不同络合剂对二价阳离子络合的胞外聚合物的提取效果比较_费维繁.pdf

文章栏目：水污染防治DOI10.12030/j.cjee.202211153中图分类号X703文献标识码A费维繁,杨英,李卫华,等.不同络合剂对二价阳离子络合的胞外聚合物的提取效果比较J.环境工程学报，2023,17(6):1841-1850.FEIWeifan,YANGYing,LIWeihua,etal.ComparisonoftheextractioneffectsofextracellularpolymericsubstancescomplexedwithdivalentcationsbydifferentcomplexingagentsJ.ChineseJournalofEnvironmentalEngineering,2023,17(6):1841-1850.不同络合剂对二价阳离子络合的胞外聚合物的提取效果比较费维繁，杨英，李卫华，陈玉，王娣安徽建筑大学环境与能源工程学院，合肥230000摘要胞外聚合物(EPS)是一种环境友好的净水剂，高效提取 EPS 可以为吸附重金属离子及抗生素提供更多的吸附位点。本研究采用不同的络合剂去除二价阳离子以提高 EPS 的提取量，对柠檬酸钠(SC)法、草酸钠(SO)法、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)法和酒石酸钾钠(SS)法提取的 EPS 特性进行对比。草酸钠法整体提取效率高，对 EPS 的组分和性质影响小，吸附效果好。柠檬酸钠和 EDTA-2Na 法对 EPS 的大分子成分造成不同程度的破坏，尤其是 EDTA-2Na 法明显改变了 EPS 的荧光特性。结合红外光谱和 XPS 分析证明 EPS 中各官能团与蛋白质、多糖等物质密切相关。研究为进一步发掘利用络合剂对二价阳离子络合提取胞外聚合物及后续应用提供理论依据和技术支持。关键词胞外聚合物；提取特性；二价阳离子；蛋白质二级结构；XPS 分析活性污泥法作为主要的污水处理手段，已广泛应用于全国各地的污水处理厂。胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)作为活性污泥中重要组成部分，主要是聚集类微生物在代谢过程中分泌的高分子聚合物，其中蛋白质和多糖占其总量的 70%80%，而核酸、腐殖质、糖醛酸、脂类和氨基酸等物质的含量相对较低1。因此，EPS 上的羧基、磷酰基、巯基、酚类和羟基可为有机物、重金属和抗生素等提供吸附位点2。与传统的去除方法相比，EPS 具有环保、可再生、无毒、可降解等优点，同时可以实现污泥的资源化利用3。在对 EPS 的诸多研究中，从活性污泥中高效提取 EPS 是目前研究的主要方向。常用的提取方法包括物理提取法(加热法、高速离心法、超声法)和化学提取法(酸法、碱法、EDTA 法和离子交换法)。由于 EPS 与活性污泥絮体结合紧密，从而保护污泥絮凝体中的微生物不受外界环境变化的影响4，因此，如何破坏 EPS 与活性污泥絮体的连接成为提取的关键。其中物理提取法的缺点主要是 EPS 产率低和蛋白质在高温下变性。化学提取法虽然提高了提取效率，但也可能污染提取的EPS 或在随后的分析阶段造成影响。例如在高 pH(10)条件下，碱法导致更多的细胞裂解和大分子破坏。EDTA 法中残留试剂在分光光度测定过程中对蛋白质的干扰，以及 EDTA 难以降解严重污染环境5，此类方法对于污泥处理过程中 EPS 的常规提取不是很有效。收稿日期：2022-11-28；录用日期：2023-05-11基金项目：国家自然科学基金(81978003)；安徽省重大科技专项(201903a06020034)第一作者：费 维 繁(1997)，男，硕 士 研 究 生，；通信作者：杨 英(1963)，女，博 士，教 授，环境工程学报Chinese Journal ofEnvironmental Engineering第 17 卷 第 6 期 2023 年 6 月Vol.17,No.6Jun.2023http:/E-mail:[phone]在本研究中，对柠檬酸钠(SC)、草酸钠(SO)、EDTA-2Na 和酒石酸钾钠(SS)4 种络合剂提取EPS 的效果进行了比较，利用 Ca2+和 Mg2+作为 EPS 分子中不同负电荷位点连接的桥梁以稳定活性污泥絮体结构6，通过络合剂对 Ca2+、Mg2+进行络合，破坏活性污泥絮体结构进而使 EPS 释放7。