鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立.pdf

DOI:10.1网络首发时间：2 0 2 3-0 6-0 52023,53(09):1089-1094中国兽医科学2023,53(09)ChineseVeterinaryScience6656/jissn.1673-4696.2023.0152中图分类号：S852.659.1文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96(2 0 2 3)0 9-10 8 9-0 6鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立卓玛1,2,钱炳旭1,薛峰1,2*,戴建君1,吴晓东3*（1.南京农业大学动物医学院，江苏南京210000;2.南京农业大学三亚研究所，海南三亚572000;3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266000)摘要：为开发一种快速、灵敏的非洲猪瘟病毒（ASFV)野生型株与基因缺失型株的鉴别诊断方法，本研究通过对ASFVp72、CD 2 v、M G F110-9L基因保守序列设计特异性引物和探针，并对体系进行优化，建立了一种可以同时检测p72、CD 2 v、M G F110-9L基因的多重qPCR方法。该方法与其他常见猪病毒性病原均无交叉反应，特异性强；敏感性试验结果显示，该方法对p72、CD 2 v 和MGF110-9L重组质粒标准品的最低检出限均为10 2 copies/mL，敏感性好；组内变异系数为0.0 3%0.5%，组间变异系数为0.0 4%1.5%，表明该方法重复性好。利用本方法和普通qPCR方法分别对50 份临床样品进行检测，结果显示，两种检测方法对ASFV核酸的检出率均为7 0%（35/50），符合率为10 0%。综上所述，本研究建立的多重qPCR方法为临床鉴别检测ASFV野毒株与基因缺失株提供了重要材料。关键词：非洲猪瘟病毒；基因缺失型株；p72;MGF110-9L;CD2vEstablishment of multiplex qPCR method for identification of genedeletion strains and wild strains of African swine fever virusZhuoma-2,QIAN Bing-xu,XUE Feng.2*,DAI Jian-jun,WU Xiao-dong*(1.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210000,China;2.Sanya Institute of NanjingAgricultural University,Sanya 572000,China;3.China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao 266000,China)Abstract:To develop a convenient,rapid and sensitive identification technology between ASFV gene deletionstrains and wild-type virus strains,three pairs of specific primers and probes were designed for ASFV p72(B646L)gene,CD2v(Ep402R)gene,and MGF110-9L gene.By optimizing each system,a multiplex qPCR system forsimultaneous identification of p72,CD2v,and MGF110-9L genes was constructed.This methodhas no cross-re-activity with other swine pathogens,Strong specificity;High reproducibility,the sensitivity of thethree target genes of ASFV(p72,MGF110-9L,CD2v)is 10copies/mL;Highlyrepeatable,the intra-groupvari-ationcoefficient was 0.03%0.5%,and the intergroup variation coefficient was 0.04%1.5%;After ver-ifying 50 clinical samples using the method established in this study and the common qPCR method,the re-sults showed that the detection rate of ASFV by the two methods was 70%(35/50),and the consistency rate of50 positive samples was 100%.In summary,the method established in this study provides important mate-rials for the clinical identification of ASFV gene deletion strains and wild-type strains.