细胞苗工艺规程及SOP.doc_咨信网zixin.com.cn

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细胞苗工艺规程及SOP 一、工艺规程 1 概念是兽药生产和质量控制中最重要的文件，是规定生产所需原料和包装材料等的数量、质量以及工艺、加工说明、注意事项、生产控制的一个盒一套文件，是企业组织和指导生产的重要依据，也是技术管理工作的基础。工艺规程的目的是为生产各部门提供了一个共同遵守的技术准则，以保证每一兽药产品在整个有效期内都保持预定设计的质量。 2 工艺规程主要内容 2.1 封面与首页封面上应明确本工艺规程是某一产品或某一剂型的生产工艺规程明确编制人、审核人、批准人签字及日期，明确批准执行日期。 2.2 工艺流程图 2.3 质量控制要点 2.4 正文正文工艺规程的核心部分，应根据本企业的产品和兽药GMP的要求来分别制定原料和制剂的工艺规程。 2.5 成品质量标准 3 工艺规程编制中应注意的事项 3.1 内容全面。如从兽药批准文件到生产控制的方法、各种质量标准直至该品种工艺规程变更登记等。 3.2 有较多内容相同或重复时，可采取将相同内容汇编等形式，集中为一个或几个文件，工艺规程中可只体现版本号和文件号等。 3.3 以体现生产方法为原则，不必过细；但可形式多样，以适用、能作为其他文件的重要义据为原则。 4 修改与更改工艺规程一经批准，不得任意改动，各级操作人员和管理人员都应严格执行。对不符合工艺规程的指令或无批准手续变更的指令，操作人员应拒绝执行。工艺规程一般3~5年修订一次当有重大工艺改革、设备更新、原辅料变更等，需要组织工艺验证，证明对质量无影响时才能通过批准更改工艺规程。一般的工艺和设备改进项目，由有关部门提出书面报告，经实验在不影响产品质量情况下，通过规定的程序，批准修订稿，修订稿的编写、审核、批准程序与制定程序相同，并注明修改日期、实施日期、各级人员的签字。例题目猪瘟活疫苗（细胞苗）生产工艺规程编码页数共页起草人审核人批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门 GMP认证办公室颁发数量生效日期分发单位质管部、质检部、生产部、生产车间一、目的：规定制造猪瘟活疫苗的方法和程序。二、适用范围：适用于猪瘟活疫苗的生产的全过程三、依据。《猪瘟活疫苗制造及检验规程》四、责任者：生产部各岗位。五、正文： I 工艺流程及质量控制要点细胞传代及检验接种转瓶培养收获半成品检验不合格合格无害化处理分装轧盖贴签包装入待检库成品检验不合格入报废品库销售无害化处理合格入成品库犊牛睾丸细胞制备种毒制备冻干配苗猪瘟活疫苗（细胞苗）控制要点工序质量控制要点质量控制项目频次种毒制备种毒生产用种毒批每批细胞制备消化时间每批温度每批细胞传代细胞系统外源病毒检验每批检验半成品无菌检验每收效力检验每收安全检验（脾毒接种）每批配苗分装保护剂无菌检验每批半成品无菌检验每批分装过程无菌检验分装过程前、中、后检验分装量间隔半小时标定分装量 II 操作细则本品系用猪瘟兔化弱毒株接种于犊牛睾丸细胞收获感染病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪瘟。 1 制苗材料的制备 1.1 条件准备 1.1.1 根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。 1.1.2 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 1.1.3 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 1.2 操作规则 1.2.1 细胞的制备 1.2.1.1 制苗用细胞的来源。制苗用细胞为1～4日龄健康犊牛睾丸细胞。犊牛睾丸应选用非猪瘟疫区，无口蹄疫、粘膜病等传染病地区。 1.2.1.2 牛睾丸的采集和处理将犊牛体表消毒，以无菌手术采取牛睾丸，放在含适宜抗生素的Hank's液或Earle's液中浸泡30～40min。再无菌除去被膜、副睾，把组织剪成1～2mm小块，用Hank's液或Earle's液所配的洗液反复冲洗，至上清液清亮为止。 1.2.2 细胞的消化 1.2.2.1 将组织块放入消化瓶中，牛睾丸组织块加5～8倍0.25％胰酶溶液。 1.2.2.2 塞紧瓶口，置37℃水浴消化30-min，不含予热时间。在消化过程中，每隔10min轻摇一次，消化完毕时除去胰酶溶液。 