动物细胞培养.doc

. 动物细胞培养第一章1.1动物细胞培养基本概念动物细胞培养技术：从机体中取出组织或细胞或利用已建立的细胞系（株），在待定的人工条件下使细胞在培养容器中生长或生产生物制品的一门技术。细胞培养泛指所有的体外培养。体外培养（culture in vitro）是指将活体结构成分（如活体细胞、活体组织、活体器官等）甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，置于类似于体内生存环境的体外环境中生长和发育的方法。就培养物而言，体外培养分为细胞培养、组织培养和器官培养。细胞培养（cell culture）是指在体外条件下，用培养液维持细胞生长与增殖的技术。组织培养（tissue culture）是指从机体分离出的组织或细胞在体外人工条件下培养生长的技术。器官培养（organ culture）指的是将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培养，即仍保持组织的三维结构，并模仿在各种状态下的器官功能。体外培养优点：理化环境可精确调控，生理条件相对恒定；对于同一来源的组织样品，随着传代进行，细胞系逐渐趋于均一；培养过程经济有效且可规模化；可模拟细胞体内环境。体外培养局限性：对操作者的专业技术技能要求高；能获得的细胞量较少（实验室：1-10g细胞/批，企业：100g细胞/批）；培养过程中易出现细胞去分化和选择性培养的现象；在传代培养中需对细胞进行鉴定并调节培养条件；培养细胞的不稳定性（染色体组成不稳定、去分化、转化等）。体内外培养细胞的差异和原因：体内外培养的差异：功能差异：在体外培养条件下，细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功能，即细胞分化特性减弱或不显。生长和增殖差异：细胞在生长方式、移行方向、增殖能力等方面改变。体内细胞所处微环境：由细胞本身、支持细胞胞外基质、可溶性分子、用力、毛细血管以及神经等要素构成，调控着细胞在体内的命运。体内外培养细胞的差异的原因：失去体内神经系统和内分泌系统对功能细胞的调节作用；丧失支持细胞与功能细胞的相互作用；缺少支持物（细胞外基质）对功能细胞的作用；改变功能细胞生长繁殖的三维几何空间环境；缺乏功能细胞生长繁殖所需的应力等物理因素。需要理解和认识细胞特性和所处的微环境，通过优化细胞外培养环境，使细胞更好地生长、实现功能，生产生物制品。1.2现代动物细胞培养技术的建立结论：离体的动物组织在培养条件下具有近乎无限的生长和繁殖的能力，组织培养是研究组织和细胞的极好方法。培养技术：胰酶消化建立细胞系单层细胞单细胞分离培养克隆细胞株灌流小室更新培养基间歇换液培养灌注培养培养装置：卡氏瓶试管培养瓶滚瓶反应器培养基：天然培养基人工合成培养基含血清培养基无血清培养基低蛋白、无蛋白培养基1.3动物细胞培养的产品细胞培养可以：生产细胞因子、酶、抗体等蛋白制品；生产病毒疫苗、病毒载体等；生产干细胞、成体细胞或组织等制品；体外分析、药物筛选等模型和基础研究。动物细胞表达药物成为生物医药发展主流投放市场以及临床中试的重组蛋白有70%由哺乳动物细胞培养表达。治疗性抗体药物均采用动物细胞大规模培养方式生产。国内疫苗生产现状：生产方式：滚瓶机 细胞株：鸡胚或原代细胞 培养基：需添加10%血清缺点：批量小、批间差异大、质量不稳定、劳动强度大、占用场地多、效率低等工程化组织体外构建中存在的问题：构建过程中需要手工操作；培养条件无法控制；过程参数无法检测；对组织构建过程中环境要求知之甚少；过程放大受到限制严重制约组织工程产品研制及未来规模化工业化生产第二章2.1细胞成分和化学环境人体的细胞组成：据统计，成人有机体大约有1014个细胞，刚出生的婴儿大约有1012个细胞；1g哺乳动物的肝或肾组织大约有2.53亿个细胞；人体中大约有200多种不同类型的细胞，根据其分化程度可分为600多种，它们的形态结构与功能差别都很大，但是都是由一份受精卵通过分裂与分化而来；大多数细胞在培养时大约直径在12-18m；某些类型的干细胞相当小，且只有少量的细胞质；与此相反，在肝脏内的某些细胞（如肝细胞）是相当大，平均直径为20m的细胞。