收稿日期：2 0 2 3-0 2-12；修回日期：2 0 2 3-0 4-12基金项目：国家重点研发计划项目（2 0 2 1YFD1800500，2 0 2 0 YFA 0 910 2 0 0）；海南省科技专项（ZDYF2022XDNY248）；江苏省农业科技自主创新基金项目 CX(21)2038；三亚市南京农业大学研究院指导基金项目（NAUSY-ZD08)作者简介：卓玛（1998-），女（藏），西藏加查人，硕士生，主要从事人兽共患病预防新技术及其病原学基础方面的研究，E-mail：2 0 2 9398 498 q q.c o m。*通讯作者：薛峰（197 1-），研究员，主要从事人兽共患病预防新技术及其病原学基础方面的研究,E-mail:;吴晓东，研究员，主要从事重大外来动物疫病的综合防控技术研究,E-mail:。1090第53卷中国兽医科学Key words:African swine fever virus;gene deletion strain;p72;MGF110-9L;CD2v*Corresponding authors:XUE Feng,E-mail:;WU Xiao-dong,E-mail:wuxiaodongca-非洲猪瘟(ASF)是一种急性、高度传染性的猪病，猪感染后死亡率高，给全球养猪业带来较大经济损失 1。非洲猪瘟于192 1年在肯尼亚被首次确诊，并于1957 197 2 年传人欧洲、美洲；2 0 0 7 年传人欧亚接壤的格鲁吉亚，随后传入俄罗斯并在高加索地区流行；2 0 12 一2 0 18 年传入乌克兰、白俄罗斯、立陶宛、匈牙利等国家；2 0 18 年8 月以来在我国多地陆续发生非洲猪瘟疫情 2 。非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种具有包膜结构的双链DNA(dsDNA)病毒,是Asfarviridae病毒家族里的唯一成员,拥有17 0 194kb的dsDNA基因组 3。虽然ASFV已被发现10 0 多年，但目前仍无安全、有效和完全商业化推广的非洲猪瘟疫苗 4。控制ASF是一项非常重要的任务，关系到一个国家的粮食安全和经济稳定。据报导，目前在疫苗研究中ASFV减毒活疫苗已经被研究者归列为最具有希望的ASFV候选疫苗 5。敲除ASFV的CD2v和MGF这2 个毒力基因可以显著降低ASFV的毒力,免疫猪可部分抵御同血清型ASFV野毒感染 6 ,因此,CD2v和MGF基因缺失株是ASFV减毒活疫苗的重要研究靶点 7 。最近,Ding等 8 研究发现ASFVMGF110-9L的敲除可以有效降低ASFV毒力并能够起到很好的免疫保护效果。据报道，目前在国内流行的非洲猪瘟基因I型病毒缺失株主要为ASFVCN/GS/110分离株与ASFVHLJ/505毒株 9-10 。但是，以ASFVCN/GS/2018分离株MGF110-9L基因作为ASFV野毒株和基因缺失毒株鉴别诊断靶点尚未被研究报道。本研究针对ASFVCN/GS/2018分离株MGF110-9L基因和CD2v(Ep402R)基因缺失部位设计特异性引物和探针，用来鉴别样品中是否缺失相应基因。另外，还筛选出p72保守区作为扩增目标基因,用以区别ASFV与其他病毒。本试验所建立的多重qPCR方法，可实现ASFV野生型与基因缺失型菌株的鉴别,为临床ASFV检测提供了一种重要材料。1材料与方法1.1病毒株、载体和样品ASFVCN/GS/2018分离株、猪细小病毒(PPV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRR-SV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、塞内卡病毒(SVA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪2 型圆环病毒（PCV2),pET-28a载体和50 份临床样品均由中国动物卫生流行病学中心提供1.2引物与探针根据ASFVCN/GS/2018分离株序列，采用BioEdit软件进行核酸序列分析,用SnapeGene在ASFV的3个靶基因(p72、M G F110-9L、CD 2 v)的保守序列处设计特异性引物和探针（表1），合成并纯化。1.3重组质粒标准品的构建与鉴定以ASFV的DNA序列片段作为模板，利用普通PCR扩增相应的目的片段。反应体系：GreenMix12.5L，引物（F、R)各1L，模板2 L，最后用ddH0添加至2 5L。扩增程序：945min,9430s,5230 s,7 2 2 0 s,共35个循环,7 2 10 min。将p72、CD 2 v 和MGF110-9L基因的PCR产物分别进行电泳,并与pClone007载体连接、转化到DH5a中，接种后在氨苄固体培养基上过夜培养，筛选出单个菌落并通过菌液PCR鉴定，送到擎科（南京)生物技术有限公司进行测序,测序正确后命名为pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v 和pClone007-MGF110-9L。提取质粒，用酶标仪测定质粒浓度,用以统计拷贝数。用去离子水将质粒标准品进行10 X连续稀释，使其终浓度为110 1l110 c o p i e s/m L，一2 0 保存备用。1.4多重qPCR条件的优化及标准曲线的构建引物、探针的浓度优化采用方阵法，确定总体系为 2 5 L,其中 2 XPerfectStart II Probe qPCR SuperMix10L,10mol/L引物F和R分别添加0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 L,10mol/L探针P分别添加0.4、0.5.0.6.0.7.0.8L,模板加人6 L（p Cl o n e 0 0 7-p 7 2、pClone007-CD2v和pClone007-MGF110-9L各加 2L),最后用ddHzO补充至2 5L。