BD-FACSCalibur流式细胞仪培训手册.doc

BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍表面抗原流式分析有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报.tw/bdb/index.html。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制：LO： 样品流速：12 ml /minMED：样品流速：35 ml /minHI: 样品流速：60 ml /min功能控制： RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。 鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。 废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。 鞘液过滤器：0.22mm过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。 气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。 空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。5. 上样品区：上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。 进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。 支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。1.2 Macintosh计算机与打印机：准备您的细胞样品1. 理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml？一般实验只需0.5 ml的样品。2. 细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中，否则无法上机。3. 上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？可使用附滤网BD FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 mm的尼龙筛网。4. 供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本公司网站下载染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.html 直接免疫荧光染色 Lysed - No - Wash Procedure Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27 Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure Leukemia and Lymphoma Procedure 1 Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay 间接免疫荧光染色 滴定抗体浓度 常用试剂5. 如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-mail：yenchichen.tw或 austin_bdtwn.tw。二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1. 开启细胞仪电源。2. 开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。3. 开启计算机。4. 确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow，确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。5. 将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。6. 将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。8. 取下样品管，执行 PRIME 功能两次。9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。10. 可开始分析样品。2.2 FACS Calibur 关机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。1. 将样品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真空系统抽取约 1 ml 的液体。2. 将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。3. 按 Standby，取下样品管，执行 PRIME功能两次。4. 取 2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。5. 注意最后只留约 1 ml dH2O 在试管中。6. 按 STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护雷射光源。）7. 倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。8. 将减压阀放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9. 退出软件“File”“Quit”(如有对话选项，选择“Dont save”)。确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。10. 关闭计算机。“Special”“Shutdown”。三、上机分析流程建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。（1）Negative Control（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1 单染）。（3）CD19-PE（FL2 单染）。（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。3.1 Calibur 开机1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1：如顺序相反，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行“connect to cytometer”。 解决之道，两者都关机、然后以正确方式重开。2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。 *秘技2：将减压阀方向调在加压（向前）位置。减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功能键时将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。3.2开启CellQuest 软件、编辑实验文件4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 启动软件。桌面会出现一Untitled 实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。5. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。6. 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition (收取) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。7. 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024，Y轴：FL2-H 1024。点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9. 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer，此时会出现Acquisition Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer，参考秘技 #1。如果没见到Acquisition Control 对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。仪器设置文件注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps - Threshold - Compensation。11. 检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN（线性放大），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。12. 从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。13. 从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。3.3 上样品、设置仪器14. 使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据)，点击Acquire。 