焦化污染场地中萘降解菌的分离及降解特性_杨静.pdf

化工进展Chemical Industry and Engineering Progress2023 年第 42 卷第 8 期焦化污染场地中萘降解菌的分离及降解特性杨静1，李博1，李文军2，刘晓娜1，汤刘元1，刘月1，钱天伟1（1 太原理工大学环境科学与工程学院，山西 太原 030024；2 山西交控生态环境股份有限公司，山西 太原 030006）摘要：为从焦化污染场地中分离萘高效降解菌，采用萘作为唯一碳源，通过梯度筛选和富集培养获得一株高效萘降解菌株AO-4。依据形态及16S rDNA基因序列，将其鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。通过PCR验证了菌株基因组中含有萘双加氧酶基因（nahAC）和邻苯二酚2，3-双加氧酶基因（nahH），推测该菌可能是通过水杨酸途径对萘进行降解。在对菌株降解特性分析中发现，菌株AO-4在24h对萘（400mg/L）的降解率达到97.67%，菌株的生长、脱氢酶活性与萘的降解率呈正相关。其次，探究了温度、pH、萘初始浓度和菌量对菌株降解萘的影响，明确最适降解温度为30、pH为5.07.0；在一定范围内，菌株降解效率随着萘浓度和菌量的增大而提高。对该菌株降解多环芳烃（PAHs）的广谱性测试表明，AO-4不仅能有效降解萘，而且对其他PAHs，如芴、菲、蒽和芘在单一和混合体系中均有不同程度的降解，研究结果可为PAHS污染场地的微生物修复提供一定的技术支持。关键词：萘降解菌；多环芳烃；微生物修复；焦化污染场地；铜绿假单胞菌中图分类号：X53 文献标志码：A 文章编号：1000-6613（2023）08-4351-11Degradation of naphthalene by degrading bacteria isolated from coking contaminated sitesYANG Jing1，LI Bo1，LI Wenjun2，LIU Xiaona1，TANG Liuyuan1，LIU Yue1，QIAN Tianwei1(1 School of Environmental Science and Engineering,Taiyuan University of Technology,Taiyuan 030024,Shanxi,China;2 Shanxi Transportation Holding Ecological Environment Limited Company,Taiyuan 030006,Shanxi,China)Abstract:To isolate high effective naphthalene degradation bacteria,a strain AO-4,which could use naphthalene as the sole carbon source by gradient screening and enrichment culture,was obtained from the coking contaminated soil.According to the morphology and 16S rDNA gene sequence,it was identified as Pseudomonas aeruginosa.It was verified by PCR that the strain had naphthalene dioxygenase gene(nahAC)and catechol 2,3-dioxygenase gene(nahH),so the possible degradation pathway of naphthalene might be salicylic acid pathway.In the analysis of the degradation characteristics of the strain,it was found that the degradation rate of naphthalene(400mg/L)by strain AO-4 reached 97.67%in 24h.During the degradation process,the growth and dehydrogenase activity of the bacteria were positively correlated with the degradation rate of naphthalene.The effects of temperature,pH,initial naphthalene concentration and bacterial population on the degradation of naphthalene by the strain were explored.The results 研究开发DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2022-1742收稿日期：2022-09-19；修改稿日期：2022-10-31。