案例一：MSCs群体大致可分为两种：（1） RS细胞：形态细态（7m），增殖迅速，扩增能力较弱，克隆形成能力高；（2） 成熟干细胞：形态宽大，扩增能力较弱，不具克隆形成能力。案例二：从骨髓里分选出very small embryonic-like stem cells（VSELs）直径：VSELs:3.630.09 m，HSCs:6.540.17 m；核/质比：VSELs：1.5，HSCs：0.8细胞质面积：VSELs：6m2，HSCs：35m2水：占尽80%；蛋白占1020%。碳水化合物是细胞物质和能量基础，形成能量代谢的中间体，作为核苷酸一部分，组成糖蛋白，糖脂等，游离的碳水化合物较少脂组成细胞各种生物膜（细胞膜和细胞内膜）哺乳动物细胞单倍体基因组的大小是约3Gbp，对二倍体细胞而言相当于约5pg的DNA；RNA比DNA更丰富，包括mRNA、rRNA（占RNA90%以上）及其他RNA。胞内和胞外流体中离子浓度血浆（mmol/L）间液（mmol/L）胞内（mmol/L）Na+14014K+44140Ca2+1110-4Mg2+0.80.720Cl-11011050细胞质中存在的所有矿物质占细胞干重约5%。一些离子在胞内与胞外的浓度差别很大，这些浓度梯度是维持细胞功能的关键。钾离子和钠离子在细胞膜两侧有十倍以上的浓度差，且浓度梯度呈相反方向，钾离子浓度远高于胞外，而钠离子浓度远高于胞内。胞内钙离子浓度较低总渗透压大约280mOsm，培养基的渗透压应与此处与同一水平，避免产生渗透压差。2.2细胞结构与功能2.2.1细胞膜结构：磷脂双分子层；成分：膜脂+膜蛋白流动镶嵌模型：膜的流动性，蛋白质和膜脂均可以侧向运动；膜的不对称性，蛋白质分布不对称。构成磷脂双分子层成分：磷脂（35-70%）；三种含甘油骨架：磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰胆碱；一种以丝氨酸为骨架：糖脂（10%），胆固醇（30%）。构成磷脂双分子层成分：磷脂：磷脂极性头、磷脂非极性尾（一个饱和的脂肪酸、一个顺式不饱和（C14-C24）脂肪酸）非极性尾作用：饱和脂肪酸允许更紧密的装填，不饱和脂肪酸双键创建了扭结，降低了装填密度，增加了流动性。糖脂：含糖而不含磷酸的脂类；神经细胞膜上神经节苷脂质含量较高，含有唾液酸；红细胞表面ABO血型糖脂。胆固醇：提高脂双层的力学稳定性，调节脂双层流动性，降低水溶性物质的通透性；细胞膜中胆固醇的含量较高，但细胞期末中非常低。膜蛋白：脂质：蛋白质=50:50（w/w），50:1（mol/mol）膜中蛋白质含量受组织来源、膜功能影响较大，具代谢活性的线粒体在其膜中含有75%（质量比）蛋白。蛋白分子以不同形式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，膜蛋白赋予生物膜功能，尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白；各种化学物质、电势、氧化还原电位跨膜梯度的维持是通过不同的膜蛋白完成的。膜的流动性：磷脂双分子层可处在凝胶状态或液晶状态影响膜流动性的因素：温度：温度降低，磷脂双分子层从液晶变为结晶态（或凝胶态）；脂肪酸：短链的、不饱和脂肪酸含量较高时增加了磷脂双分子层的流动性，并降低他的相转变温度；胆固醇：其作用是多方面的，与磷脂作用增加稳定性；是磷脂相互分开，防止磷脂由液相变为固相，促进流动；卵磷脂/鞘磷脂：该比例高，则膜流动性增加，是因为鞘磷脂的相变温度高于卵磷脂；其他因素：膜蛋白和膜脂的结合方式、温度、pH、离子强度等。细胞膜的功能：细胞功能区域化：为细胞生命活动提供相对稳定内环境；选择性物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接；质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。细胞膜与物质运输：大多数生物分子不能自由地进出细胞，即使是小分子的营养物质（如葡萄糖和氨基酸）无法迅速通过细胞膜以支持细胞生长；营养物质通过细胞膜需要特定的载体蛋白；细胞膜处于动态变化之中：细胞生长；膜更新，替换被氧化或损坏的脂分子；膜囊泡转移；分泌和内吞。