调节FSC/SSC探测器（电压）15. 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节 Amp Gain 从1.009.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中的Pause。Gating 圈选细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。16. 在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates Region list ，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。17. 选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现的对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。 调节FL1、FL2的探测器（电压）18. 点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节FL1、FL2的电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100-101处。19. 在Threshold 窗口，适当地提高FSC阈值52，以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。 20. 点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。调节荧光补偿说明：最适化的最后一步是调节光谱重迭。（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。21. High RUN，换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。22. 移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中的Restart。调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。23. 最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击Acquisition Control窗口中的Restart，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。24. 移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。关闭Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。3.4收集实验数据决定储存细胞总数25. 预设之储存细胞总数为10000。如需修改，从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage，并在出现的窗口功，确认Collection Criteria从10000 of All，再点击OK。 26. 找个档案匣准备储存数据。从Acquire 菜单中选择Parameter Description，出现Parameter Description对话方框。点击Folder，并在随后出现之对话方框，选择Your Folder或新建活页夹，点击此对话方框的Select Your Folder。27. 命名即将储存之文件名：点击Parameter Description对话方框的File，出现文件名编辑窗口。在Custom Prefix中：输入文件名20031231，点击此对话方框的OK。日期为最常用之文件名系统。28. Optional：如有需要，可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。输入参数名会存入实验档案中，显示在图谱上。计数器Counters29. 从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数进度。收集实验数据30. 你可以开始收集实验数据了。HIGH RUN，将第一管样品放到检测区，在Acquisition Control窗口中，将 Setup 改成 Setup，此时CellQuest会自动显示 Your Folder：20031231.001为资料文件名。点击“Acquire” 便可启动样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件20031231.001，并会以“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成20031231.002。等待下一指示。31. 你可以换上下一管样品，点击“Acquire” 启动样品之分析测定与数据储存。可继续分析直到所有检品都分析完毕。3.5实验数据之储存与备份：32. 不建议长期使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有 CD-RW）、口袋硬盘（Flash Drive）来备份大量实验数据，以免占用原有硬盘的内存，影响数据处理速度。可将备份后之数据，拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。33. 确认所有档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至Trash筒。退出软件34. 检品分析完毕后，记得从屏幕上方 File 指令栏选择 Save As，储存实验文件，以备日后使用，不需每次重新编辑。35. 从屏幕上方 Cytometer 指令栏，选择Instrument Setting，出现Instrument Setting窗口。点系print打印此次实验条件，可贴入实验笔记留底，再点击Save以储存此一实验的仪器条件，供日后再使用。点系SAVE后会出现文件保存对话方框，选择文件目录及文件名（例：Your Folder：/Your Setting1），点击Save。点击Done。36. 检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取Disconnect to Cytometer 以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据，您可退出软件“File”“Quit”(遇有选项永远选择“Dont save”)，进行关机程序。 管路清洗37. 以2 ml 10 漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1 ml，再将样品架置于中位 HI RUN 十分钟。改用 2 ml DI water。重复上述程序，样品架上留约 1 ml DI water 。按STANDBY五分钟。关主机、关计算机四、数据分析FCS list mode数据文件：说明：FCS list mode数据文件是流式细胞仪的标准格式档案（FCS2.0）。该文件含有从流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的资料，含有46个参数。一般软件无法打开list mode数据文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析软件，才可开启、绘图、并进行分析统计。4.1 开启一CellQuest实验文件1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一Untitled 实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。4.2散点图之统计分析（双色）2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至适当大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。3. 在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击 Select File 钮，并用随后之方框来开启预存之 Sample Files，它们的路径位于Mac HD：BD Applications：CellQuest Folder：Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击 Open来开启 NORM001 档案。X 与 Y 参数项会出现默认值FSC-H 256 与 SSC-H 256，在Color方框中点击Multicolor Gating，确认无误之后，点击 OK 便完成了一个 NORM001 的 FSC /SSC散点图。4. 工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor 移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)5. 从Plots菜单中选择Dot Plot可复制一个同样大小的散点图，屏幕上会出现一 Dot Plot 对话方框。点击X Parameter 钮来显示 NORM001 档案中所有的参数项 (FSC, SSC, FL1, FL2) 将 X 参数项改成FL1-H 256 Gamma-1，Y 参数项改成FL2-H 256 Gamma-2。从Gate输入栏中将 NoGate 改成G1= R1。6. 点击 OK 便完成了一个以 G1 圈选的 FL1/ FL2 散点图，可将复制图移至原图右方。