再对 4 种络合剂提取的 EPS 含量和各组分特性比较，借助离子色谱仪、三维荧光光谱、红外光谱、X 射线光电子能谱等表征分析手段，对相关二价阳离子浓度、EPS 的光谱和能谱特性进行了表征和分析，以阐明不同络合剂提取的 EPS 分子结构特性。本研究结果以期为后续深入发掘络合剂对二价阳离子络合的胞外聚合物提取及应用提供参考。1材料与方法1.1实验污泥样品来源本研究所使用的活性污泥来自于合肥市经济开发区某污水处理厂二沉池，将取得的污泥立即运回实验室保存。对污泥进行预处理操作：将取回的污泥静置 30min 后在 4000rmin1下离心10min，将含有悬浮杂质的上清液弃除；用 0.85%的氯化钠溶液恢复至原体积，轻轻搅拌使污泥恢复悬浮状态；在 6500rmin1下离心 10min，弃除上清液除去悬浮杂质，重复上述操作 3 次，将清洗好的污泥经 100W 超声 5min 后完成对污泥的预处理。1.2EPS 的提取方法将预处理好的污泥按以下方法提取 EPS 并设置对照组。取适量预处理后的污泥加入适量0.85%的氯化钠溶液作为对照组，轻轻搅拌后污泥恢复悬浮状态。在 25、180rmin1的振荡培养箱中振荡 60min。取适量预处理后的污泥分别加入不同浓度(60、75、90、105 和 120mmolL1)的柠檬酸钠、草酸钠、酒石酸钾钠溶液，轻轻搅拌后污泥恢复悬浮状态。通过研究发现在络合相同含量的阳离子时所需要的 EDTA 与柠檬酸的物质的量浓度比约为 0.7:18，本研究将 ETDA-2Na 浓度梯度设为 40、50、60、70、80mmolL1。在 25、180rmin1的振荡培养箱中振荡 60min。通过上述方法处理后，将样品在 11000rmin1、4 下离心 20min，上清液通过 0.45m 滤膜后收集。1.3EPS 的成分分析以蛋白质、多糖、DNA之和来表示 EPS 提取总量，以牛血清白蛋白作为标准物质，用考马斯亮蓝-G250 测定蛋白质9；葡萄糖作为标准物质，用蒽酮-硫酸比色法测定多糖10；小牛胸腺DNA 作为标准物质，用二苯胺法测定 DNA11。通过紫外可见分光光度法测定各络合剂提取 EPS 中蛋白质、多糖和DNA的吸光度。对需要测定的参数均测定 3 次后取平均值，带入标准曲线计算。1.4EPS 的表征方法研究中使用离子色谱仪(CIC-D160 型，盛瀚，青岛)测定 Ca2+、Mg2+的含量；三维荧光分光光度计(F-7000，日立，日本)测定分析各样品的波长；将处理好的各样品溶液进行冷冻干燥，利用傅里叶变换红外光谱仪(NicoletIs20，赛默飞，美国)与 X 射线光电子能谱分析仪(K-Alpha，ThermoScientific，美国)测定；最后所得的数据通过 Origin2021 作图。1.5EPS 吸附实验有研究12表明，向 50mL10mgL1四环素溶液中加入 100mgEPS，在 pH=6、25、180rmin1的振荡培养箱中振荡 60min 后，吸附达到平衡。所有实验均进行 3 次，在进入高效液相色谱测试之前通过 0.45m 过滤器过滤。通过测试取平均值计算吸附去除率。2结果与讨论2.1各络合剂提取 EPS 的总量图 1 为各络合剂在不同提取条件下的 EPS 各组分含量。对照组 EPS 提取量为(37.011.78)mgg1(以 MLSS 计)。在草酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钾钠的浓度为 120mmolL1时，EPS 提取量最高，分1842环境工程学报第17卷别为(193.123.08)、(223.613.44)、(124.932.37)mgg1；ETDA-2Na 浓度为 60mmolL1时，EPS 提取量最高，为(208.325.54)mgg1，但 DNA 含量过高说明对细胞的破坏程度较大，使细胞内的蛋白质和多糖释放导致测试值过高13；在对活性污泥微观结构研究时发现EPS在絮体层级(外层)和菌胶团层级(内层)的组分有所差异，在内层 EPS 的蛋白质含量更多14。