僵蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1486-1494僵蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究宋美营,王立勇,王巧宇,张林松,徐卫东,汤1江苏大学药学院，镇江2 12 0 13；镇江市食品药品监督检验中心，镇江2 12 0 50；亳州学院中药学院，亳州2 36 8 0 0摘要：建立云南与四川僵蚕药材的总蛋白质指纹图谱及分级指纹图谱，对比分析以发现其中的差异表达蛋白质分子并进行鉴定及生物信息学分析，探索其用于产地鉴定的可行性。提取两种僵蚕的酸溶、碱溶、水溶及醇溶性总蛋白质,对其进行丙酮分级沉淀,对所得样品进行SDS-PAGE指纹图谱对比分析，对所得差异条带进行LC-MS/MS分析,数据库检索后进行生物信息学分析。两种僵蚕的总蛋白质指纹图谱相似度很高，难以据此进行产地鉴定；两种僵蚕的分级指纹图谱则有较显著差异，有望用于产地鉴定；依据分级指纹图谱差异共鉴定出-葡萄糖苷酶、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、含脂肪酶结构域蛋白等2 7 3种蛋白质。云南与四川僵蚕的蛋白质组成及其分级指纹图谱存在显著差异,有望用作产地鉴定的分子依据；醇溶蛋白质构建分级指纹图谱可以提供更加丰富的信息及更好的分辨率；分级指纹图谱技术具有简便易行、分辨率较高的优点，为其他中药材的产地鉴定研究提供了方法学思路。关键词：僵蚕；蛋白质；分级指纹图谱；产地鉴定中图分类号：R282.5D01:10.16333/j.1001-6880.2023.9.003Study on establishment of protein grading fingerprint of Bombyx Batryticatusand its correlated molecules of geographical origin identificationZHANG Lin-song,XU Wei-dong,TANG Jian,WEN Chong-wei*School of Pharmacy,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2 Zhenjiang Food and Drug Supervision and Inspection Center,Zhenjiang 212013,China;3 Traditional Chinese Medicine College,Bozhou University,Bozhou 236800,ChinaAbstract:To establish and compare the total protein fingerprints and the fractional fingerprints of Bombyx Batryticatus fromYunnan and Sichuan,and to discover the differentially expressed protein molecules,and to identify and analyze them by massspectrum and bioinformatics,to explore the feasibility of its application in geographical origin identification.The total acid-sol-uble,alkali-soluble,water-soluble and alcohol-soluble proteins of the two kinds of Bombyx mori were extracted,and they werefractional precipitated with acetone.The SDS-PAGE fingerprints of the obtained samples were compared and analyzed.Thedifferential bands were analyzed by LC-MS/MS,and the bioinformatics analysis was conducted after database retrieval.Thesimilarity of the total protein fingerprints of these two kinds of Bombyx Batryticatus was very high,so it is dfficult to use forgeographical origin identification of this Chinese medicinal material.The fractional fingerprints of these two kinds of BombyxBatryticatus were relatively different,which is expected to be used for the identification of its geographical origin.According