1.2.2.3 细胞分散及培育倒去胰酶溶液后，脱酶用Hank’s液或Earle’s液反复冲洗2～3次，再加入营养液，以玻璃珠振摇法或吹打法分散细胞，反复进行3～4次。用8～10层纱布将细胞过滤，收取细胞悬液，分装培养瓶，装量为瓶容积的l／10，塞紧瓶口，置36～37℃进行旋转培养，转速为10～12r/h，一般于第3～5天细胞长成单层。细胞传代及检验牛睾丸原代细胞长成单层以后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以1：3～1：5制成次代细胞悬液，继续转瓶培养3～5日，形成良好单层。同时，将次代细胞悬液分装到检验用的小扁瓶和带盖玻片的林氏管中培养并作检验，应达到如下标准：细胞培养用血清不含牛粘膜病病毒抗体。细胞培养物应无特异性病变，无细菌、霉菌（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）和支原体（见《支原体检验标准操作规程》）污染，不吸附豚鼠红细胞。细胞培养物用猪瘟、猪细小病毒和牛粘膜病三价荧光抗体染色，应阴性结果。将细胞冻融液接种vero细胞，应不出现任何病变（见《非禽源外源病毒检测标准操作规程》）。 1.3 清场和记录 1.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 1.3.2 全面填写《生产工序记录》。 2 生产用毒种的制备 2.1 条件准备 2.1.1 根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。 2.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 2.1.3 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 2.2 操作规则 2.2.1 毒种繁殖 2.2.1.1 脾毒的繁殖 2.2.1.1.1 家兔的选择选用营养良好，体重1.5～3.0kg的健康家兔。购入家兔应隔离饲养观察30天以上。家兔在接种前，至少应测温观察3天，每天上、下午测体温各一次，选用体温正常、温差波动不大的健康家兔。 2.2.1.1.2 接种将冻干毒种用灭菌生理盐水制成20-50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1m1。 2.2.1.1.3 测温观察家兔接种后，上、下午各测体温一次，24h后，每隔6h测体温一次。 2.2.1.1.4 热型判定接种家兔的体温反应分为四类 A 定型热反应(++) 潜伏期24～48h，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，至少有3个温次，并稽留18～36h。 B 轻热反应(+) 潜伏期24～72h，体温上升有一定曲线，超过常温0．5℃以上，至少有2个温次，并稽留12～36h。 C 可疑反应(±) 潜伏期不到24h，或超过72h以上，体温曲线起伏不定，或稽留不到12h，或稽留超过36h而不下降。 D 无反应(一) 体温正常者。注：常温家兔接种前3天所测体温的平均温度。潜伏期由接种时算起，到体温上升超过常温0．5℃以上的间隔时间。稽留期由体温上升超过0.5℃算起，到体温下降到常温或接近常温的间隔时间。 2.2.1.1.5 毒种收获选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24h内剖杀，以无菌操作采取脾脏冷冻或冻干保存，作为生产用毒种。 2.2.1.1.6 本毒种对家兔无特征性病变，各脏器可以有轻度充血、出血，脾、淋可能有不同程度的肿胀。如发现有异样病变或任何时期死亡的兔，均不得使用。 2.2.1.2 细胞毒的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3%～0.5%的病毒悬液，接种生长良好的牛细胞，置 36～37℃继续培养。每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。 2.2.2 毒种鉴定 2.2.2.1 对细胞的感染性毒种接种牛睾丸或羊肾细胞均不致细胞病变。 2.2.2.2 对家兔的感染性毒种接种家兔仅产生特异性热反应，不致死家兔。 2.2.2.3 病毒含量脾毒对家兔的最小感染量为≤10-5/m1。 2.2.2.4 安全性脾毒用无菌生理盐水作10倍稀释，细胞毒用原液接种无猪瘟中和抗体的健康敏感猪4头，每头肌肉注射5ml，接种后每天上、下午各测体温、观察一次，观察21天。