基金项目：山西省基础研究计划（自由探索类）（202103021223119）；太原理工大学企业委托项目（RH2000005001）。第一作者：杨静（1996），女，硕士研究生，研究方向为微生物修复技术。E-mail：。通信作者：钱天伟，教授，博士生导师，研究方向为污染场地修复理论与技术。E-mail：。引用本文：杨静,李博,李文军,等.焦化污染场地中萘降解菌的分离及降解特性J.化工进展,2023,42(8):4351-4361.Citation：YANG Jing,LI Bo,LI Wenjun,et al.Degradation of naphthalene by degrading bacteria isolated from coking contaminated sitesJ.Chemical Industry and Engineering Progress,2023,42(8):4351-化工进展，2023，42（8）showed that the optimum degradation temperature was 30 and pH was 5.07.0.Within a certain range,the degradation efficiency of the strain increased with the increase of naphthalene concentration and bacterial population.The broad-spectra property experiments of PAHs degradation showed that strain AO-4 could not only degrade naphthalene effectively,but also could degrade other PAHs fluorene,phenanthrene,anthracene and pyrene in single and mixed systems.The above research results can provide technical support for the bioremediation of PAHs-contaminated sites.Keywords:naphthalene degrading bacteria;polycyclic aromatic hydrocarbons;microbial remediation;coking pullution site;Pseudomonas aeruginosa多 环 芳 烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是由两个或两个以上的苯环组成的一类持久性环境污染物，主要来自于化石燃料的加工和燃烧（如炼焦、燃煤）以及生物质和有机物的不完全燃烧1。PAHs疏水性强、毒性大、难降解及易致癌2，被很多国家列为优先控制的对象。PAHs可在环境中四处扩散，最初以气态形式存在于空气中，经过沉降作用最终进入土壤或水体中3。吸附在土壤颗粒中的PAHs可经农作物富集进入食物链，对人类健康构成了巨大的威胁4。此外，土壤中的PAHs还可再次进入大气和水体，造成二次污染。PAHs污染的一个重要来源是焦化工业5，近年来，随着我国产业结构的变动，大量焦化工业搬迁带来的场地残留污染问题日益突出6。因此，对焦化污染土壤中的PAHs进行治理尤为重要。土壤 PAHs 污染的修复方法主要有物理修复（如热解吸、溶剂萃取等）、化学修复（如光催化、高级氧化等）和生物修复（如微生物修复、植物修复等）7，但传统的物化方法具有成本高、污染物去除不彻底且易造成二次污染等弊端8。近年来，生物修复尤其是微生物修复因其具有成本低、无二次污染并且可原位修复等优点逐渐成为降解PAHs污染的重要手段9。