓度0.3mol/l时几乎不溶，这时与CTAB结合的DNP就会沉淀出来。而RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在低盐溶液中溶解度较大11。另外大部分的蛋白质和多糖仍溶于溶液中，所以利用这个原理，我们不仅能分离DNP和RNP这两种核蛋白，还能将大部分的蛋白质和多糖除去，得到DNA粗提物。再经过进一步的纯化,便可提取出高质量的DNA。4.2 几种主要试剂的作用与对比4.2.1 十六烷基三甲基溴化铵（cetyltriethlammoninum bromide,CTAB）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，并在低盐溶液中将DNP沉淀出来，CTAB在15以下会沉淀，因此应先将CTAB抽提液置于65水浴锅中预热12;4.2.2 乙二胺四乙酸（EDTA）：能螯合大多数核酸酶所需要的辅助因子镁离子;4.2.3 -巯基乙醇：防止酚类氧化（酚类化合物能与DNA共价结合，使DNA带棕色或褐色）;4.2.4 聚乙烯吡咯烷烔（PVP）：与酚类结合;4.2.5 氯仿/异戊醇（24/1）：去除蛋白质。其中氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的泡沫13;4.2.6 异丙醇：沉淀核酸。沉淀DNA时用异丙醇而不用乙醇，因为用异丙醇沉淀DNA时只需加入0.6体积的容量，而且小分子量DNA都能沉淀下来，用乙醇沉淀DNA时，只能有选择地沉淀大分子量DNA14。要注意的是异丙醇不易挥发，最好用80%的乙醇多洗几次。4.3 方法的探索及改进针对常规CTAB法出现的问题所作的探索和采取的措施：4.3.1在CTAB提取缓冲液中加入2%（W/V）PVP（聚乙烯吡咯烷烔）：实验发现在探索实验中经80%乙醇洗涤干燥后的沉淀仍略带褐色，说明沉淀中仍然含有酚类杂质，而CTAB提取缓冲液中已经加入了体积比高达4%的-巯基乙醇，CTAB沉淀液中也加入了2%（V/V）的的-巯基乙醇，说明仅仅靠-巯基乙醇防止酚类氧化是不够的，还得用聚乙烯吡咯烷烔与之结合并除去酚类杂质；4.3.2使用氯仿/异戊醇（24：1），而不使用酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提：原因之一是在使用酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提时，由于所加试剂体积大于实验室50ml离心管体积(这也是试验室能提供的最大容积的离心管)，因此导致所加酚氯仿/异戊醇（25:24:1）的体积小于应加的量，会造成蛋白质污染；其次是因为酚本身就是一种杂质，用酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提后的DNA沉淀颜色为褐色，而用氯仿/异戊醇（24:1）抽提的为白色，说明了用酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提时造成了二次污染，故做此改进；4.3.3使用1体积的CTAB沉淀液，而不使用1.5体积：原因是1-1.5体积的效果区别不是很显著，加入1.5体积造成了药品浪费，并且离心后倒掉的下层液体会污染环境；4.3.4在步骤12(即用TE缓冲液重悬时)，加入2l 1mg/mlRNaseA:用常规CTAB法提取的DNA有严重的RNA污染(如图3-1所示)，之所以确定是RNA污染，本研究做了以下探索：DNA是大分子物质，其分子量应该在10000bp处。根据图3-1分析可知，用常规CTAB法提取的DNA凝胶电泳图谱在9399bp、9707bp 、10025bp处只有很模糊的条带，而在250-1500bp（属于RNA的分子量的范畴）范围内却有很明晰的条带，据此初步判断有RNA污染。另外，据查阅的资料15：所提取DNA的纯度可用OD260和OD280的比值来评判。OD260/OD280对DNA而言，其值大约为1.8,高于1.8则有可能有RNA污染，大于2时则RNA浓度过高，要去除RNA；当OD260/OD2800.9时，则蛋白质浓度过高，要用TE缓冲液饱和的酚/氯仿/异戊醇抽提，再用无水乙醇沉淀，抽干，TE缓冲液悬浮，最后用紫外分光光度计测定。表3-1进一步说明了DNA样品有严重RNA污染。因此在改进CTAB法中，将实验室的固体RNaseA配制成1mg/mlRNaseA溶液，向每个DNA样品中加入2l 1mg/mlRNaseA。 