体温、精神、食欲应正常。 2.2.2.5 纯净毒种应无细菌、霉菌(见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》)、支原体(见《支原体检验标准操作规程》)及外源病毒（见《外源病毒检验标准操作规程》）污染。 2.2.2.6 特异性将毒种用抗猪瘟病毒特异性血清中和后，接种家兔2只，在96h内不引起热反应及发病死亡。 2.2.2.7 基础种子代次为478～490代。 2.2.3 毒种保存在-15℃以下保存，脾毒不超过25天，细胞毒不超过6个月。 2.2.4 毒种继代，脾毒不超过5代，细胞毒不超过3代。 2.3 清场和记录 2.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 2.3.2 全面填写《生产工序记录》。 3 半成品的制备 3.1 条件准备 3.1.1 根据毒液繁殖所需物料及设备条件，进行全面准备。 3.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 3.1.3 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 3.2 操作规则 3.2.1 接种取已形成良好单层的牛睾丸次代细胞培养瓶，弃去营养液，接种含3％～5％生产用细胞毒种或0．2％～0．3％脾毒种的维持液，置36～37℃继续培养。 3.2.2 收获接毒后5天作第1次收获换液，以后每隔4天收获换液1次。收获换液时，每个细胞培养瓶须备下列溶液：乳汉液，7.5%碳酸氢钠，双抗，健马血清。收毒的次数依细胞生长状况而定，一般收毒在六收左右。 3.2.3 收获的半成品置-15℃以下保存，应不超过3个月。 3.2.4 半成品检验 3.2.4.1 无菌检验将每组抗原分别取样，接种于T.G、G.A及G.P小管培养基中，各2支，每支接种0.2ml，一组置37℃，另一组置25℃培养，观察3～5天，应无细菌和霉菌生长（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）。 3.2.4.2 毒价测定各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml病毒含量≥60000个家兔感染量，方可用于配苗。 3.3 清场和记录 3.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 3.3.2 全面填写《生产工序记录》。 4 配苗 4.1 条件准备 4.1.1 根据配苗所需物料及设备条件，进行全面准备。 4.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 4.1.3 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 4.1.4 将检验合格的半成品于配苗前取出，融化待用。 4.2 操作规则 4.2.1 将检验合格的半成品和冻干稳定剂，以及抗生素放到100级工作台上。 4.2.2 把半成品混合在同一容器内，按一定比例加入冻干稳定剂、适量抗生素，充分混匀。每头份细胞毒液应不少于0.015ml。 4.3 清场和记录 4.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 4.3.2 全面填写《生产工序记录》。 5 疫苗的分装操作内容见《分装岗位标准操作规程》。 6 疫苗的冻干操作内容见《冻干岗位标准操作规程》。 7 轧盖、贴签操作内容见《轧盖、贴签岗位标准操作规程》。 8 包装操作内容见《包装岗位标准操作规程》 III 成品检验见《猪瘟活疫苗成品质量内控标准》。检验方法见《猪瘟活疫苗成品检验操作规程》二标准操作规程（SOP） 1 概念是指经批准用于指示操作的通用性文件或管理办法，SOP（standard operating procedure）包括生产操作、辅助操作以及管理操作规程。 2 SOP主要内容 2.1操作法名称。 2.2编号、颁发部门、生效日期。 2.3 所属生产（或管理）部门、产品、岗位、适用范围。 2.4操作方法（或工作方法）及程序。 2.5采用原辅料（中间产品、包装材料）的名称、规格。 2.6采用工器具的名称、规格及用量。 2.7操作人员。 2.8附录 2.9附页。例题目细胞制备岗位操作规程编码页数共页起草人审核人批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门 GMP认证办公室颁发数量生效日期分发单位公司各部门一、目的：确保活疫苗生产工作的质量。