利用优化完全的引物和探针，对退火温度进行优化，退火温度分别设置为56、58、6 0、6 2、6 4。将 ASFV pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v 和pClone007-MGF110-9L重组质粒标准品原液均制备成310 copies/mL，然后按1：1：1混匀后10 稀释,取7 个梯度浓度(10 copies/mL10copies/mL)重组质粒标准品混合液作为模板，按照优化好的体系和条件进行多重qPCR扩增。1.5特异性试验将 ASFVpClone007-p72,pClone007-CD2v和 pClone007-MGF110-9L重组质粒标准品DNA与PPVPRR-1091卓第9 期玛等：鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立表1引物和探针序列Table 1 Primer and probe sequences引物/探针Primers/probes序列(5-3）Sequences报告基团Reportinggroupp72-FGCTGTAATGGACCTCAAACp72-RCGAAGGGAATGGATACTGAGp72-PCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGTTGCFAMBHQ2CD2v-FCGCGGATCCGACACCACTTCCATACATGCD2v-RCCCAAGCTTCGAGTGGTTGTGTTGAGGGCD2v-PACCATCTCCCAGAGAACCATTACTTCCTVICBHQ1MGF110-9L-FCCGGAATTCTACCAGAATTACCAAGAACCMGF110-9L-RCCCTCGAGCGATGCCATTTTGACAATCCCAMGF110-9L-PAGCATCCTCCTAAGGAGGAGCTTCCATNEDMGB-NFQp72-WOAH-FCTGCTCATGGTATCAATCTTATCGAp72-WOAH-RGATACCACAAGATC(AG)GCCGTp72-WOAH-PCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGFAMBHQ1SV.PRV.CSFV.PEDV.FMDVPDCoV.PCV2.SVA猪病病原核酸作为模板,以去离子水为阴性对照,按已优化好的多重qPCR进行扩增,以测试该方法的特异性。1.6灵敏度试验分别以10 连续稀释的ASFVpClone007-p72、pClone007-CD2v、p Cl o n e 0 0 7-M G F110-9L重组质粒标准品（10 copies/mL10copies/mL)混合液作为模板,以去离子水为阴性对照,进行多重qPCR扩增，以质粒标准品稀释度为横坐标，C值为纵坐标，探究该方法的最低检出限，1.7重复性试验选取3个梯度(10 5copies/mL10 c o p i e s/m L)经10X稀释的pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v 和pC-lone007-MGF110-9L重组质粒混合液为模板，每个梯度做3次平行试验。经多重qPCR扩增后计算组内、组间变异系数，以验证方法的重复性。1.8临床样品验证将由中国动物卫生流行病学中心提供的50 份临床样品提取病毒DNA后，按照上述优化的多重qPCR方法进行扩增，同时以普通qPCR为对照组，比较两种方法的检测结果和阳性样品的符合率。2结果2.1重组质粒标准品的构建及鉴定以ASFVCN/GS/2018分离株的全基因组序列为模板,利用普通PCR扩增目的片段。结果(图1)显示，扩增后获得与预期大小一致的目的基因片段，依次为p72(158bp)、CD 2 v(12 4b p）和MGF110-9L（156 b p）。将目的片段克隆至pClone007载体，送去擎科(南京)生物技术有限公司测序验证。测序成功后，提取质粒并计算拷贝数。测得重组质粒浓度分别为p72(193ng/L),CD2v(172.4ng/L)和MGF110-9L(200ng/L)。经统计,p72、CD 2 v 和MGF110-9L的拷贝数分别为11.410 copies/mL、13.2 10 c o p-ies/mL,3X10ll copies/mL。2.2多重qPCR体系的优化及标准曲线的建立经优化后，确定总反应体系为2 5L：2 Pe r f e c tStart II Probe qPCR Super Mix 10 L,10 mol/L p72-F和p72-R 各 0.4 L,10 mol/L p72-P 0.2 L,10 mol/L C-D2v-F 和 CD2v-R各 0.4 L,10 mol/L CD2v-P0.3 L,10 mol/L MGF110-9L-F 和MGF110-9-R各 0.3 L,10mol/LMGF110-9L-P0.6 L。p C-l o n e 0 0 7-p 7 2、pClone007-CD2v 和 pClone007-MGF110-9L(1:1:1)混合液模板6 L,最后用ddH,O补充至2 5L。扩增温度为6 0,45个循环时,本研究建立的多重qPCR具有良好的扩增曲线。