通过微生物的生长代谢，把 PAHs 同化成自身机体的组成部分或者异化成CO2和H2O，最终实现对PAHs的降解。在降解过程中，功能菌群的筛选是微生物降解 PAHs 的关键所在。众多研究人员分离筛选了 PAHs 可降解菌，如假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）和产碱杆菌属（Alcaligenes）等细菌10-15，并进一步研究了其对 PAHs 的降解特性。黄海英等16报道了使用假单胞菌菌株在48h内，对800mg/L萘的最大降解率为 77%；Lyu 等17分离出来的降解菌株Novophingobium pentaromativorans US6.1 能够降解菲、芘、苯并芘，且菌株对菲的降解在24h可达86.62；王岩18从近海的沉积物中分离得到可以高效降解菲、蒽、芘的菌群，降解率可达到91.7。大量研究表明，从不同污染水体、土壤中分离筛选到的降解菌株有各自不同的特点。环境中污染物的降解与降解微生物的生态位情况密切相关，从污染区域中分离出的微生物更能有效利用相应的污染物，对污染物的转化效率明显高于其他来源的微生物19。本研究基于对焦化污染场地中PAHs污染的原位微生物修复需求，从该焦化污染场地中分离出一株高效萘降解菌株AO-4，并对其进行了鉴定，研究了菌株AO-4对萘的降解性能，评估了环境条件（温度、pH、萘初始浓度和菌量）对菌株降解萘的影响，探讨了降解机理，进一步考察了菌株对其他PAHs芴、菲、蒽、芘在单一和混合体系中的降解能力，以期为焦化污染场地中PAHs的生物修复和治理提供理论依据和技术支撑。1 材料和方法1.1 实验材料及仪器1.1.1 土壤样品的采集供试土壤采集于山西省某煤焦化工污染场地，随机采集多个取样点的表层（010cm）土壤，将采集到的土壤样品用2mm土壤筛进行筛分，剔除杂质。充分混匀后，于4冰箱中保存。1.1.2 化学试剂本研究所使用的主要药品：萘、芴、菲等PAHs（纯度大于97%，美国Aladdin公司）；甲醇、乙 酸 乙 酯 等 有 机 试 剂（色 谱 纯，美 国 Fisher Chemical公司）；蛋白胨等非有机试剂（分析纯，上海生工生物工程公司化学试剂）。1.1.3 实验仪器BCV-1FD超净工作台（上海一恒科学仪器有限公司）、LRH生化培养箱（上海一恒科技有限公 43522023年8月杨静等：焦化污染场地中萘降解菌的分离及降解特性司）、Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）、THZ-C恒温振荡培养箱（苏州培英实验设备有限公司）、LS-50H立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）、UV8000S紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）、KH20R高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、Nikon YS100生物显微镜奥林巴斯（中国）有限公司、SC850全自动凝胶成像系统（上海山富科学仪器有限公司）、veriti96 PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司）。1.2 实验方法1.2.1 试剂配置实验用培养基包括LB培养基和MSM无机盐培养基，配方如下。LB 养基：蛋白胨 10.00g/L，酵母膏 10.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH=7.2。MSM 无机盐培养基：K2HPO43H2O 4.25g/L，NaH2PO4H2O 1.00g/L，NH4Cl 2.00g/L，MgSO47H2O 0.20g/L，FeSO47H2O 0.012g/L，MnSO4H2O 0.003g/L，ZnSO47H2O 0.003g/L，CoSO47H2O 0.001g/L，pH=7.07.2。配置时按以上浓度称量，用蒸馏水定容至1000mL，固体培养基配方在此基础上加 15g/L 琼脂，在121、0.103MPa条件下灭菌20min。PAHs的配置：用丙酮作为溶剂配制萘（浓度为 100g/L）、芴、菲、蒽、芘（浓度分别为5g/L）的溶液，通过无菌有机滤头（孔径0.22m）过滤除菌，按所需浓度添加到降解体系中后，待丙酮挥发完毕使用。