磷脂双层膜是一种非共价结合的聚合物，由磷脂组装而成，因此，可以自由活动：迅速地扩大、缩小、断裂、融合细胞膜动态平衡：膜循环以维持平衡小结细胞膜磷脂双分子层特性：磷脂双分子层是流动的，其流动性受温度、脂肪酸和胆固醇等因素影响；磷脂双分子层由磷脂、糖脂、胆固醇和蛋白构成；磷脂具四种类型结构，以甘油丝或丝氨酸为骨架；细胞膜处于动态变化之中。2.2细胞质细胞质中含有：各种细胞器和高粘度的的胞质液；胞质液中有可溶性的高浓度蛋白质（100-300mg/ml）、无机物、中间产物和代谢产物等；蛋白聚集体（像丙酮酸脱氢酶和核糖体）；细胞骨架网络分布在细胞质中。蛋白聚集体、酶的复合体、细胞骨架蛋白和细胞器使细胞质中显得非常拥挤，溶质非常稠密。细胞质功能：蛋白质和脂肪合成的重要场所，细胞内所有蛋白质合成的起始步骤都发生在细胞质基质的游离核糖体上；细胞与环境、细胞质与细胞核以及细胞器之间的物质运输、能量交换、信息传递等都要通过细胞质基质来完成；很多重要的中间代谢反应也发生在细胞质基中，糖酵解、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径、糖原的合成与部分分解过程等；进行蛋白质修饰（磷酸化、糖基化、甲基化、酰基化）、泛素化和蛋白酶体介导的选择性降解、由热休克蛋白帮助蛋白质正确折叠。2.2.3细胞核细胞和功能：遗传物质储存和复制的场所，细胞遗传性和细胞代谢活动的控制中心；核基质中DNA复制和转录成mRNA，转录因子核转录调控因子在细胞质中合成，然后被运送到细胞核中发挥作用；核被膜构成细胞核和细胞质之间的天然选择性屏障，核孔功能进行核质之间的物质交换与信息交流；核仁是核糖体的生物发生场所。包括rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配，随后运送到细胞质参与蛋白质合成。核型与染色体显带核型：指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色体数目、大小、形态特征的总和；核型模式图：讲一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。染色体显带技术表观遗传修饰：表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传学的主要研究内容：基因转录过程的调控：DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色体重塑、基因沉默和RNA编辑基因转录后的调控两部分：基因组中的非编码RNA、微小RNA（miRNA）、反义RNA（antisence RNA）、核糖开关（riboswitch）等表观遗传修饰组蛋白修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，调控基因转录中发挥着复杂的作用；DNA CpG岛的甲基化，DNA甲基化主要是一直基因转录miRNAs的作用2.2.4线粒体细胞中数量醉倒的细胞器（大约1700/cell），占细胞总体积的20%，人体内的细胞每天合成的数千克ATP大约95%由线粒体产生超微结构：线粒体是由两层单位膜套叠热诚的封闭的囊状结构。一般呈粒状或杆状包括四个功能间隔：外膜、内膜、膜间隙、基质线粒体的主要功能：氧化磷酸化；合成ATP；为细胞的生命活动提供能量。糖、脂肪 细胞质 丙酮酸和脂肪酸 线粒体 乙酰CoA（三羧酸循环）氢通过电子传递链到达氧生成水，同时ADP磷酸化生成ATPNADH氧化泵出质子是逆质子和电荷梯度，而质子运动驱动ATP合成是顺质子和电荷梯度方向小结线粒体线粒体是由两套单位膜组成的封闭的囊状结构通过氧化磷酸化合成ATP，为细胞的生命活动提供能量；2.2.5内质网内质网由封闭的管状或扁平囊状系统及其包被的腔形成互相沟通的三维网络结构内质网通常占细胞膜系统的一半左右内质网两种基本类型：粗面内质网（rER）和光面内质网（sER）ER的功能：ER是细胞内蛋白质与脂类合成的基地rER的功能：蛋白质合成（起始于细胞质基质游离核糖体，多肽链边延伸边穿过内质网膜进入内质网腔中）；蛋白质的修饰与加工（糖基化、酰基化）；新生肽的折叠与组装。