tothe difference of fractional fingerprints,273 proteins including chymotrypsin inhibitor,trypsin inhibitor,fumarylacetoacetatehydrolase domain-containing protein and lipase domain-containing protein were identified.There were significant differencesin protein composition and fractional fingerprints between Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan,which were expec-ted to be used as molecular basis for geographical origin identification.The construction of fractional fingerprints of alcohol-soluble proteins can provide more abundant information and better resolution.The fractional fingerprint technology has the ad-vantages of simplicity and high resolution,which provides a methodological idea for the identification of other Chinese medici-收稿日期:2 0 2 3-0 2-13基金项目：中央本级重大增减支项目（2 0 6 0 30 2）；江苏省镇江市重点研发计划（社会发展）（SH2018023，SH 2 0 2 10 10）；中药原料产品研发安徽普通高校重点实验室（亳州学院）建设项目（KLAHEI18032）*通信作者 E-mail:建3，闻崇炜1*文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)9-148 6-0 9SONG Mei-ying,WANG Li-yong,WANG Qiao-yu,接受日期:2 0 2 3-0 5-0 5Vol.35nal materials.Key words:Bombyx Batryticatus;proteins;fractional fingerprints;geographical origin identification僵蚕（BombyxBatryticatus）为家蚕幼虫在养殖中感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana（Ba l s.）V u i l l a n t 致死而形成的副产物，具有息风止、祛风止痛、化痰散结的功效 。由于我国“东桑西移”产业布局的实施，四川与云南成为我国蚕桑产业大省,也因而成为僵蚕药材的主要产区。由于四川产僵蚕比云南产的性状特征更符合历代本草典籍及6 3、7 7 年版药典所述“身直肥壮、质坚色白、断面光亮”的优质僵蚕标准,因此市场认可度更高，销售价格也更高2 4。市场调查中发现常有商家在销售中故意混淆两者产地以牟利,为提高临床用药的安全性及有效性,有必要对僵蚕产地鉴定方法开展研究。众所周知,中药材有效成分的形成和积累与其生长的自然条件有着密切关系,因此产地是影响中药材质量的重要因素之一，建立产地鉴定与溯源方法对满足消费者了解产品信息的需求、保护生产、加工、销售企业的权益、提升我国药材在国际市场上的竞争力具有重要作用。廖保生等提出可以基于分子生物学技术、中药指纹图谱技术、同位素示踪技术、无线射频识别溯源技术及条形码技术进行中药材的产地鉴定及溯源5。蛋白质电泳为国际种子检验协会采纳的标准品种鉴定方法，但该法尚有分辨率不高、难以进行种内鉴定的缺点,难以用于中药材的产地鉴定与溯源。有鉴于此,本文拟探索将分级沉淀及蛋白质电泳技术相结合建立分级指纹图谱技术的可行性,以此分析云南及四川僵蚕的蛋白质组差异,并对所得差异分子进行鉴定及生物信息学分析，挖掘产地鉴定相关分子,为建立简便易行、科学准确的产地鉴定方法提供实验依据。1材料与方法1.1药材僵蚕药材购自荷花池、亳州、安国及玉林中药材市场,四川产僵蚕（以下均简称为川产)批号分别为：150 510、16 0 10 6、2 0 16 0 42 0、2 0 150 7 0 3；云南产僵蚕（以下均简称为滇产）批号分别为：130 10 1、160512、2 0 1512 0 8 2,经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 45龄的幼虫感染白僵菌Beauveria bassiana（Ba l s.）Vuillant而致死的干燥体。