1.2.2 萘降解菌的筛选取10g污染土壤加入到90mL无菌水中，于温度30、转速130r/min条件下浸取5h，静置30min后，取 5mL 上清液加入到 45mL 以萘（100mg/L）为唯一碳源的萘选择性液体 MSM 培养基中，在30、130r/min的恒温振荡培养箱中避光培养7d，然后再次转接到新鲜的萘（150mg/L）选择性液体培养基中继续培养，如此重复。经7个周期驯化培养，逐步将萘的浓度提升至400mg/L后，取适量富集培养液，梯度稀释后涂布在含萘（400mg/L）的选择性固体培养基平板上，置于30生化培养箱中；待菌落长出后，挑取菌落大小及形态显著的单个菌落在含萘选择性固体培养基上进一步纯化，直至得到形态单一的纯菌种。1.2.3 萘降解菌的鉴定1.2.3.1 革兰氏染色鉴定 取少量活化后的菌液，滴加在干净的载玻片上干燥固定后，滴加草酸铵结晶紫染色液染色2min，立即倾去染料，用细流蒸馏水冲洗直到流水为无色。再在涂菌区域滴加适量的革兰氏碘液，作用1min后倾去多余的碘液，最后用水流冲至流出液为无色。用吸水纸吸去载玻片上多余的水分，滴加体积分数为95%乙醇脱色30s左右至流出液为无色，接着用蒸馏水冲去乙醇后吸干，番红复染3min，水洗并使之干燥。在显微镜下用100倍油镜观察经染色的菌落颜色。1.2.3.2 16S rDNA扩增及测序鉴定 将纯化的单菌落接种到LB液体培养基中扩大培养，取新鲜菌液用细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。用通用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 1492R(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)扩增其 16S rDNA 基因序列。PCR 体系为：Super Mix 20L、ddH2O 12L、通用引物27F(10mol/L)1L、通用引物 1492R(10mol/L)1L、模板 DNA 6L。扩增条件为：94、30s，55、30s，72、90s，35个循环。将PCR扩增得到的产物送至北京六合华大基因科技有限公司测序，测序结果在 NCBI 的Genbank 数据库进行序列同源性比对，用 MEGA 7.0 进 行 同 源 性 分 析，依 据 邻 接 法（neighbor joining）构建系统发育树，确定萘降解菌AO-4的种属。1.2.4 萘降解途径中的部分关键酶基因的PCR扩增选取萘降解途径中的关键酶萘双加氧酶的铁硫蛋白大亚基基因 nahAC20、水杨醛脱氢酶基因nahF21、水杨酸羟化酶基因nahG22及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因nahH23进行PCR扩增与鉴定。引物序列如下。nahAC：5-TGGCGATGAAGAACTTTTCC-35-AACGTACGCTGAACCGAGTC-3nahF：5-GGAGACATCATATGAAGACAAAACTGTTTATCAAT-35-CCAATAAGCTTGAAGGGATATTGCTCGAA-3nahG：5-GGAGACATCATATGAAAAACAATAAACCTGGCTTCG-35-CCAATCTCGAGCCCTTGACGTAGCACACCG-3nahH：5-GAATAGGTGATTTCATGAACAA-3 化工进展，2023，42（8）5-TTAGGTCATAACGGTCAT-31.2.5 萘降解菌对PAHs（萘、芴、菲、蒽、芘）的降解体系将处于对数生长期的AO-4菌液（OD600=1）按一定体积接种至含特定浓度的萘、芴、菲、蒽、芘MSM培养基中，于温度30、转速130r/min条件下摇床避光培养，定时取样，按需测定菌体浓度OD600、培养液中PAHs含量及菌体脱氢酶活性，实验设置三组平行试样，并设置无菌组作为空白对照。1.2.6 环境单因素对萘降解的影响本研究以降解率作为考察指标，研究环境因素包括温度、pH、萘初始浓度和菌种接种量对萘降解的影响，培养条件均在30、130r/min的摇床避光培养。设置体系的不同温度分别为10、20、30、40，将处于对数生长期的菌液按2（体积分数）的接种量接种至含有 20mg/L 萘的无机盐培养基（pH=7.0）中，定时取样测定不同温度下菌株AO-4对萘的降解率。调整体系的初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将处于对数生长期的菌液按2（体积分数）的接种量接种至含有20mg/L萘的无机盐培养基中，定时取样测定不同初始pH下菌株AO-4对萘的降解率。