4.3.5使用PH计而不使用精密PH试纸测定EDTA和Tris碱的PH值，将其PH值精确到8.000：在探索实验中使用的是精密PH试纸测定EDTA，Tris碱的PH值，误差很大，导致有几次提取出来的干燥DNA沉淀都无法使用TE缓冲液重悬。因此本研究先将固体的EDTA，Tris碱配制成母液并使用能精确到千分位的PH计调节其PH值至8.000储存备用，从而解决了该问题；4.3.6将DNA样品于4储存备用：在探索试验中将DNA样品置于-20冰箱冷冻储存，待取出来做分析时已经冻结，如此反复几次后，凝胶电泳图谱上的DNA条带呈现弥散一片，这个现象说明了DNA已有部分降解，究其原因，应该是将DNA反复冻融造成的。由于本研究提取出的只是微量DNA，不需要储存很长的时间，因此，将DNA样品置于4冰箱冷藏室保存即可。4.4 注意要点4.3.1 提取DNA的溶液及用品乃至植物材料都要清洁，溶液及用品都要高温高压灭菌，植物材料要清洗干净，避免DNase的污染16;4.3.2 使用的研钵要预冷;4.3.3 对于高分子量DNA来说，在提取DNA的各个操作过程中应该始终避免剧烈振动，在用枪头转移DNA过程中应避免产生气泡，绝不能用枪头吸上吸下地溶解DNA，使用的枪头最好是剪去端部约0.8cm的1ml枪头。另外应避免重复的冻融步骤;4.3.4 用氯仿/异戊醇（24/1）抽提时，摇晃一定要轻，否则易造成DNA断裂降解;4.3.5 实验室EDTA，Tris碱为固体，由于实验对这两种药品的PH值都有严格要求，所以最好是先将这两种药品配制成母液，并用PH计调节其PH至8.0储存备用;4.3.6 配制所有试剂溶液都使用蒸馏去离子水;4.3.7 加入CTAB/Nacl溶液和CTAB沉淀缓冲液的量一定要准确，否则CTAB与核酸的复合物沉淀不易产生或者得到的DNA部分降解4.5 实验过程中遇到的问题及对策4.4.1问题：装实验材料的离心管盖子被盖严后置于-70冰箱（或液氮罐）中冷冻储存，由于和环境温度存在较大的温差，较长时间后从中取出离心管会爆裂，这样不但浪费了材料，还损失了离心管。4.4.2 对策：离心管盖子不能被盖得太严。5.总结5.1获取高质量的DNA 是分子生物学研究的基础, 而在提取过程中, 多糖、多酚以及其它次生代谢物时常产生严重干扰。通常采取的是加入多酚络合物PVP (聚乙烯吡咯烷酮)及抗氧化剂- 巯基乙醇、VitC、DTT (二硫苏糖醇) 和亚硫酸钠等方法, 以防止多酚物质氧化成醌类, 避免褐变的发生17。油樟这种植物中也含有大量的多糖、鞣质、多酚等次生代谢物, 常规方法提取会使这些物质与DNA 发生不可逆的结合而使DNA 呈褐色、粘稠, 影响DNA 质量。另外, 在提取过程中经裂解液处理后,细胞破碎, 次生代谢物被释放出来, 使提取液变得异常粘稠, 难以操作, 这不仅给提取工作带来了很大困难, 并且在沉淀过程中这些粘稠物质会包裹DNA 一起沉淀形成粘稠的胶状物, 导致提取的DNA 质量差, 溶解困难。为解决这些问题, 本研究在提取过程中参考前人的研究结果, 在提取缓冲液中加入了2% PVP 和4%- 巯基乙醇, 结果能较好的防止氧化褐变的发生, 使DNA 溶液的颜色明显变浅。经过这些改进后, 我发现在整个油樟根茎叶DNA提取过程中操作变得容易, 所提DNA 的质量也大大提高, 比改进前的常规法要好很多。通过紫外检测(A260/A280在1.8左右)、凝胶电泳检测(DNA无蛋白质RNA污染，无降解)表明：改进CTAB 法提取的油樟DNA 质量较好, 纯度较大, 易溶于缓冲液中, 所提的DNA适于进行分子生物学研究。5.2改进CTAB法提取的DNA得率和纯度都较为理想，符合DNA 分子标记的最适实验要求(在扩增体系中达到DNA 浓度0.2-0.4g/ ml18)，适合于科研课题对大量材料的处理，也适于教学或用于需要测序的DNA纯化。5.3植物各组织器官基因组都是相同的,不受生长季节生长周期的影响19, 而油樟嫩叶片相对于油樟根和茎更易研磨成细粉，油樟叶DNA得率和纯度也比油樟根DNA和茎DNA高得多，因此选取油樟嫩叶片作为油樟DNA的提取材料较为理想。参考文献1 四川植物志编委会.四川植物志第一卷（种子植物）.四川人民出版社，1981.342 廖时权.宜宾县开发天然油樟.农村经济与科技.1995.95-83 廖时权.宜宾县开发天然油樟.农村经济与科技.1995.95-84 罗中杰，李维一，魏琴，罗通.宜宾油樟的现状和未来.四川师范大学学报自然科学版.2001.24-35 廖时权.宜宾县开发天然油樟.农村经济与科技.1995.95-86 廖时权.宜宾县开发天然油樟.农村经济与科技.1995.95-87 徐虹, 郑敏, 章军等.