宋美营等：蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究14871.2试剂丙烯酰胺（批号：2 0 16 10 17，化学纯）、N,N-亚甲基双丙烯酰胺（2 0 1110 12，含量98.0%）、N,N，N,N-四甲基乙二胺（TEMED）（含量99.0%）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（批号：2 0 2 10 8 2，含量99.0%）、十二烷基硫酸钠（SDS）（含量99.0%）、甘氨酸（Glycine）（批号：C1488777，含量99.0%）、牛血清白蛋白（BSA）等均购自生工生物工程（上海）有限公司。冰醋酸（批号：2 0 16 0 4130 1）、无水乙醇（批号：2 2 11199）、过硫酸铵（批号：2 0 18 10 18）、三氯醋酸（TCA）（批号：C14297217）、丙酮（批号：20200107）、甘油（批号：T20090224）、ED T A（批号：20140324）纯度均为分析纯，考马斯亮蓝G-250（批号：7 10 112 8 4，有效分光含量8 5.0%）等购自国药集团化学试剂有限公司。蛋白质分子量标准购自Fermentas 公司。1.3仪器FE20型实验室pH计（Mettler Toledo公司）；SpectraMax190酶标仪（Molecular Devices公司）；VE-180垂直电泳槽（上海天能科技有限公司）、DYY-6C稳流稳压电泳仪（南京驰顺科技发展有限公司）;GenoSens2100凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；岛津UV-2550紫外分光光度计（Sh i m a d z u 公司）、nanoLC-Ultra 1Dplus高效液相色谱系统（美国Eksigent Technologies公司）；配备NanosprayFlex离子源的TripleTOF5600系统（美国AB Sciex公司)。1.4方法1.4.1僵蚕蛋白质提取及定量蚕药材水洗后置于40 下烘干，粉碎后过70目筛备用。准确称取多份僵蚕药材粉末,分别按液料比6 0:1（mL/g）加人0.1mol/LNaAc缓冲液(pH 4.8）、6 0:1(m L/g)加人 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.6）、50:1(m L/g)加人ddH,0、2 5:1(m L/g)加人40%Et0H,25震荡提取8 h,13 000 r/min离心10 min后取上清液，即得僵蚕酸溶、碱溶、水溶、醇溶性总蛋白质。以BSA为标准品,Bradford法测定样品中蛋白质含量并计算提取率，样品置于-8 0保存备用。1.4.2紫外检测紫外可见分光光度计在2 40 50 0 nm波长范围1488内对僵蚕蛋白质样品进行全波长扫描，得紫外检测图谱。1.4.3丙酮分级沉淀取适量酸溶性蛋白质样品，滴加丙酮至终浓度为10%（V/V）,静置2 0 min,13000 r/min离心10min后取沉淀，得酸溶性蛋白质10%沉淀部分，上清继续滴加丙酮至终浓度为2 0%（V/V），130 0 0 r/min离心10 min后取沉淀，得2 0%沉淀部分，上清同上处理，继续增加丙酮终浓度分别为30%、40%、50%、6 0%、7 0%、8 0%（V/V），收集各部分沉淀，依次可得30%、40%、50%、6 0%、7 0%、8 0%分级沉淀部分。同法处理碱溶、水溶、醇溶性蛋白质样品，可得各对应分级沉淀样品1.4.4蛋白质电泳(SDS-PAGE)取上述各分级沉淀样品,加适量ddH,O及等体积2 上样缓冲液，煮沸10 min 后进行SDS-PAGE6。8 0 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂距胶板底部边缘时结束电泳。结束后按常规方法进行剥胶、固定及染色，随后脱色至背景无色，电泳条带清晰。1.4.5图像分析及数据处理采用GenoSens2100型凝胶成像系统采集凝胶图像，泳道对比以发现差异蛋白质分子，QuantityOne4.6.2软件进行图像分析，根据条带迁移率计算蛋白质分子量，根据条带灰度值计算蛋白质含量。1.4.6液质联用分析凝胶中差异蛋白质样品常规胶内酶解后进行分析。液相条件:nanoLC-Ultra 1D plus 系统,EksigentCig色谱柱(7 5 m 150 mm,3 m)分离;流动相:0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液(B);梯度洗脱(0 55 min,5%23%B;5575min,23%52%B;75 76 min,52%80%B;76 80 min,80%B;80 90 min,0%5%B);流速:30 0天然产物研究与开发nL/min;检测波长：2 7 5nm；柱温：50；进样量：7L。质谱条件：TripleTOF5600系统，配备Nanos-pray Flex离子源，正离子模式进行扫描。质量范围m/z:3501500;S-LensRF（射频电压)50 V,喷雾电压2 0 0 0 V,气帘气压力2 10 Pa,雾化气压力3.410Pa,加热温度150，质谱扫描方式为IDA模式。一级 TOF-MS 单张图谱的扫描时间为250ms,每次IDA循环下,最多采集40 张电荷为+2+5且单秒计数大于12 0 的二级质谱，每张二级质谱的累积时间为50 ms。