选取小于萘在水中溶解度的浓度（1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L），将处于对数生长期的菌液按2（体积分数）接种量接种至含有以上浓度的萘的无机盐培养基（pH=7.0）中，定时取样测定菌株AO-4对不同浓度的萘的降解率。将处于对数生长期的菌液分别按0、1%、2、5%的接种量（体积分数）接种至含有20mg/L萘的无机盐培养基（pH=7.0）中，定时取样测定不同接种量下菌株AO-4对萘的降解率。1.2.7 PAHs浓度的测定及降解率计算试样用等体积的乙酸乙酯萃取，在振荡器上通过1500r/min转速振荡5min后超声萃取10min，再经10000r/min转速离心5min后可分离有机相和水相，用0.22m孔径的有机滤膜过滤乙酸乙酯萃取液后，利用高效液相色谱仪（HPLC）测定各PAHs的浓度，HPLC测试条件：ZORBAX Eclipse PAHs色谱柱，紫外检测器，柱温30，流动相为甲醇和水，流速1mL/min，进样量20L，检测波长220nm。降解率的计算依据式(1)。=C0-CtC0 100%(1)式中，C0为PAHs的初始浓度，mg/L；Ct为反应t时间后PAHs的浓度，mg/L。1.2.8 脱氢酶活性的测定通过测定微生物的脱氢酶活性可以了解微生物对有机污染物的氧化分解能力，按照文献24方法：在具塞试管中，加入降解后的培养液、Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.5、0.05mol/L）、葡萄糖溶液（0.10mol/L）、TTC（质量分数为0.5%）各2mL，置于30恒温培养箱中避光反应。反应4h后，加入400L浓硫酸中止反应，并加入 5mL 甲苯，1500r/min振荡10min进行萃取。待反应生成的红色三苯基甲臜（TF）被完全萃取到有机相时，将有机相在4000r/min下离心5min，过滤后测定滤液于486nm处的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脱氢酶活性。2 结果与讨论2.1 萘降解菌的筛选及鉴定通过增加环境选择的压力，逐步提高萘的浓度对菌种进行驯化、筛选，分离到一株萘的高效降解菌株 AO-4。菌株在萘选择性培养基中的生长良好，验证了其以萘作为唯一碳源生长的能力，表明其可用于含萘污染物的生物修复。AO-4菌株在含萘的MSM固体培养基上菌落呈乳白色，扁平状，边缘不整齐，大小不一，平均直径约为2.03.0mm图1(a)。显微镜下可见菌体为杆菌，长约 1.53.0m，宽约 0.50.8m，革兰氏染色后呈红色，为革兰氏阴性细菌图1(b)。杆状细菌在污染物的微生物降解中非常常见25-27，因为在富集培养过程中，杆菌比球菌能更好地适应环境，可高效利用一些致密颗粒（如PAHs），比球菌分裂更快而成为优势菌群28。通过16S rDNA测序及Genbank数据库序列比对，发现菌株AO-4与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的同源性最高，序列相似度达到99.9%。采用邻域连接法构建了系统发育树（图2），显示菌株 AO-4 与多株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有高度同源性。已有众多研究证明，铜绿假单胞菌对多种 PAHs 具有较强的降解能力29-30，如Patowary等31发现铜绿假单胞菌在35和pH=7条件下，对0.3%的萘降解率可达89.2%。综上，依据菌株 AO-4 的形态特征以及分子 43542023年8月杨静等：焦化污染场地中萘降解菌的分离及降解特性生物学鉴定结果，将菌株 AO-4 鉴定为铜绿假单胞菌，此菌株 16S rDNA 序列已提交到国家微生物科学数据中心（DOI：http:/dx.doi.org/10.12210/sequence.NMDCN00011F3）。2.2 萘降解途径关键酶的基因检测假单胞菌对萘的降解通常是通过水杨酸途径完成的32。萘经萘双加氧酶催化开环形成顺-萘双氢二醇后，在脱氢酶的催化下形成1,2-二羟基萘，再经过一系列反应生成水杨醛，随后经水杨醛脱氢酶作用形成水杨酸，水杨酸在水杨酸羟化酶催化下形成邻苯二酚，通过邻苯二酚2,3-双加氧酶开环后被转化为乙醛和丙酮酸进入三羧酸循环，最终被降解为H2O和CO233。选取了萘经水杨酸代谢途径降解的关键酶基因：萘双加氧酶的铁硫蛋白大亚基（nahAC）、水杨醛脱氢酶（nahF）、水杨酸羟化酶（nahG）和邻苯二酚2,3-双加氧酶（nahH）分析菌株对萘可能的降解途径。