络合剂通过对絮体结构进行破坏提取更多内层的蛋白质，尤其是随着柠檬酸钠和草酸钠法浓度的提高，内层 EPS 的提取量也随之增加，所提取的蛋白质含量最高15。在 4 种络合剂中，ETDA-2Na 法提取的多糖含量最高16。草酸钠和酒石酸钾钠法提取的 DNA 含量低，这说明对细胞的损害较低17。柠檬酸钠法提取的 DNA 含量较高，可能是由于菌胶团中的细胞更替产生大量的 eDNA(extracellularDNA)导致的18。综上所述，草酸钠法在 4 种络合剂中提取效率最高。2.2络合剂对钙镁离子的释放效果使用离子色谱仪测定不同络合剂对钙镁离子的释放效果，以说明 EPS 中各组分含量的差别。图 2 为各络合剂在不同浓度下对钙镁离子的释放效果。柠檬酸钠、草酸钠和 ETDA-2Na 法对钙镁离子的释放效果明显高于酒石酸钾钠法，说明这 3 种络合剂与钙镁离子形成络合物，从而破坏了活性污泥的絮体结构19。同时络合剂自身携带的钠离子通过离子交换提高这一过程 EPS 的释放率20。从钙镁离子来看，钙离子的浓度明显高于镁离子的浓度，说明钙离子比镁离子更倾向于与污泥聚合物结合21，在 EPS 与细胞的桥接中发挥主要作用22。其中 ETDA-2Na 法释放的钙镁离子浓度明显高于其他络合剂。有研究表明，随着钙离子从活性污泥中的释放，胞外多糖含量也随着增加23。图1各络合剂不同浓度下所得 EPS的组分含量Fig.1ThecontentsofextractedEPScompositionsbythecomplexingagentatdifferentconcentrations第6期费维繁等：不同络合剂对二价阳离子络合的胞外聚合物的提取效果比较1843这也导致 ETDA-2Na 法提取的多糖含量高。随着络合剂浓度的提高，钙镁离子的浓度增长趋于平缓，可能是由于络合剂浓度过高钙离子在污泥中形成了沉淀24，而镁离子则倾向于与蛋白质结合25。2.3EPS 三维荧光光谱分析使用三维荧光光谱对各络合剂最高提取量下的 EPS 进行分析，去除瑞利散射26处理所得的数据，结果如图 3 所示。存在 4 个明显的荧光峰：色氨酸类荧光峰 A(Ex/Em=275296nm/340380nm)27；腐殖酸类荧光峰 B(Ex/Em=320370nm/410460nm)28；富里酸类荧光峰 C(Ex/Em=210240nm/410450nm)29；酪氨酸类荧光峰 D(Ex/Em=220235nm/310340nm)30。由此可知，提取的 EPS 组分中含有色氨酸类蛋白质、酪氨酸蛋白质、类腐殖酸和富里酸。不同络合剂提取的 EPS 的荧光特性存在显著差异。A、D 区域为蛋白质类物质，草酸钠和柠檬酸钠法所提取 EPS 在 A 区域的荧光强度明显高于 EDTA-2Na 和酒石酸钾钠法。其中草酸钠和柠檬酸钠法所提取的 A 峰峰值是酒石酸钾钠法的1.4 倍，是 EDTA-2Na 法的 4.26.1 倍。B、C 区域为腐殖酸类物质，草酸钠提取的 EPS 在 B 区域荧光强度是柠檬酸钠法的 1.4 倍、EDTA-2Na 法的 2.8 倍、酒石酸钾钠法的 1.7 倍。这说明草酸钠法对腐殖酸类物质也有着高的提取效率。同时，EDTA-2Na 法明显破坏活性污泥中的蛋白质结构，使得相应 EPS 荧光强度减弱。这也很好地解释了前文中不同络合剂所提取的蛋白质含量差异。2.4EPS 的红外光谱分析使用傅里叶红外光谱对各络合剂最高提取量下 EPS 进行分析，结果如图 4、图 5 和表 1 所示。