1.4.7数据库检索质谱数据通过ProteinPilot（V4.5）检索，检索算法为Paragon。使用数据库为UniProt中Beauveria_bassiana和Bombyx_mori 的蛋白质组参考数据库。检索参数如下:Sample Type 选 Identification;Cys Al-kylation 选 Iodoacetamide;Digestion 选 Trypsin;SearchEffort设置为 Rapid ID。检索结果以 Unused1.3为标准进行筛选，删去反库中检索的条目和污染蛋白，余下鉴定信息用作后续分析。1.4.8生物信息学分析采用 eggNOG5.0(http:/eggnog5.embl.de/)对检索得到的差异表达蛋白质分子进行基因同源性分类（Gene ontology,GO）功能注释分析、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Gene andGenomes,KEGG)代谢通路分析以及蛋白相邻类聚簇(Cluster of Orthologous Groups of Proteins,COG)功能分析。相关蛋白质详细信息通过Python实现数据可视化。2结果与分析2.1紫外光谱检测按1.4.2”所述对僵蚕蛋白质样品在2 40 50 0nm波长范围内进行全波长扫描,结果显示,滇产僵A61543210240290340390440490波长Wavelength(nm)图1紫外光谱扫描图Fig.1 Ultraviolet spectrum scan注：A：滇产僵蚕;B:川产僵蚕。Note:A:Bombyx Batryticatus from Yunnan;B:Bombyx Batryticatus from Sichuan.Vol.35B654320240290340390440490波长Wavelength(nm)Vol.35蚕的最大吸收波长是2 7 7 nm，川产僵蚕的最大吸收波长是2 7 9nm（见图1）,因此后续液质联用分析中以2 7 5 nm 为检测波长。2.2酸溶性蛋白质分级指纹图谱及差异分子研究以0.1mol/LNaAc缓冲液（pH 4.8）提取两地僵蚕药材的酸溶性总蛋白质，并对其进行SDS-PAGE指纹图谱分析,结果表明两者相似度极高,难以据此进行产地鉴定（图2 第1、2 泳道）。对酸溶性总蛋白质进行分级处理，再对所得分级样品进行SDS-PAGE指纹图谱分析，结果表明10%30%的78910C-ADB-宋美营等：蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究616-E一F1489丙酮溶液可以沉淀出分子量在2 7 kDa以上的蛋白质，40%6 0%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在536 k D a 的蛋白质,7 0%8 0%的丙酮溶液可以沉淀出分子量小于15kDa的蛋白质（图2 第3 18 泳道）。滇产及川产僵蚕的酸溶蛋白质均有分子量为30.6kDa的蛋白质（图2 中箭头A所示）,同时分级指纹图谱对比分析表明，两种样品存在4.9 5、27.11、2 9.40、30.42、36.91、38.93k D a 的差异蛋白质条带（图2 箭头B、C、D、E、F、G 所示）。11121314151718M70kDa55kDa35kDa25kDa15kDa总蛋白Total protein图2 滇产及川产僵蚕酸溶性总蛋白质指纹图谱及分级指纹图谱Fig.2 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of acid soluble proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan注：1、2：总蛋白质；35、7、9、11、13、15、17：滇产各分级处理样品；4、6、8、10、12、14、16、18：川产各分级处理样品；M：蛋白质分子量标准。下同。Note:1,2:Total protein;3,5,7,9,11,13,15,17:Sample treated in each grade from Yunnan;4,6,8,10,12,14,16,18:Sample treated in each2.3碱溶性蛋白质分级指纹图谱及差异分子研究以0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.6)缓冲液提取两地僵蚕药材的碱溶性总蛋白质,并对其进行 SDS-PAGE指纹图谱分析,结果表明两者相似度极高,条带覆盖严重，难以据此进行产地鉴定（图3第1、2 泳道）。对碱溶性总蛋白质进行分级处理，再对所得各分级样品进行SDS-PAGE指纹图谱分析,结果表810310%20%grade from Sichuan;M:Protein marker.The same below.30%40%50%明10%30%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在30kDa以上的蛋白质,40%6 0%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在6 40 kDa的蛋白质,7 0%8 0%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在15kDa以下的蛋白质（图3第318 泳道）。