蛋白质合成信号肽与SRP结合 肽80链延伸终止 SRP脱离信号肽 肽链在内质网上继续合成，同时信号肽引导新生肽进入内质网腔 信号肽切除 肽链延伸至终止 翻译体系解散。这种肽链边合成边想内置王强转移的方式，称为co-translation。蛋白质糖基化：蛋白质在翻译后进行多种修饰，包括磷酸化、糖基化、泛素化、脂基化、甲基化和乙酰化等；糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的一种修饰之一，对生命体起着非常重要的作用；绝大部分重组的治疗性蛋白是糖蛋白；糖蛋白甲基化是指在蛋白质合成的同时或合成后，在酶的催化下寡糖链被连接在肽链特定的糖基化位点，形成糖蛋白。糖蛋白中聚糖的重要性：促进了蛋白质在内质网中的折叠；增加了溶解性；影响生物学活性（海藻糖对ADCC活性的影响；影响血液循环中的半衰期和药物动力学）蛋白质糖基化概述糖蛋白中的糖部分被称为聚糖，己糖则是聚糖中最常见的组分，包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖以及他们的一些简单修饰形式。影响血液循环中的半衰期和药物动力学：糖基化与非糖基化蛋白相比可延迟其在血液中的清除率；高含量的唾液酸增加了红细胞生成素的循环半衰期；糖基化蛋白更易被胞外基质捕获，较其非糖基化蛋白拥有更长久的生物药效率；人体中缺乏进行N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）合成的路径。而利用CHO细胞生产的EPO却同时含有Neu5Gc和N-唾液酸，含有Neu5Gc的糖结合物，可能被人血浆中的抗Neu5Gc抗体清除。蛋白质糖基化：N-连接：N-乙酰葡萄糖胺由Asn的氨基与蛋白质相连，Asn是在Asn-X-Ser/Thr的识别序列中，X为任意氨基酸。O-连接：N-乙酰半乳糖胺由Ser、Thr、Hy-Lys或Hy-Pro的羟基和多肽相连。核苷酸糖的合成与运输：所有前体糖糖均在胞浆中合成，包括九碳唾液酸；所有核苷酸糖在胞浆中形成，除了磷酸胞苷唾液酸；唾液酸活化形成磷酸胞苷唾液酸发生在细胞核中；蛋白糖基化反应在哪里进行？内质网；高尔基体NDP-糖（细胞质，少数在细胞核） 运输 内质网、高尔基体核苷酸糖运输至内质网：通过转运子进行运输，所有转运子都是反向运载体；核苷酸糖高度带电，运输过程中需要电荷平衡。N型糖基化：Man9GlcNAc2Glc3Man9GlcNAc2Man8GlcNAc22.2.5内质网rER的功能：新生肽的折叠与组装新生肽的折叠与组装：多肽链的折叠在易位到内质网内腔、信号肽切除后开始；内质网中伴侣分子促进蛋白质折叠，它们的活动需要细胞能量（ATP）伴侣分子：结合蛋白（BiP）；钙连结蛋白；钙网织蛋白；蛋白二硫键异构酶（PDI）sER的功能：脂质合成（包括磷脂和胆固醇在内的膜脂）；外输性脂蛋白的合成；肝的解毒作用：Cyp450 family（氧化、羟化）；储存钙离子：基质网膜上的Ca2+-ATP酶将细胞质基质中Ca2+泵入肌质网腔中；作为出芽点，将内质网上合成的蛋白质或脂转移到高尔基体。总结内质网结构：有单位膜围成的形状大小不同小管、小泡、扁囊结构；功能：细胞内蛋白质与脂质合成的场所。高尔基体：高尔基体的四个组成部分：高尔基体顺面网状结构；高尔基体中间膜囊；高尔基体反面网状结构；周围大小不等的囊泡。高尔基体的功能：蛋白质的糖基化及其修饰；蛋白酶的水解和其他加工过程（氨基酸或碳水化合物的硫酸化、肽水解、谷氨基酸的-羟化、天冬氨酸的-羟基化）；高尔基体与细胞的分泌活动。N-连接糖蛋白加工：切除3个Man加3个GlcNAc，移除2个Man加3个Gal和3个Neu5Ac。例：蛋白酶的水解和其他加工过程：无生物活性的蛋白原高尔基体切除N-端或两端的序列成熟的多肽。高尔基体与细胞内的膜泡运输：蛋白质基因编码在核糖体上起始合成由信号肽介导进入内质网信号肽释放继续肽链延伸翻译后修饰蛋白质折叠以囊泡形式从内质网中输出至高尔基体进一步糖基化修饰通过囊泡运输至质膜或细胞器。