将 ASFV pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v、p Cl o-ne007-MGF110-9L重组质粒标准品连续10 倍稀释后作为模板,经多重qPCR扩增。结果显示，标准曲线分别为pClone007-p72:y=-3.414x+41.461,R2=0.999,EFF=96.3%(图 2 A);pClone007-CD2v:y=-3.278x+42.99,R=0.999,EFF=101%(图2 B);pClo-ne007-MGF110-9L:y=-3.14x+37.086,R=0.998,EFF=106%（图2 C)。结果表明，本研究建立的方法具有良好的线性关系。2.3特异性试验本研究利用已建立的多重qPCR方法对pClone007-p72.pClone007-CD2v和pClone007-MG-F110-9L重组质粒标准品以及其他猪致病病原(PPV、PRRSV、PRV.CSFVPEDVFMDVPDCoVPCV2SVA)的DNA1092第53卷中国兽医科学M1234NM1234NM1234N2.000bp1000bp2.000 bp2000bp1000bp750bp1000bp750bp500bp7506P500bp250bp500bp250bp100bp250bp100bp100 bpABC图1普通PCR扩增Figure 1 PCR amplificationA:p72基因的PCR检测;B:CD2v基因的PCR检测;C:MGF110-9L基因的PCR检测。M:DNA分子质量标准;N：对照(ddH2O);A1A 4:p 7 2；B1B4:CD2v;C1C4:MGF110-9L。A:p72 gene PCR detection;B:CD2v gene PCR detection;C:MGF110-9L gene PCR detection.M:DL2000 DNA Marker;N:ddHO;A1-A4:p72;B1B4:CD2v;C1C4:MGF110-9L.ABC40140140y=3.414x+41.461y=-3.278x+42.99y=-3.14x+37.08635R2=0.99935R?=0.99935R2-0.99830EFE=96.3%30EFE=101%30EFE=106%2525252020值201515151010-10555000024681002468100246810pClone007-p72质粒浓度对数值pClone007-CD2v质粒浓度对数值pClone007-MGF110-9L质粒浓度对数值Logarithmicvalueof the pClone007-p72 plasmidLogarithmic.valueof the pClone007-CD2vLogarithmic.value of the pClone007-MCFi10-concentratoinplasmid concentratoin9Lplasmid concentratoin图2 标准曲线Figure 2Standard curveA:p72质粒标准品；B：CD 2 v 质粒标准品；C:MGF110-9L质粒标准品。A:p72 plasmid standards;B:CD2v plasmid standards;C:MGF110-9L plasmid standards.或cDNA进行扩增。结果（图3)显示，该方法具有良好的特异性，只对pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v和pClone007-MGF110-9L重组质粒标准品扩增出良好的曲线且结果显示阳性外，其他猪病病原核酸均无扩增曲线且结果均显示阴性。2.4敏感度试验本研究将pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v 和pClone007-MGF110-9L重组质粒标准品混合液进行10 梯度稀释后，取8 个梯度（10 copies/mL10copies/mL)进行多重qPCR扩增。结果（图4)显示，该方法具有高度灵敏性特点，最低能检测到10 2copies/mL。2.5重复性试验本研究将ASFVpClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD-2v和pClone007-MGF110-9L重组质粒标准品进行10梯度稀释，取10 7、10%、10 5这3个梯度进行重复性试验,并计算变异系数。结果（表2)显示，该方法的组内平均变异系数在0.0 3%0.5%之间；组间的变异系数在0.0 4%1.5%之间。表明，本研究建立的方法具有良好的重复性。5000045000400003500030000250002000015000210000500034.N00246810121416182022242628303234363840424446循环数Cycle图3特异性试验Figure3Specific tests1:p72基因;2:CD2v基因;3:MGF110-9L基因;4:8 种猪常见病毒性病原（猪细小病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、塞内卡病毒、猪流行性腹泻病毒、猪 delta冠状病毒、猪 2 型圆环病毒）；N：阴性对照（去离子水）。