三种樟科植物的细胞总DNA 提取.云南植物研究.2004 .26-4 . 451-4578 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.化学工业出版社.2005.99 美.F.奥伯斯R.E金斯顿.J.G塞德曼等著.颜子颖王海林等译.金冬雁校.精编分子生物实验指南.科学出版社.2001.8110 刘萍,代红军,张立杰等. DNA 提取方法与植物种类的效应比较. 宁夏农林科技. 1998.1-1511 顾红雅，瞿礼佳等.植物基因与分子操作.北京大学出版社.199512 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.化学工业出版社.2005.913 美.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁,黎孟枫等译,侯云德等校.分子克隆实验指南.第二版.科学出版社.2002.30914顾红雅，瞿礼佳等.植物基因与分子操作.北京大学出版社.199515 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.化学工业出版社.2005.916 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.化学工业出版社.2005.917 徐虹, 郑敏, 章军等.三种樟科植物的细胞总DNA 提取.云南植物研究.2004 .26-4 . 451-45718舒艳群等. RAPD技术在药用植物学研究中的应用J.中草药.1999.30 -2:14719黄萱,高丽美,张永彦,徐子勤.一种优化的植物总DNA 提取方法西北植物学报2004.24-6.11031106致谢本研究能够顺利完成，是因为得到了我的老师、同学以及宗场镇孜岩村陆场主提供的大力帮助和支持，我在此对他们表示衷心的感谢和诚挚的敬意!衷心感谢罗通教授对本研究的悉心指导。从本研究的实验设计、实验操作、实验结果的分析到论文的修改，罗教授都提供了不少中肯的意见和建议。他一丝不苟的科研精神深深地感染了我，才使本研究获得圆满成功。感谢邓鹜远老师为本次实验所需的试剂用品提供的大力帮助,有了她的帮助,本研究才能得以顺利完成。感谢本组实验成员和几位非本组实验成员在采集油樟材料时所给予的帮助。感谢宗场镇孜岩村陆场主为我无偿提供了大量油樟材料。再次向以上人士表示我衷心的感谢!文献综述油樟根茎叶总DNA提取研究沈志强摘要：本文岁撰写此论文的选题背景、油樟的形态学特征、油樟的历史发展过程、对油樟综合利用的现状分析、油樟综合利用的前景、油樟DNA的提取原理以及此课题的研究价值都做了扼要的介绍。关键词：宜宾油樟 樟油 DNA CTAB很早就听说了油樟，有幸来到宜宾亲眼目睹它的风采是我今生的荣幸，而能够以一名科研者的身份对其加以研究更令我欣喜若狂，另外我对DNA也充满了好奇，这也是我选择此课题的最初理由。为了阐明本课题的研究价值、资料来源、和技术路线，特撰写此综述。油樟是我国稀有的经济林木，本文对油樟的一些形态学特征、提取樟油的主要化学成分以及提取DNA的方法做了简要阐述。一.历史发展要提取油樟的DNA，首先就必须了解油樟。油樟学名是Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)，属樟科樟属，高大乔木，叶互生，卵形、椭圆形或短圆形，先端长渐尖或急尖，基部楔形至近圆形，长5.5-12cm，宽3-6 cm，幼时即无毛，腹面暗绿色，有光泽，背面粉绿色，通常羽状脉，中脉两面凸起，侧脉约5-6对，两面凸起，脉腋腹面泡状隆起，背面有小窝孔，孔内有短毛，横脉和细脉背面较明显，叶柄长2-3 cm，无毛。圆锥花序腋生，纤细，疏散，通常长10 cm以上，无毛，花梗长1-3 cm，无毛；花被长约2 mm，外侧无毛，内侧密被毛，裂片卵形，长1.5 mm，花后花被上部自花被管的顶端处整齐环裂脱落；雄蕊长约1 mm，被柔毛，第3轮的花丝基部有1对具短柄状的腺体，退化雄蕊长约0.5 mm，被毛，近心形；雌蕊无毛，子房近圆球形状，花柱较子房为长，柱头小，盘状。果阔倒卵状，顶端平或微凹，歪斜，稍扁，长9 mm，直径8 mm，果托碟状，全缘，直径约3.5 mm；果梗长4-5 mm，向上增粗。花期4-5月；果期8-9月1。油樟在四川有大量分布，产于叙永、宜宾、屏山、娥眉、雅安、邛崃等地。宜宾是油樟的分布中心。在经历了许多坎坷之后，油樟终于闪现出了它那金子般的光芒。1951年修建成渝铁路时，