小结高尔基体结构：由扁平膜囊和大小不等的囊泡构成功能：蛋白的加工（糖基化和水解）和运输2.2.7其他细胞器溶酶体：单层膜围绕、内含多种酸性水解酶类的囊泡状细胞器功能是进行细胞内的消化作用：低pH，细胞废物和内吞物质降解的场所、过氧化物酶体：由单层膜围绕的内含一种或几种氧化酶类的细胞器，起到解毒作用。脂肪酸氧化的场所。核内体：在内吞作用中内陷的质膜形成的小细胞器；核内体提供了细胞外物质进入细胞内的运载途径，只含有一些前酶体（不具酶活性）：很多病毒以此条途径进入细胞；低密度脂蛋白（LDL）进入细胞。例：低密度脂蛋白（LDL）体内运输：LDL是脂质的载体蛋白，与质膜上的LDLR结合；复合物初级核内体次级核内体（pH5.0）LDL颗粒从LDL受体上分离，经由溶酶体融合后降解脂LDL受体循环至质膜2.2.8细胞骨架：一系列蛋白组成了细胞骨架，以维持形态以及具有传导和提供力的能力；细胞骨架的主要结构：微管；肌动蛋白纤维（微丝）；中间纤维。微管结构：所有微管均由约55kD的及微管蛋白组成；以、二聚体形式存在，通过头尾相连方式聚合，形成微管蛋白原纤维；一般由13根这样的原纤维构成一个中空的微管，直径2225nm。微管功能：控制膜性细胞器的定位机胞内物质的运输；能与其他蛋白共同组装成纺锤体、中心体、纤毛、鞭毛等结构；参与细胞形态的维持、细胞运动和细胞分裂等、肌动蛋白丝（微丝）：微丝是由肌动蛋白组成的骨架纤维；肌动蛋白以两种形式存在，即单位G-肌动蛋白和多聚体纤维状F-肌动蛋白。微丝功能：构成细胞的支架，维持细胞的形态；参与细胞的运动；参与细胞质的分裂；参与受精作用；参与肌肉收缩。中间丝：平均直径介于微管和微丝之间，故称为中间纤维；微管与微丝都是由球形蛋白装配起来的，而中间纤维则是由杆状蛋白装配而成；中间丝的主要功能：结构作用，稳定，传递机械力。2.3运输机制:2.3.1物质的跨膜运输细胞质膜是细胞内外环境之间一种选择性通透屏障：保障细胞对基本营养物质的摄取、代谢产物或废物的排除；调节细胞内离子浓度；使细胞维持相对稳定的内环境。物质的跨膜运输对细胞的生存和生长至关重要。脂溶性分子和不带电荷的小分子能直接通过膜；绝大多数极性分子、离子以及细胞代谢物通透性很低；对于大分子物质，比如蛋白和多糖通透性十分低。通透性较低的小分子物质的跨膜运输需要质膜上的膜转运蛋白参与；膜转运蛋白：载体蛋白：通过自身构象改变实现物质的跨膜转运通道蛋白：通过形成亲水性通道实现特异物质的转运载体蛋白：根据其所携带的溶质分子数量和溶质流动方向分类：单向转运载体；协同转运载体；逆向转运载体（后两项为共转运载体）协同转运载体和逆向转运载体常被用来转运带电的有机分子。2.3.2跨膜运输途径：简单扩散；被动运输又称协助扩散；主动运输；胞吞与胞吐作用。大分子物质跨膜运输通过胞吞和胞吐的方式实现；胞吞可能涉及一些细胞膜表面专门的受体，比如低密度脂蛋白和转铁蛋白受体等。简单扩散：小分子物质以热自由运动的方式顺着电化学梯度或浓度梯度直接通过脂双层进出细胞，不需要细胞提供能量，也无需膜转运蛋白的协助。协助扩散：溶质顺着电化学梯度或浓度梯度，在膜转运蛋白协助下的跨膜转运方式。协助扩散：膜转运蛋白：载体蛋白通透酶性质；介导被动运输与主动运输；通道蛋白具有离子选择性，转运速率高；离子通道是门控的；只介导被动运输。大部分营养物质像葡萄糖、其他的糖、氨基酸和寡肽，以及代谢副产物如乳酸、铵类和一些非必要氨基酸的排泄通过协助扩散机制转运，但也有采用主动运输机制。例：葡萄糖转运蛋白（单向转运蛋白）葡萄糖转运蛋白（GLUT）家族：GLUT有12个穿膜区域，羟基和氨基末端在细胞内；GLUT跨膜部分由疏水性氨基酸组成，有些螺旋带有Ser、Thr、Asp和Glu，其侧链同葡萄糖羟基形成氢键。