以菌株AO-4染色体为模板进行上述四种基因的特异性扩增，凝胶电泳图（图3）上可见 nahAC 和 nahH 在 7501000bp 位置均出现明显条带，与文献中假单胞菌的nahAC20（1009bp）、nahH23（923bp）基因大小基本一致，可基本判断AO-4的基因组中含有nahAC、nahH两个基因。在AO-4的基因组中未检测到基因nahF和nahG，一方面这可能是由于该菌株对污染物萘的降解有别于已知的降解途径；另一方面有研究表明34，PAHs的部分降解基因位于菌株的质粒上，此处未对菌株的质粒DNA进行扩增，这可能是nahF和nahG这两个基因未被检出的原因。先前研究表明所有的萘降解菌都含有nahAC基因35，通过对萘降解途径中的关键酶基因（nahAC、nahH、nahF和nahG等）进行检测，可以初步筛选萘降解菌株、判断菌株的萘降解途径32，但对降解途径的进一步探究还需对中间产物进行检测。图1菌株AO-4的菌落形态(a)及革兰氏染色后细胞形态(b)图2基于菌株AO-4的16S rDNA基因片段序列构建的系统发育树 化工进展，2023，42（8）2.3 菌株AO-4对萘的降解性能研究考察了菌株AO-4在液体中对萘的降解能力，萘浓度为菌株驯化的最高浓度400mg/L，体系的pH为7.0，接种菌量为2%（体积分数）。在降解过程中监测了菌株AO-4的生长曲线、萘的降解率和菌体脱氢酶活性随时间的变化，结果如图4所示。从菌株生长曲线图4(a)可以发现，菌体浓度随时间变化逐渐增大，在24h OD600达到0.325后增长速度减缓，菌株生长经历了适应期、对数期后将进入稳定期。菌株AO-4在以萘为唯一碳源的无机盐培养液的生长再次验证了菌株 AO-4 代谢萘的能力。菌株AO-4对萘的降解率图4(b)在反应开始的8h内略有增长，在824h之间400mg/L的萘近乎被完全降解，24h时萘的降解率达到97.67%，48h降解完全。这与菌株生长曲线变化趋势相近，824h期间，菌株迅速生长，降解率快速攀升；24h后菌株处于稳定期，代谢过程缓慢。高秀荣等36在研究玫瑰色红球菌对芘降解特性时，也有类似现象，菌株在8d降解率达到47%后，816d时菌株处于稳定期或衰亡期，降解率无明显变化。脱氢酶活性图4(c)在前8h升高比较缓慢，824h 迅速升高，在 24h 后仍有缓慢增长的趋势。PAHs的降解是基于PAHs的氧化，降解过程中脱氢酶可以使PAHs的氢原子活化并转移至特定的受氢体，使PAHs被氧化37。脱氢酶活性可在一定程度上反应微生物对有机污染物的氧化降解能力。以上结果表明菌株AO-4可有效利用400mg/L萘作为碳源生长，菌体的脱氢酶活性，菌株生长情况与萘的降解率表现出正相关。2.4 菌株AO-4降解萘的影响因素污染物的微生物降解是基于菌体生长代谢的活性来消耗利用底物，与菌体的生长情况密切相关。此实验探讨了菌株培养条件：温度、pH、萘的初始浓度和接种量对萘降解效果的影响。2.4.1 温度对菌株AO-4降解萘的影响温度是影响微生物体内物质代谢过程的一个重要环境因素。温度可以通过影响微生物酶的活性来调节体内酶促反应的速率，温度还会影响底物的生物利用性能。在适宜的温度范围内，生物体的代谢速率较快，可迅速地降解外源物质。温度单因素对AO-4降解萘的影响如图5所示，菌株AO-4对萘的降解随温度升高而加快。反应开始的 10h 时内，0102030405000.10.20.30.40.5OD600培养时间/h萘400空白对照(a)菌体生长曲线(OD600)01020304050020406080100降解率/%培养时间/h010203040500.20.40.60.81.0OD486培养时间/h萘400空白对照(b)萘的降解率0(c)脱氢酶活性(OD486)萘400空白对照图4菌株AO-4对萘的降解特性图3萘降解途径中的部分关键酶基因nahG、nahF、nahAC和nahH的PCR扩增结果M分子标记；0阴性对照；AO-4萘降解菌 43562023年8月杨静等：焦化污染场地中萘降解菌的分离及降解特性10条件下菌株AO-4对萘的降解率仅为19.01%，随着温度升高降解率在 30达到最高为 97.89%；在温度达到 40时略有降低，降解率为 93.92%。这可能由于在一定温度范围内，微生物的酶活性随着温度的升高而增大，加速了萘的降解。菌株最适降解温度为30，而40超过了菌株的最适生长温度导致降解略有减缓之势。反应24h后，1040条件下萘近乎完全被降解，说明菌株AO-4可以较好的适应1040的温度，能有效降解萘污染物。