NORM001 档案为本组实验之阴性对照组，我们将以之来界定阴性与阳性之界限。7. 从屏幕左列工具板中，选取 Quadrant Marker 工具，然后在 FL1/ FL2 散点图中心处点击并拖曳至定点，一般而言是紧挨着阴性细胞聚落。8. FL1/ FL2 二维散点图现在被区隔出四个象限，欲计算各象线中细胞的数据数据，从屏幕上方Stats菜单中选择Quadrant Stats。可以得到该图之四象限统计结果。UL：左上象限，UR：右上象限，LL：左下象限，LR：右下象限打印报告、输出统计数值9. 从屏幕上方File菜单中选择Print One，可以打印工作中实验文件。10. 点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。4.3 开启其它List Mode Data11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Next Data File，软件会自动以新档案来替换现有档案，您只要确认圈选范围、与 Quadrant Marker 的位置是否恰当，即可打印报告、或输出统计数值。12. 对于存在不同档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Change Data Files，并在随后出现之对话方框，选择所在新目录与欲分析档案。点击OPEN。可调整圈选区域，Quadrant Marker阴阳界限，软件会重新计算、统计报告。13. 常规使用之实验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、以及统计报告) ，我们建议您将它另存新档 File Save As，以备后需，分析其它档案便轻而易举。4.3直方图之统计分析（单色）1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一Untitled 实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖曳对角线至适当大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。3. 在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击 Select File 钮，并用随后之方框来开启预存之 Sample Files，它们的路径位于Mac HD：BD Applications：CellQuest Folder：Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击 Open来开启 NORM001 档案。X 与 Y 参数项会出现默认值FSC-H 256 与 SSC-H 256，在Color方框中点击Multicolor Gating，确认无误之后，点击 OK 便完成了一个 NORM001 的 FSC /SSC散点图。4. 工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor 移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)5. 从Plots菜单中选择Histogram，屏幕上会出现一 Histogram 对话方框。点击 Select File 钮，再点击 Open来开启 NORM001 档案。说明：直方图（Histogram）表明一个参数与细胞数量之间的关系，在图中，横坐标X轴为荧光或光散射强度的相对值，单位是道数（channel number），纵坐标Y轴则通常表示细胞出现的频率，即相对细胞数。6. 点击 Parameter 钮来显示 NORM001 档案中所有的参数项，将参数项改成FL2-H 256 Gamma-2。从Gate输入栏中将 No Gate 改成G1= R1，点击 OK 便完成了一个以G1圈选的 FL2直方图，图形的 X 轴为橙黄色荧光强度，Y 轴为细胞频率，NORM001 档案为本组实验之阴性对照组，我们将以之来界定阴性与阳性之界限。7. 从屏幕左列工具板中，选取 Histogram Marker 工具，然后在图的左缘处点击并拖曳至定点，一般而言是阴性信号的右缘。放开鼠标后即完成Marker 1(M1)。重复前述步骤以增画另一Marker，一般而言 M2 始自 M1 的右缘，终于图的右界。8. FL2 直方图现在被区隔出两个区域，欲计算各区域中细胞的数据数据，可从 Stats 指令栏中选择 Histogram Stats。打印报告、输出统计数值9. 从屏幕上方File菜单中选择Print One，可以打印工作中实验文件。10. 点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。4.3 开启其它List Mode Data11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Next Data File，软件会自动以新档案来替换现有档案，您只要确认圈选范围、与 Quadrant Marker 的位置是否恰当，即可打印报告、或输出统计数值。12. 对于存在不同档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Change Data Files，并在随后出现之对话方框，选择所在新目录与欲分析档案。点击OPEN。可调整圈选区域，Markers界限，软件会重新计算、统计报告。13. 常规使用之实验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、以及统计报告) ，我们建议您将它另存新档 File Save As，以备后需，分析其它档案便轻而易举。五、错误信号、疑难排除5.1 仪器状态（Status）： 在CELLQuest菜单位于Cytometer菜单中。用来在收取的任何时候查看流式细胞仪的运行状态，以利解决仪器运行中出现的问题。状态：显示仪器运行模式Not Ready：激光器正在预热、鞘液桶空、废液桶满。Ready：样本管放置在进样区，且支撑臂位于中位，样本管加压，仪器在RUN状态。Standby：仪器在Standby 状态、或仪器在Run 状态而无样本管在进样区上、或支撑架位于侧位、或样本管未完全加压。Standby时仪器的雷射电源降低。5.2 常见故障排除程序5.2.1 样品试管上不去 误用不适合的试管。（请用BD Falcon 352052） 试管支持架需调整。旋转调整试管支持架（顺时钟向下、逆时钟向上）。 Bal Seal 磨损。（汰换 Bal seal）5.2.2 仪器处于N0T READY状况检查以下情况： 鞘液筒中的鞘液是否用完。 废液筒中的废液是否已装满。 开机需要5分钟时间预热。 鞘液筒的液面检测器连接是否松动、或未连接。5.2.3 仪器处于STANDBY状况（仪器失压）如果仪器未加压，上样管放好后，虽然控制面板处于RUN模式，但仪器仍未能达到READY状况，此时仪器仍处于STANDBY状况。这可能是由于鞘液筒盖漏气、压力阀未加压，样本管不能被加压等原因造成的压力问题。此时，样本不能良好地进入流动室，无法检测。此时，检查以下情况： 压力阀未加压。 鞘液筒是否漏气（盖紧鞘液筒盖）。 样本管是否有破损。 上样针上的Bal seal是否己磨损。 鞘液筒上的蓝色接头是否连接好。5.2.4 仪器讯号噪声过高鞘液过滤器中有气泡，仪器记录了气泡产生的信号，造成了噪声数据的干扰。气泡还可以改变样本流，造成检测结果不理想；此时，仪器需要做PRIME，排除液路中的气泡干扰。如果鞘液筒吸干了，应该重新装满鞘液，然后先取下样品管进行5-10次PRIME，再换上3ml dH2O上样管HI RUN 30分钟，待鞘液流中的气泡排除之后，再进行样本测定。5.2.5 计算机屏幕上见不到细胞显示检查以下情况： 如果仪器一直处于STANDBY状态，则检查System Status。 如果STATUS窗日显示READY，则检查样本管中细胞浓度是否够，上样前是否混匀了。 检查实验的Instrument Settings是否正确。 检查阈值是否设置过高，导致无法检测目标细胞群。 检查CELLQuest软件Cytometer目录下的Status窗口，是否己被更新。如果未更新，说明仪器与计算机之间的通讯发生了故障，此时，应关闭计算机和FACSCalibur，重新打开仪器，继续实验。 PRIME仪器液流，去除流动室中可能存在的气泡。若流动室中存在气泡，可能使样本流的位置偏离激光束，导致无细胞信号。5.2.6 加样针有鞘液反流检查以下情况： 检查上样针外管是否安好，可以将外管旋下，向上推动，重新拧紧。 更换上样针上部的O型胶环。 检查液流保存系统的真空帮浦是否工作。如果样本管支撑架位于旁位时，听不到真空帮浦的工作声音，可能是真空帮浦停了，关闭FACSCalibur，再启动；移开支撑架时，如果马达仍然不动，请致电BD客户服务部门寻求帮助。实验文件1：2 Color ACQ实验文件2：2 Color ANA表一、常用荧光染剂测量参数荧光染剂吸光波长(nm)荧光波长(nm)标示抗体用染剂Fluorescein, FITC490520Phycoerythrin-R, PE495578Peridinin-chlorophyll, PerCP490677Cy-Chrome495670PE-Texas Red495620PE-Cyanine 5495670核酸含量分析Ethidium Bromide510 (+ds DNA)595Propidium Iodide,PI536 (+ds DNA)623Acridine Orange480 (+ DNA)440-70 (+ RNA)520650Thiazole Orange509 (+ RNA)533Pyronine Y560-562 (+ds RNA)497 (+ss RNA)565-574563细胞 ViabilityPropidium Iodide,PI536 623YOPRO-1480515Acrid