例：单羧酸转运蛋白（共转运载体）1、由共转运载体介导的运输中，运输速率不加取决于溶质的浓度差，还受共转运的离子浓度的影响2、单羧酸转运蛋白（MCT）是共转运载体3、乳酸盐（协助扩散） a本身携带一个负电荷 b由协同的转运载体（CH2CHOO-，H+）4、丙酮酸转运同样需要H+协同转运5、影响乳酸运输浓度乳酸浓度PHH+胞内：7*10-5mM（PH7.2）胞内：4*10-5mM（PH7.4）例：氨基酸转运蛋白1、在哺乳动物中氨基酸转运蛋白数量巨大一些转运蛋白能运送所有性质相同的氨基酸，例如中性氨基酸转运蛋白转运所有不带电荷的氨基酸其他转运蛋白运输一种或少量几种氨基酸2.3运输机制1、主动运输（active transport）类型：由ATP直接提供能量的主动运输钠钾泵（Na+-k+ATP酶）钙泵（Ca2+-ATP酶）质子泵:P-型质子泵、V-型质子泵、H+-ATP酶2、协同运输（cotransport）由na+泵（或H+泵）与载体蛋白协同作用Na+-K+ATP酶消耗ATP，将Na+运输至膜外，形成Na+浓度梯度，Na+和葡萄糖顺着Na+泵所完成的主动运输方式，其中葡萄糖逆浓度梯度离子转运血浆 （mmol/L） 间液 （mmol/L）胞内（mmol/L）Na+14014K+44140Ca+1110-4Mg+0.80.720Cl-11050Na+-K+ATPase(Na+-K+泵) 1、对于建立细胞两侧Na+和K+的浓度梯度有重要的作用2、Na+-K+ATPase是整合在细胞膜上的蛋白，转运2个钾离子进入细胞，同时转运3个Na+离子出细胞钠离子依赖的葡萄糖主动运输1、共转运载体也可能涉及主动运输离子顺浓度运输，驱使离子穿过膜的推动力被用来逆浓度梯度运输另一种溶质2、钠离子依赖的葡萄糖转运蛋白（SGLT）钠离子顺浓度差易进入细胞，膜两侧-80mV电势差更以促进Na+进入细胞浓度梯度和电势差共同在Na+依赖的葡萄糖转运蛋白中起推动力的作用，使葡萄糖逆浓度从消化道腔中转运到小肠的上皮细胞ABC转运子1、ABC（ATP-binding caste）转运蛋白2、通过ATP结合和水解、转运磷脂、亲脂性药物、胆固醇和其他小分子多药抗性（MDR）转运蛋白1、真核细胞最早鉴定的ABC转运蛋白2、在多种肿瘤细胞中高度表达，利用水解ATP的能量将脂溶性的抗癌药物从细胞内转运到细胞外，从而降低细胞内药物浓度，导致肿瘤细胞抗药性增强，化疗失败胞吞与胞吐的作用1、作用：完成大分子（蛋白质、多糖、核酸等）与颗粒性物质的跨膜运输，又称膜泡运输或批量运输（bluk transport），属于主动运输2、胞吞作用（endocytosis）3、胞吐作用（exocytosis）胞吞作用1、胞饮作用(pinocytosis):内吞的物质是溶液或溶质，形成的囊泡较小（小于150nm）2、吞噬作用（phagocytosis)吞噬作用：内吞的是固体，形成的囊泡较大（大于250nm）胞吞作用与胞吐的作用1、胞吞作用2、胞吐作用组成型的外排径（constitutive exocytosis pathway)所有真核细胞连续分泌的过程蛋白的转运途径：粗面内质网高尔基体分泌泡细胞表面用于质膜更新（膜脂、膜蛋白、胞外基质组分、营养或信号分子)调节型的外排径(regulated exocytosis pathway)小结运输机制1、简单扩散，顺浓度梯度2、协助扩散（载体蛋白，通道蛋白）;顺浓度梯度3、主动运输：逆浓度梯度，需ATP或离子浓度（H+、Na+）作为驱动运输的能量ATP驱动的主动运输协同转运载体蛋白4、胞吞与胞吐的作用大分子（蛋白质、多糖、核酸等）与颗粒性物质以膜泡的形式进行的跨膜运输小结离子转运1、其他主要离子（H+、Na+、PO4-3、Cl-）的浓度在膜两侧相差很大，Na+和K+在细胞膜两侧有一个差不多10倍的相反浓度梯度，细胞内的钙离子浓度非常低，浓度差很大2、Na+-K+ATPase在维持Na+和K+浓度梯度中起很大的作用，ATP酶利用水解ATP作为能量来源3、细胞中的离子非常活跃，参与各种反应小结物质运输1、 GLUT1：细胞中存在的葡萄糖转运蛋白。属于协助扩散2、 MCT和H+一起转运乳酸、丙酮酸、基于同向协同转运蛋白的协助扩散3、 SGLT1：钠离子依赖的葡萄糖主动运输4、 氨基酸转运蛋白对运载的氨基酸种类有重叠，一些氨基酸竞争同一个转运蛋白，许多氨基酸存在两种以上的转运蛋白。