1:Standards p72 gene;2:Standards CD2v gene;3:Standards MGF110-9Lgene;4:PPV,FMDV,PRRSV,PRV,SVA,PEDV,PDCoV,PCV2;N:ddH,O.2.6临床样品验证为验证该检测方法对临床样品的检测情况，本研究将由中国动物卫生流行病学中心提供的50 份临床样品提取病毒DNA后，按上述优化好的多重1093卓玛等：鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立第9 期50000500004500045000AB40000400003500035000300003000025000250002000020000150001500010000410000123456235750001678,N50008.N0002468101214161820222426283032343638404244460246810121416182022242628303234363840424446循环数Cycle循环数Cycle500004500040000C35000300002500020000150002345750008,N002468310121416182022242628303234363840424446循环数Cycle图4灵敏性试验Figure 4Sensitivity testA:p72基因;B:CD2v基因;C:MGF110-9L基因;1 8:p72、CD 2 v、M G F110-9L基因的8 个梯度(10 8 10 copies/mL)。A:p72 gene;B:CD2v gene;C:MGF110-9Lgene;18:Standards p72,CD2v,MGF110-9L gene(10810 copies/mL).表2再现性试验结果Table 2Repeatability test results组内重复性试验(C)组内重复性试验(Ct)质粒标准品模板浓度/(copiesmL-1)Intra-assayCtvalueIntra-assayCvaluePlasmidstandardsTemplateconcentration平均数变异系数/%平均数变异系数/%文土SDCV文SDCV10718.90.060.318.90.020.1pClone007-p7210621.50.080.421.50.040.2105250.10.425.00.010.0410719.00.060.318.90.31.5pC1one007-CD2v10621.50.030.221.50.040.210525.00.10.5250.010.0410718.80.10.518.90.020.13pC1one007-MGF110-9L10621.50.010.0321.50.040.2105250.10.4250.010.04qPCR方法进行扩增。与此同时，设立普通qPCR方法为对照组，结果显示，两种方法均检出35份阳性样品,病毒核酸检出率为7 0%，阳性符合率为10 0%。在检测结果为阳性的35份临床样品中,p72、CD 2 v和MGF110-9L基因的多重qPCR结果均出现扩增,未发现CD2v基因和MGF110-9L基因缺失株。3讨论非洲猪瘟病毒是猪的主要传染病之一，具有跨国跨地区的传播能力，是养猪业的头号杀手 1,该病已造成人类健康和世界农业经济发展的重大公共卫生问题 12 ,当务之急是建立完善的ASFV检测体系，建立快速、精准和超灵敏的检测方法，将病毒杀在传播初期 13-15。已有研究表明，国内ASFV经典毒株和变异毒株并存,其变异株表现为单基因或双基因缺失。因此,ASFV经典毒株与变异株之间的鉴别诊断对于ASFV的净化及流行病学监测具有重要意义。ASFV防控主要依靠生物安全措施，但研制安全有效的ASFV疫苗使免疫猪体得到有效保护,亦是防胡弘博）（责任编辑1094第53卷中国兽医科学控ASFV的一种重要手段 16 。虽然我国ASF得到较好的控制，但疫情未被完全消灭。疫苗作为预防ASFV的重要手段 17 ,经研究者的不懈努力，已取得阶段性成果。虽然暂无有效的疫苗上市，但近期，中国农业科学院兰州兽医研究所郑海学研究员团队发现敲除MGF110-9L基因可以降低ASFV毒力,并提供有效的免疫保护能力8 。由此可见,MGF110-9L基因在未来研制ASFV疫苗中占据重要地位。因此，建立ASFV野毒株和缺失株之间的鉴别诊断方法非常关键。本研究针对目前国内毒株流行情况以及疫苗研制方向，拟建立一种以ASFVp72、CD 2 v 和MGF110-9L基因为靶点的多重qPCR检测ASFV野毒株与基因缺失株的方法，为临床检测ASFV提供更优越的技术手段。参考文献(References)1KIM H,CHO K,LEE S,et al.Outbreak of African swinefever in South Korea,2019J.Transboundary andEmerging Diseases,2020,67(2):473-475.2BIAGETTI M,CUCCIOLONI M,BONFILI L,et al.ChimericDNA/LNA-based biosensor for the rapid detection ofAfrican swine fever virusJ.Talanta,2018,184(2):35-41.3DIXON L,CHAPMAN D,NETHERTON C,et al.African swinefever virus replication and genomics J.Virus Research,2013,173(1):3-14.4ATA E,LI Z,SHI C,et al.African swine fever virus:Araised global upsurge and a 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