从图 4 中可以看出，4 种络合剂处理的样品均在 3400cm1左右存在宽峰，此处属于蛋白质或多糖羟基中的 OH 和 NH 伸缩振动峰31；在 16501630cm1的峰是酰胺区的 C=O 伸缩振动峰，图2各络合剂不同浓度下对钙镁离子的释放Fig.2Releaseofcalciumandmagnesiumionsbythecomplexingagentatdifferentconcentrations1844环境工程学报第17卷为典型的蛋白质类物质32；14101390cm1的峰是糖醛酸中的羧酸盐基团33；13501250cm1的峰主要是由氨基酸的 CO 和 CH 伸缩振动产生的34；1150900cm1的峰与多糖中的 CO、CC 的伸缩振动有关，可以用来反映其多糖的含量与结构35，EDTA-2Na 法在此波段强于其余络合剂，其多糖含量最高。通过红外光谱分析表明 EPS 的主要组成是蛋白质和多糖。4 种络合剂在最高提取量下的红外谱图峰型大致相同。在具体波峰段如酰胺区域(17001600cm1)存在较大差异，对酰胺区分峰拟合分析，依据已有研究将酰胺区划分36：-折叠带(16001637cm1)、无规则卷曲带(16371645cm1)、-螺旋带(16461660cm1)、-转角带(16611680cm1)、反向平行-折叠(16811700cm1)，拟合结果如表 1、图 5 所示37。-螺旋、-转角、-折叠对聚集性能起正面作用，而无卷曲折叠和反向平行-折叠对聚集性能起负面作用38。从分峰结果来看，4 种络合剂提取的 EPS 的聚集有利结构均超过 70%，其中柠檬酸钠法的聚集有利结构为 96%、草酸钠法的有利结构为 84%。-螺旋/(-折叠+无卷曲折叠)的比例可以反应蛋白质二级结构的紧密程度，若该值越低则蛋白质二级结构越松散39，吸附点位越多。4 种络合剂提取的图3各络合剂最高提取量下所得 EPS 的 EEM 光谱Fig.3EEMspectraofEPSextractedbythecomplexingagentatthehighestextractionvolume图4各络合剂最高提取量件下所得 EPS 的红外光谱Fig.4InfraredspectraofEPSextractedbythecomplexingagentatthehighestextractionvolume第6期费维繁等：不同络合剂对二价阳离子络合的胞外聚合物的提取效果比较1845EPS 均有较低的-螺旋/(-折叠+无卷曲折叠)值，在柠檬酸钠和草酸钠法的蛋白质二级结构中，有利结构-转角明显高于其他络合剂提取的EPS，更有利于后续吸附离子、抗生素。EDTA-2Na 法提取的 EPS 蛋白质中-折叠含量(70.4%)最高，且没有反向平行-折叠这也与前人的研究16结果一致，可能是由ETDA-2Na 使 EPS中蛋白质二级结构破坏所导致的。只有酒石酸钾钠法提取的EPS 蛋白质中发现了无规卷曲。以上结果表明，不同络合剂提取的 EPS 具有不同的蛋白质二级结构。相似百分比分析结果表明，草酸钠和柠檬酸法提取的蛋白质二级结构相似度最高。2.5EPS 的 XPS 光谱分析由于 EPS 的官能团种类丰富，需要进一步借助于XPS 确定并加以验证。由于草酸钠与柠檬酸钠法提取量高且根据上述研究发现其各项结果相似。因此，对这 2 种络合剂最高提取量下 EPS 进行 XPS 图谱分峰拟合比较，其结果如图 6 所示。由图 6(a)和图 6(b)可以看出，提取的 EPS 中 C 元素主要以 4 种形态存在且含量相似：分别为284.8eV 处 CC、CH 占总量 60%70%40，主要为脂质或氨基酸侧链的烃基类；286.4eV 处CO、CN 占总量的 15%20%，来源于蛋白质中的酰胺键和醇类；288.1eV 处 C=O 占总量的表1各络合剂最高提取量条件下蛋白质二级结构的含量变化Table1Changesinthecontentofproteinsecondarystructureatthehighestextractionvolumeofeachcomplexingagent络合剂二级结构含量/%-螺旋-折叠-转角无卷曲折叠反向平行-折叠草酸钠21.2840.3222.84015.56柠檬酸钠15.8244.7232.6303.79EDTA-2Na12.0970.4017.5200酒石酸钾钠17.7346.229.4224.132.51图5各络合剂最高提取量件下蛋白质二级结构分峰图Fig.5Peaksplittingofproteinsecondarystructureatthehighestextractionvolumeofeachcomplexingagent1846环境工程学报第17卷9%15%，来自于羧基、羰基、酰胺和半缩醛中；288.9eV 处 O=COH、O=COR 含量最少不到5%，其来源于酯键或羧基41。