2.4蛋白质的合成、分选、分泌1、对于高产的工业细胞系，分泌的重组蛋白再合成蛋白上占了非常大的比例，细胞把蛋白加工能力的大部分用于分泌蛋白产品2、蛋白质发挥结构或功能作用的部位几乎遍布细胞的各种区间或组分、或分泌至细胞外，因此，必然存在不同的机制，以确保蛋白质的分选，转运至细胞的特定部位3、只有蛋白质各就各位并组装成结构域功能的复合体，才能参与实现细胞的各种生命活动2生物过程中细胞生物学和生理生物学的基础2.5蛋白质基化2.5.1蛋白质糖基化的概述2.5.2糖蛋白中聚糖的重要性2.5.3蛋白折叠与糖基化2.5.4在高尔基体重糖链的延伸2.5.5聚糖类型和微观不均一性2.5.6核糖体的合成和运输2.5.7寡聚糖多样性蛋白质糖基化不均一性1、CHD细胞产生的糖蛋白固有的聚糖异性使得分子混合物具有不同的治疗效果，这种异质性也给实现工艺中不同批次之间的重现性带来挑战2、微观不均一性结合在相同的的结合位点，但连接到蛋白上的O型、N型多聚糖分子结构不同，这种不均一性称为微观不均一性3、宏观不均一性蛋白分子上常呈现多个糖基化位点，不是多有蛋白质上的多糖结合位点都会被占据，蛋白分子上不同结合位点的占据情况不同，这种不均一性称为宏观不均一性微观不均一性1、N-连接多糖微观不均一性是由高尔基中糖链延伸的反应途径造成a、被高尔基体的不同的糖基化酶催化b、各蛋白分子在高尔基中停留的时间不同C、唾液酸化不同聚糖类型和微观不均一性N型多糖结构一般分为三种：高甘露糖型、复合型和杂合型，它们共享有三甘露糖中心域结构（Man3GlcNAc2)高甘露型：多聚糖由五到九分子甘露糖组成(Man5-9GlcNAc2)复合型：两分子GlcNAc结合到三露糖中心域杂合型：高甘露与复合型聚糖的联合体，至少有三分子的甘露糖且不止一分子GlcNAc位于非还原甘露糖上在每个糖基化位点上多糖组分呈现多样性，称之为微观不均一性物种间聚糖多样性1、治疗性重组蛋白的遗传免疫性导致药效的降低引起严重的副反应2、治疗性重组蛋白潜在的免疫性可能由非糖基化的蛋白质核心区域与蛋白相连的多聚糖引起3、蛋白上多聚糖影响治疗蛋白的免疫原性的机制外源多糖结构该变蛋白屏蔽部分暴露2.5.5物种间聚糖多样性1、不同物种产生的人治疗用于重组蛋白分子是否具有糖基化具有不同的糖基化蛋白本身天然特性2、昆虫细胞和转基因植物生产的重组蛋白具有不同的糖基化形式3、CHO和小鼠骨髓瘤细胞生产的糖基化蛋白质具最小的免疫原性2.6细胞外基质（extracellular matrix)1、结构组成指分布于细胞外空间，由于细胞分泌的蛋白和多糖所构成的网格结构2、主要功能构成细胞支持细胞的框架，负责组织构建胞外基质三维结构及成分的变化，改变细胞微环境，从而对细胞形态、生长、分裂、分化和凋亡起重要的作用胞外基质的信号功能3、细胞外基质的组成成分胶原（collagen)氨基聚糖和蛋白聚糖层粘连蛋白(laminin)纤粘联蛋白(fibronectin)弹性蛋白胶原1、胶原是胞外基质最基本结构组成成分之一，动物体内含量最丰富的蛋白（总量的30%以上）2、胶原类型及在组织中的分布3、胶原及其分子结构具有Gly-x-y重复序列x-Pro;y-Hyp4、 胶原的功能：构成细胞外基质的骨架结构；胶原组成不同的纤维形式，以适应特定功能能的需要；降解后，保外基质信号传递的调控网络中氨基聚糖和蛋白聚糖1、蛋白聚糖(proteoglycan)见于所有结缔组织和细胞外基质及许多细胞表面，氨基聚糖和核心蛋白组成2、氨基聚糖(glycosaminoglycan,GAGs)层粘连蛋白1、 层粘连蛋白是动物胚胎及成体组织的基膜主要结构组织之一，层粘连蛋白在胚胎发育及组织分化中具有重要作用，层粘连蛋白也与肿瘤细胞的转移有关纤粘连蛋白纤粘连蛋白是糖蛋白血浆纤粘连蛋白是二聚体细胞纤粘连蛋白是多聚体纤粘连蛋白由不同的亚单位构成。RGD三肽序列是为细胞识别的最小结构单位小结ECM1、ECM蛋白质胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连蛋白、蛋白聚糖、糖氨聚糖2、特性细胞外基质含有丰富的电荷，能使生长因子、细胞因子等存其中细胞外基质是许多类型的细胞附着的基质并且以提供细胞生长，分化和发育的信号细胞周期1、细胞数量的增长经过四个阶段：G1、S、G2和M期2、长时间处于静息状态的细胞中末分化会无限期地从G1转到G0期3、从G1期进入S期，从G2到M期的过程是严格控制的细胞周期蛋白和CDKs1、除了正常的二倍体人体人成纤维细胞都是用于疫苗生产，几乎所有用于蛋白质生产的细胞都是连