同时分级指纹图谱对比分析表明,两种样品存在36.96 kDa高丰度差异蛋白质条带（图3箭头H所示）。1112131415161718M70kDa55kDa35kDa25kDa15kDa60%70%80%总蛋白Total protein图3滇产及川产僵蚕碱溶性总蛋白质指纹图谱及分级指纹图谱Fig.3 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of alkaline-dissolvedproteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan10%20%30%40%50%60%70%80%14902.47水溶性蛋白质分级指纹图谱及差异分子研究以ddH,O提取两地僵蚕药材的水溶性总蛋白质,并对其进行SDS-PAGE指纹图谱分析,结果表明两者相似度极高，难以据此进行产地鉴定（图4第1、2 泳道）。对水溶性总蛋白质进行分级处理,再对所得各分级样品进行SDS-PAGE分级指纹图谱分析,结果表明,10%30%的丙酮溶液可以分级沉淀78910天然产物研究与开发出分子量在2 5kDa以上的蛋白质,40%6 0%的丙酮溶液可以分级沉淀出分子量在6 35kDa的蛋白质，7 0%8 0%的丙酮溶液可以分级沉淀出分子量在15kDa以下的蛋白质（图4第3 18 泳道）。同时分级指纹图谱对比分析表明，两种样品存在6.84、17.6 2、51.32 k D a 差异蛋白质条带（图4箭头I、J、K 所示)。23Vol.3561112131415161718M70kDa55kDa35kDa25 kDa15kDaK总蛋白Total protein图4滇产及川产僵蚕水溶性总蛋白质指纹图谱及分级指纹图谱Fig.4 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of water-dissolved proteinsof Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan2.5醇溶性蛋白质分级指纹图谱及差异分子研究以40%EtOH溶液提取两地僵蚕药材的醇溶性总蛋白质,并对其进行SDS-PAGE指纹图谱分析,结果表明两者相似度极高，难以据此进行产地鉴定（图5第1、2 泳道）。对醇溶性总蛋白质进行分级处理,再对所得各分级样品进行SDS-PAGE指纹图谱分析,结果表明,10%的丙酮溶液可以分级沉淀出910LOM-N-10%20%630%7840%50%分子量在30 kDa附近的蛋白质,2 0%50%的丙酮溶液可以分级沉淀出分子量在6 36 kDa的蛋白质，6 0%8 0%的丙酮溶液可以分级沉淀出分子量在2 0 kDa以下的蛋白质（图5第318 泳道）。同时分级指纹图谱对 比分析表明，两种样品存在6.51、2 9.19、30.0 6、31.45、36.57、36.7 2 k D a 差异蛋白质条带（图5箭头L、M、N、O、P、Q 所示）。1112131415161718M70kDa55kDa35kDa25kDa15kDa60%70%80%总蛋白Total protein图5滇产及川产僵蚕醇溶性总蛋白质指纹图谱及分级指纹图谱Fig.5 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of ethanol-dissolved proteinsof Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan2.6 LC-MS/MS 分析切取包含差异蛋白质条带的凝胶,胶内酶解后进行LC-MS/MS分析，得总离子流图（见图6）,共计10%20%30%40%50%得到7 593个谱图,2 2 38 个肽段,ProteinPilot数据库检索及匹配分析共得到2 7 3个差异蛋白质分子，其中主要差异蛋白质见表1。60%70%80%Vol.35宋美营等：僵蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究A17.6018.6412.5114.8216.0713.948.6112.098.9411.013.097.38 8.201.673.21149119.2622.5821.5221.2220.665.7323.1024.6525.5625.9927.7128.6530.0431.3233.7135.0131.9835.8536.3937.2738.7840.3240.7342.472468B101214 1618 202224 2628303234 3638404244时间Time(min)22.4019.0117.3338.6920.9738.3915.416.6413.8712.488.6911.0411.331.697.54.7.92M2468101214161820222426283032343638404244时间Time(min)图6僵蚕总离子流图Fig.6 Total ion chromatograms of Bombyx Batryticatus注：A：滇产僵蚕;B：川产僵蚕。