由图 6(c)和图 6(d)可见，O 元素的各官能团含量也同样相似，均以 3 种形态存在。存在于羧酸盐、酰胺等的 O=C，占总量的 55%62%。存在于醇类、缩醛或半缩醛中的 COC，其含量与EPS 中的多糖单体有关，柠檬酸钠法提取的多糖含量也略高于草酸钠法。最后还有少量的卫星峰42。对图 6(e)和图 6(f)中 N 元素各官能团进行分析，同样其以 3 种形态存在。分别为位于胺基和酰胺的 CN，均占总量的 70%以上，这是由络合剂提取的蛋白质中的酰胺键导致的43。位于碱性氨基酸或氨基糖中的质子化 N(Npr)含量占到总量的 7%13%。最后还有约 13%20%的吡啶 N44。2.6EPS 对四环素的吸附分析将 EPS 加入 50mL、pH 为 6 的四环素溶液(10mgL1)中，研 究 不 同 络 合 剂 提 取 的EPS 对四环素的吸附效果，结果如图 7 所示。草酸钠(60.74%)和柠檬酸钠法(61.41%)提取图62 种络合剂最高提取量件下 XPS 图谱分析Fig.6XPSpatternanalysisatthehighestextractionvolumeofthetwocomplexingagents图7EPS 对四环素吸附效果Fig.7EPSadsorptiontotetracycline第6期费维繁等：不同络合剂对二价阳离子络合的胞外聚合物的提取效果比较1847的 EPS 对四环素的吸附率明显高于 EDTA-2Na(48.99%)和酒石酸钾钠法(30.21%)。EPS 对四环素的吸附主要是羟基等活性官能团参与了四环素的吸附过程45，其主要来自多糖和蛋白质，是 EPS 中主要官能团。由于不同络合剂提取的 EPS 中多糖、蛋白质含量各不相同，导致其对四环素去除率有所差别。经过对 4 种络合剂提取的 EPS 组分分析，柠檬酸钠和草酸钠法三维荧光光谱实验结果表明在蛋白质的提取量上明显高于 EDTA-2Na 和酒石酸钾钠法。对各官能团分布特征进行分析，4 种络合剂提取的 EPS 红外光谱的峰型相似，柠檬酸钠和草酸钠法的 XPS 谱图也同样反映出两者具有相似的官能团，说明不同络合剂对 EPS 官能团的种类无明显影响，但其吸收峰强度存在明显差异，这也与 EPS 各组分提取量的结果基本吻合。同时 EPS 的含量越高，对四环素的吸附效果越好。3结论1)采用络合剂通过络合作用去除活性污泥中二价阳离子，破坏污泥絮体结构，与常规的提取方法相比可以更高效提取 EPS。2)草酸钠和柠檬酸钠法随着浓度的提高更有利于提取内层蛋白质，从而提高 EPS 的提取量，但柠檬酸钠法 DNA 含量与草酸钠相比较高。EDTA-2Na 法对 EPS 中的蛋白质具有较强的破坏作用；而酒石酸钾钠法提取量低、吸附效果差。3)草酸钠法综合提取效率高，对 EPS 的组分和各官能团影响较小，其疏松的蛋白质二级结构为吸附提供有利条件，可以作为今后从活性污泥中提取 EPS 非常有效的替代方法。参考文献林伟雄,顾海奇,郑诗琳,等.不同提取方法对活性污泥胞外聚合物吸附废水中Cd()效能的影响J.环境工程学报,2020,14(3):829-834.1HA J,GELABERT A,SPORMANN A,et al.Role of extracellularpolymeric substances in metal ion complexation on Shewanellaoneidensis:Batch uptake,thermodynamic 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