在实际污染场地土壤生物修复应用中可适应冬夏季的温度差异，具有较好的应用价值。2.4.2 pH对菌株AO-4降解萘的影响微生物在一定pH范围内可以正常生长代谢消耗底物。为使体系中的萘更好地被菌株降解，选取了5个pH，研究了pH对该菌降解萘的影响。实验选取了低于萘溶解度（34mg/L）的20mg/L的萘浓度进行影响因素的测试。图6(a)为培养24h时AO-4对萘的降解结果，可以看出，在pH在4.09.0的范围内，菌株AO-4对萘均有不同程度的降解，该菌株对pH环境具有良好的适应性。培养24h时，pH为5.07.0的降解率可达到98%以上，pH在4.0和9.0的降解率相对较低，分别为74.78%、73.63%。菌株AO-4在pH为5.0到7.0范围内降解效果较好，过高或过低的pH会导致降解率下降。这可能是因为在酸性或碱性条件下细胞膜上的电荷发生变化，会影响菌株对底物的吸收转化，导致微生物生长代谢速度减慢，同时pH会影响微生物酶的空间构象，使酶变性失活，影响菌体代谢38。有研究表明39施氏假单胞菌YC-YH1在中性pH范围对萘的降解率接近100%，而在pH5.0和9.0时的降解率仅为20%左右。在pH为5.07.0范围内，由图6(b)可以看出，萘的降解率均随反应时间延长逐渐提升，在24h时对萘的降解近乎完全。2.4.3 萘初始浓度对菌株AO-4降解萘的影响在以萘为唯一碳源的培养基中，萘的浓度会影响菌体的生长，进而影响其生物降解效果40。萘浓度过低会因碳源不足延缓菌体的生长，而萘作为一种含有苯环的有机化合物，浓度过高会对菌体产生毒害作用41。在温度为 30，菌量投加量为 2%，pH=7.0的条件下，研究了菌AO-4对不同萘浓度的降解效果，以明确污染物初始浓度对菌株AO-4降解萘的影响。为了排除萘溶解过程的干扰因素，实验选取了低于萘溶解度（31mg/L）的浓度1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L进行实验。结果如图7所示，在5mg/L、10mg/L、20mg/L萘浓度下，萘的降0510152025020406080100降解率/%培养时间/h40302010图5菌株AO-4在不同温度条件下对萘降解的影响01020304050607002040608010020mg/L10mg/L5mg/L1mg/L降解率/%培养时间/h图7菌株AO-4对不同初始萘浓度的降解456789020406080100pH(a)培养24h时AO-4对萘的降解0510152025020406080100培养时间/hpH=5pH=6pH=7降解率/%降解率/%(b)最适pH下AO-4对萘的降解图6菌株AO-4在不同pH条件下对萘降解的影响 化工进展，2023，42（8）解率随时间变化在8h内迅速增长后逐渐趋于平稳。67h时萘浓度为1mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L的降解率分别为57.01%、83.76%、84.75%和96.77%。由此可见，在该体系中萘作为菌株生长的唯一碳源，1mg/L的萘浓度会延缓菌体的生长，因菌体生物量不足而使降解率偏低。而萘浓度的升高可促进萘向细胞内的扩散，提高其生物利用度，有助于萘的转化降解。2.4.4 接种量对菌株AO-4降解萘的影响降解菌的生物量是影响微生物对污染物降解的重要因素，较高的生物量可使得更多的降解菌参与污染物的降解，加快降解进程42。本文研究了菌株接种量为0、1%、2、5%（体积分数）对萘降解的影响。如图8(a)所示，在没有接种菌的情况下，萘的降解率在1h达到34.49%后基本保持平稳，这可能是由于萘的自然降解及挥发所导致，萘会按照一定比例向自由相扩散，而所测定的萘均为溶解态的萘。在培养0.5h内，接种菌量未对萘的降解造成明显影响。因为培养时间较短，菌体尚未进入生长对数期。反应1h后，菌量因素对萘降解产生明显影响。随着接种量的增大，萘的降解率逐渐提高。培养3h时，接种量为1%、2%、5%菌株对萘的降解率分别为46.02%、50.31%、54.5%。如图8(b)所示，在12h内，接种量为1%、2%和5%的降解率依次为56.37%和64.90%和73.66%。24h后，各组细菌降解率均达到96%以上，基本完成了对萘的降解。由此可见，在该体系中，加大降解菌接种量会在短期内（12h）加速对萘的降解，经过一定时间当菌体繁殖达到一定菌量后，接种量对污染物降解的影响不明显。因为按照微生物正常生长曲线，菌体经过对数期的迅速繁殖后将进入平稳期，菌体受限于环境及培养基不会无限繁殖，菌量将保持平稳。