Note：A：Bo mb y x Ba t r y t i c a t u s f r o m Yu n n a n;B：Bo mb y x Ba t r y t i c a t u s f r o m Si c h u a n.表1滇产及川产僵蚕主要差异蛋白质Table 1Major differential proteins in Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan分子量登录号蛋白质名称Login numberProtein nameAOA2N6NPF4-葡萄糖苷酶-ClucosidaseH9JPA8含肽酶 S1域的蛋白Peptidase S1 domain-containing proteinAOA2N6NDP1AOA2N6N8K2AOA2N6POH6A0A2N6P2K1Q03383H9IWG3P22922H9IXKOH9JKA2H9IZI5H9.JTDO31.5720.4823.7224.5625.87 26.9419.7614.7910.40柠檬酸合酶 Citrate synthase二甲基硫醚单加氧酶Dimethyl-sulfide monooxygenase腺苷同型半胱氨酸酶Adenosylhomocysteinase柠檬酸合酶 Citrate synthase抗胰蛋白酶1 Antichymotrypsin-1CN水解酶结构域蛋白CN hydrolase抗胰蛋白酶（AT）A n t i t r y p s i n（A T)抗胰凝乳蛋白酶1Antichymotrypsin-1抗胰凝乳蛋白酶2 Antichymotrypsin-2含脂肪酶结构域的蛋白质Lipase domain-containing protein含肽酶 S1域的蛋白 Peptidase S1 domain-containing protein28:128.630.0930.8133.7135.8236.3434.9833.3239.1740.28VWMMolecular weight(kDa)97.67297.06851.7350.77248.79146.25844.57244.32243.49941.91937.74635.80435.62942.39Protein matchingdegree(%)12.911.6929.9415.4329.622.8760.0044.2582.9170.8279.8212.3510.87蛋白质匹配度1492续表 1(Continued Tab.1)登录号Login numberAOA2N6NPJ6E7DWR1H9JKH3AOA2N6NQC5AOA2N6NIP8H9JDV4H9JHL4天然产物研究与开发蛋白质名称Protein name延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白2Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 2甘露醇脱氢酶Mannitol dehydrogenase含肽酶 S1域的蛋白 Peptidase S1 domain-containing protein细胞壁甘露糖蛋白1 Cell wall mannoprotein 1氰酸盐水合酶Cyanate hydratase（Cy a n a s e）核苷二磷酸激酶 Nucleoside diphosphate kinase含有细胞色素 c结构域的蛋白Cytochrome c domain-containing proteinVol.35分子量蛋白质匹配度Molecular weightProtein matching(kDa)degree(%)30.56718.3728.2513.9128.15411.2826.26243.8217.68515.5717.18281.7011.72120.371.Catalyicactivity57.86%2.Binding28.57%2.7生物信息学分析对差异蛋白质分析进行GO概念注释分析（见图7），结果表明主要涉及细胞过程（2 0.8 7%）、代谢过程（19.59%）、应答刺激（9.92%）、生物学调控（9.92%）、发育过程（6.6 2%）等生物过程；其中52.04%位于胞内细胞器,16.33%位于细胞外表面，9.18%位于外囊状结构，6.12%位于包膜；主要涉及A3.Responcetostimulus9.92%4.Biological regulation9.92%5.Development process6.62%6.Multicellularorganismalprocess5.34%107.Multi-organ process5.34%18.Cellularcomponent onganization orBiogenesis 4.58%9.Reproduction3.05%1210.Localization2.80%1311.Detoxification2.54%1412.Reproductiveprocess2.04%13.Signaling1.78%14.Growth1.27%15.lmmunesystem process1.02%16.Others3.31%催化活性（57.8 6%）、结合活性（2 8.57%）、抗氧化活性（5.7 1%）、分子功能调节活性（5.0 0%）、结构分子活性（2.8 6%）；特别是过氧化氢酶（30.7 7%）、硫氧还蛋白过氧化物酶（15.38%）、维生素B6结合（15.38%）、几丁质类角质层（7.6 9%）、几丁质结合(7.69%)等活性。