续细胞系，包括CHO、BHK、HEK293和小鼠骨髓瘤细胞如NS0和Sp2/02、这些细胞系已失去正常生长控制，其细胞周期检查点的控制已被破坏，在有丝分裂的情况下进入静息状态已失控细胞凋亡1、细胞在一定条件下经历程序性死亡这和由损伤引起的细胞死亡（坏死）不同2、在细胞培养过程中如营养枯竭、生长因子缺乏、病毒感染和/或代谢产物积累导致细胞凋亡3、启动细胞凋亡信号的通路死亡受体途径线粒体途径衰老和端粒1、正常二倍体动物细胞（干细胞除外）在体外培养中有一个有限的生命期，非永生化的细胞在体外的培养中不能无限的生长2、这种增值潜力方面的限制被称为“海弗利克现象3、从小鼠胚胎分离成纤维细胞（来自于结缔组织的细胞类型）可以再体外培养约60次4、端粒是染色体末端的重复序列，它们在DNA复制过程中不是由DNA聚和酶复制，而是由端粒酶合成5、随着代数的增加，线粒体长度变短，除非它们由端粒酶修复6、在干细胞中，端粒酶的活性很高以维持端粒长度7、连续传代成纤维细胞长度超越：海弗利克现象，产生一小部分幸存者，这些细胞最终生长、扩增可以再持续培养且没有有限的生命期，如3T3细胞8、虽然3T3细胞存在接触抑制，但其染色体数目异常9、癌组织由于病毒或癌基因改造使使之勇生化，这些转化的细胞常是非整倍体，无接触性抑制结束语对与实践细胞培养生物过程的生物技术来说，细胞生物学识是必不可少的细胞的结构和组成给予了它们多样的功能，也约束了它们的能力。在从事生物技术时，利用生物的多样性时，我们也必须了解细胞结构和功能上的限制和生物学的限制为了充分利用细胞的潜力，应该用手段去适应，以更好的服务于我们的目标在过去的二十年中大多数适应过程是凭是凭经验进行，在分子水平上，是什么导致这些细胞改变行为的知之甚少，如果能更好的理解细胞的能力和限制，我们将进一步的推动技术的进步。3细胞系的建立和开发3.1原代细胞系建立3.2融合细胞系建立建立原代细胞培养体系A组织块法B酶消化法C机械法3.2动物细胞融合o 细胞融合（cell fusion）是指在自然条件下或用人工方法使两个或者两个以上的细胞合并形成单个细胞的过程n 自发细胞融合是多细胞生物中常见的一种生命现象n 通过人工方法实现的细胞融合称作体细胞杂交（somatic hybridization）或细胞杂交（cell hybridization）o 基于细胞融合技术，利用血影或脂质体作为蛋白质、核酸等大分子的运输载体，向细胞内导入大分子n 血影：红细胞经过低渗处理，质膜破裂，内容物释放，这时红细胞仍然保持原来的形状和大小，该结构称血影n 该技术在药物输送和肿瘤靶向治疗等方面也取得了较为成功的应用3.2动物细胞融合3.2.1骨髓瘤细胞系o 骨髓瘤细胞株的要求n 能在体内外传代培养繁殖，并能保存n 要求融合率高，瘤细胞不要产生抗体n 瘤细胞具有HGPRT-或TK-HGPRT次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶TK胸腺嘧啶核苷激酶n 要求抗8-AG或6-TG，并在HAT中死亡8-AG8-氮鸟嘌呤6-TG6-硫代鸟嘌呤3.2.2致敏淋巴细胞o 接受免疫的动物n 根据选用的骨髓瘤细胞选择选择同系的动物免疫n 需作免疫最适应答试验n 鼠龄（小鼠）：812周健康：发育良好、雌鼠n 体重：1220克可溶性抗原免疫程序蛋白质：10100g/ml（0.2ml）+等量完全福氏佐剂（油剂+乳化剂+活分枝杆菌）每隔二周，强化免疫35次等量蛋白+不完全福氏佐剂（油剂+乳化剂）融合前34天用大剂量无佐剂抗原（50500g）进行腹腔或静脉注射颗粒性抗原免疫程序o 完整细胞（细菌）o 免疫原性强，不需加佐剂o 免疫程序首次免疫：15107cells/0.1ml21天、42天各加强免疫一次融合前三天，再免疫一次3.2.3融合方法o 生物方法o 化学方法o 物理方法生物方法o 疱疹病毒、天花病毒、副粘液病毒o 原理：病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具神经氨酸酶（N）和血凝素（H），它们可同细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，