2.5 菌株AO-4对PAHs降解的广谱性2.5.1 菌株AO-4对单一PAHs的降解实际污染场地通常涉及多种PAHs的污染，为探讨菌株降解的广谱性，进一步测试了该降解菌AO-4对其他4种常见PAHs芴、菲、蒽和芘各自的降解能力。实验中5种污染物萘、芴、菲、蒽和芘的初始浓度各为 50mg/L（各体系污染物浓度为50mg/L），体系 pH 为 7.0，菌量为 5%（OD600=1）。菌株AO-4对不同PAHs的降解率见图9，菌株对5种污染物有不同程度的降解。萘的降解率在24h达到 99.85%，菲、芴、芘和蒽的降解率分别为23.94%、18.16%、7.44%和 2.47%，反应至 5d 时，萘、菲、芴、芘和蒽降解率分别达到100%、33.13%、24.70%、14.84%和7.30%，表明该菌可不同程度降解萘、菲、芴、芘和蒽。PAHs的生物降解与污染物的结构密切相关，萘含有2个苯环，芴和菲同属于3环的PAHs，但芴的两个苯环中间含一个5环的稠环芳烃43，难于降解，所以对萘的降解率高于菲，对芴的较低。高闯等44研究也发现铜绿假单胞菌对菲的降解率高于芴，84h后对50mg/L的芴、菲的降解率分别为23.47%、34.83%。随着苯环数量的增加，PAHs 的降解难度增大45。芘为 4 环的0123020406080100培养时间/h01%2%5%(a)培养3h不同接种量对萘的降解0510152025降解率/%020406080100降解率/%培养时间/h(b)培养24h不同接种量对萘的降解01%2%5%图8菌株AO-4在不同接种量条件下对萘降解的影响012345020406080100降解率/%培养时间/d萘芴菲蒽芘图9菌株AO-4对单一体系PAHs（萘、菲、芴、芘和蒽）的降解 43582023年8月杨静等：焦化污染场地中萘降解菌的分离及降解特性PAHs，比3环的PAHs难降解。Zhang等46研究了铜绿假单胞菌DQ8对PAHs的降解特性，发现DQ8可有效降解 3 环和 4 环的 PAHs，且 4 环 PAHs 比3 环 PAHs 更难降解；且在四种 PAHs（芴、菲、蒽、芘）混合体系中，菲和芴可在7d内被完全降解，但蒽和芘在12d之内分别只被降解了40.50%和34.50%。菌株AO-4对蒽的降解率较小，可能是因为蒽在水中的溶解度较小，导致其生物利用度较低。2.5.2 菌株AO-4对混合PAHs的降解环境介质中的PAHs多以混合形式存在，考察菌株对混合 PAHs 的降解效果具有重要的现实意义。菌株AO-4对混合PAHs的降解效果如图10所示。5种污染物萘、芴、菲、蒽和芘的初始浓度均为50mg/L（总体系污染物浓度为250mg/L），体系pH为7.0，菌量为5%（OD600=1）。由图可知，菌株对混合的5种污染物有不同程度的降解。萘的降解率在1d达到99.54%后保持平稳，芴、菲、蒽和芘的降解率分别为8.79%、5.14%、1.55%和0.06%；发现菌株AO-4优先以萘为碳源，萘的降解主要发生在1d内，而其他PAHs的降解率随着PAHs环数的增加而下降，说明菌株AO-4优先以低环PAHs为碳源。张娟琴等47研究菌株 B5 降解混合 PAHs（萘、蒽、芘）时也发现类似现象，萘在混合体系中72h降解率可达99.13%，而对蒽和芘的降解率分别为87.25%、75.07%。反应至5d时，芴、菲、蒽和芘降解率分别为20.95%、18.28%、4.75%和4.44%，均低于单一体系。这可能是因为PAHs种类和浓度的增加显著抑制了降解菌的活性。高秀荣等36也有类似发现，菌株Q3对单一底物菲、芘和苯并a芘降解率可达到98%、47%和65%；而对混合PAHs中的菲、芘和苯并a芘降解率仅为57%、29%和33%。卢晓霞等48研究了单一菌株在16种PAHs混合物初始总量分别为17g/mL和166g/mL时的生长情况，发现菌株在低浓度的PAHs中生长良好，能降解低环PAHs，而在高浓度的PAHs中菌株的生长和活性受到了抑制。经过5d的降解，混合体系菌株AO-4对5种PAHs降解能力大小顺序为萘芴菲蒽芘，这可能与 PAHs 在水中的溶解度相关，水溶性越好的PAHs更易被生物利用。萘为2环PAHs，芴为3环，25其在水中的溶解度分别为 31mg/L、1.69mg/L。菲与蒽均为 3 环 PAHs，且为同分异构体，但蒽为线性分子，菲是角性分子，一般来说角性分子比线性分子在水中的溶解度大，25时菲和蒽在水中的溶解度分别为1.15mg/L和0.04mg/L49，导致在混合体系中菲比蒽更容易被利用。芘为4环PAHs，随着环数的增加，其疏水性和毒性比其他四种PAHs更大。Sharma等5