B51.Cellular process 20.87%2.Metabolic process19.59%3.Antioxidantactivity5.71%4.Molecularfinctionregulator5.00%5.Structuralmoleculeactivity2.86%C1.Cellularanatomical entity37.40%2.Cell29.67%3.ntracelular27.64%4.Protein-containingcomplex5.28%5图7 差异蛋白质分子CO功能注释结果Fig.7 GO function annotation results of dfferent protein molecules注：A：生物过程分析；B：细胞组成分析；C：分子功能分析。Note：A：Bi o l o g i c a l p r o c e s s;B：Ce l l u l a r p r o c e s s;C：M o l e c u l a r f u n c t i o n.KEGG通路富集分析发现6 9、38、30、2 8 个差异蛋白质分子分别与代谢性途径、次生代谢产物合成、不同环境下微生物代谢、抗生素生物合成相关。COG分析表明其中2 5.7 8%为碳水化合物运输及代谢相关,2 3.8 3%与翻译后修饰/蛋白质周转/伴侣蛋白相关,9.7 7%与氨基酸运输及代谢相关,5.0 8%与防御机制相关，14.8 4%为功能未知的新蛋白（见图8）。研究表明僵蚕形成过程中，白僵菌首先通过分生孢子膨大发芽以直接穿透表皮而感染家蚕，在人侵家蚕体壁和血腔之初分泌大量的胞外蛋白酶,家蚕因而发生相应的防御反应,通过表达高水平的蛋白酶抑制剂以响应白僵菌入侵7-9。本文结果表明滇产与川产僵蚕的抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶等因子的表达水平均存在显著差异，有望用作产地鉴定的分子依据。此外，酪氨酸降解途径为动植物体内非常重要的代谢途径,其中断会引起严重的代谢紊乱,延胡索酰乙酰乙酸水解酶为该途径的末端限速酶10 。本文结果也表明该酶也有望用作产地鉴定的分子依据。Vol.35宋美营等：僵蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究1493ABiosythesis of secondarymetabolitesMicrobial metabolisn in diverse environmentsBiosynthesis ofantibioticsCarbon metabolismBiosynthesis ofaminoacidsGlyoxytate anddicarboxylate metabolisnProtein digestion and absorptionAmoebiasisLysosomeGalactosemetabolisnStarch and sucrose metabolismGlycolysis/GluconeogenesisArginineand prolinemetabolismAmino sygarand nudleotide sugarmetabolisnB注:A:KEGG 分析;B:COG 分析。Note:A:KEGG analysis;B:COG analysis results.3讨论与结论本文提取了滇产与川产僵蚕的酸溶、碱溶、水溶、醇溶性蛋白质，并分别进行总蛋白质及分级指纹图谱研究,结果表明两种僵蚕的总蛋白质指纹图谱相似度很高,难以据此进行产地鉴定；两种僵蚕的分级指纹图谱则有显著差异,有望用于产地鉴定;分级指纹图谱提供信息的丰富程度依次为醇溶性蛋白质酸溶性蛋白质 水溶性蛋白质 碱溶性蛋白质。依据分级指纹图谱差异共发现-葡萄糖苷酶、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、含脂肪酶结构域蛋白等273种特征蛋白质分子,这些分子具有转移酶、过氧化氢酶、硫氧还蛋白过氧化物酶等活性,参与多种细胞过程、代谢过程、应答刺激、生物学调控及发育过程，涉及次生代谢产物合成、不同环境下微生物代谢、抗生素生物合成、生物防御机制等途径，体现了不同生境因子对家蚕-白僵菌互作及僵蚕形成具有重要影响，具有用于僵蚕产地鉴定的潜在价值。道地药材是中药学中控制药材质量的一项独具Metabolic pathways图8 差异蛋白质分子KEGG及COG分析结果Fig.8 Analysis results of KEGG and COG201.Carbohydratetransportand25.78%metabollsm2.posttranslationalmodification.protein23.83%Tumover.chaperones3.fiumctionunknown14.84%4.A