保证生产的顺利进行。二、适用范围：适用于活疫苗细胞制备工序。三、责任者：生产车间活疫苗细胞制备人员。四、正文： 1 条件准备 1.1 根据计划，提前准备好细胞制备所需物品如万瓶、瓶皿、三角瓶、漏斗、玻璃珠、解剖用眼科剪子、镊子、吸管等，按要求分别进行高压及干热灭菌备用。 1.2 使用前按物品的物流及消毒要求移入洁净工作间待用。 1.3 在工作开始前30～40min，按要求调整送风量，直至达到所需洁净级别。 1.4 在操作前对所准备的各种用品进行全面的检查核对。 2 操作规则 2.1 鸡胚成纤维细胞单层（CEF）的制备选择9－10日龄发育良好的ＳＰＦ鸡胚，先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌和玻璃器皿内，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌的剪刀剪成米粒大的小组织块，再用汉克氏液洗2－3次，然后加0．25％胰酶溶液（每个鸡胚约加４ml），在37.5－38.5℃水浴中消化20－30分钟,吸出胰酶溶液,用汉克氏液洗2－3次,再加入适量的营养液(用含5%－10%犊牛血清乳汉液,加适宜抗生素适量)吹打,用4－6层纱布滤过,制成每1 ml含活细胞数约100－150万的细胞悬液,分装于培养瓶中(每10000 ml圆瓶加入细胞悬液1000 ml)进行培养(每小时转速以9－11为宜).形成单层后备用(地般在24小时内应用)。 2.2 鸡胚皮肤细胞单层的制备方法（1）选择12－13日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃器皿内，用汉氏液洗涤胚体，再用灭菌的眼科镊子将皮肤轻轻地扒下，用剪刀在广口离心瓶中剪碎并用汉氏液洗2次，用0.25%的胰酶溶液（每个鸡胚约4ml）在37.5~38.5℃水浴中消化20~25分钟，然后吸出胰酶溶液，加入适当的营养液吹打，用4层纱布滤过，制成每1ml含活细胞数约100万的悬液，分装于培养瓶中（1000ml克氏瓶加入细胞悬液120ml），放入30℃温箱培养。形成单层后即可进行病毒接种（一般在培养后24h内应用）。方法（2）选择12~13日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，无菌取出鸡胚，放灭菌的烧杯中，用汉克氏液洗涤胚体，再用灭菌的镊子将胚夹入另一个放磁棒的灭菌三角瓶中，加37℃的0.25%胰酶溶液(每个鸡胚8－10ml)，放在磁力搅拌器上以低速搅拌消化约20－25分钟，取出加入适量含血清的汉克氏液中止消化。然后将胰酶及消化下来的细胞（即鸡胚皮肤细胞）液倒出，底部液用一层纱布滤过。这1000r/min离心10分钟，去上清液，加入适量培养液吹打分散细胞，用4层纱布滤过。根据细胞数加入所需的营养液，制成每1ml含活细胞数约100万的细胞悬液，分装于培养瓶中（1000ml克氏瓶加入细胞悬液120ml），培养同上，并用于接毒。 2.3 地鼠或乳兔肾细胞单层的制备（用于牛、羊伪狂犬病疫苗）选10－20日龄地鼠或乳兔，放血致死后，无菌采取肾脏，将其皮质部组织剪成１－２mm小块，用汉克氏液洗2－3次后，按组织重量的5倍，加入0.25%胰酶-汉克氏液（pH7.4－7.6），置36－37℃水浴消化30－40分钟，除去胰酶溶液后，用细胞生长液制成每1ml含60－80万细胞的悬液。细胞置37℃培养，2－4日后形成单层。 3 清场和记录 3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等按规定分别进行处理。 2.2 全面填写《生产工序记录》。三病毒的细胞培养细胞培养是培养病毒最常用的技术，可用原代细胞、二倍体细胞或传代细胞系，一般作静止或旋转培养。因病毒与细胞的种类而异，病毒感染细胞可产生自带病毒，可引起杀细胞变化，也可致非杀细胞变化。杀细胞变化的表现为细胞病变（CPE）涉及细胞膜或细胞骨架的损伤，病毒可使细胞坏死或凋亡。致非杀细胞变化的病毒通常为持续感染，被感染的细胞可产生干扰素，干扰素反过来干扰其它病毒对细胞的感染，干扰素的抗病毒作用并无病毒特异性（一）病毒的细胞养特点体外培养动物在100多年前已获成功，直到20世纪50年代采用了将组织细胞分散的技术，使组织培养变为细胞培养得以病毒研究，诊断及疫苗制备等方面。组织培养（tissueculture）和细胞培养（cell culture）在此领域基本是同义词前者包括后者。 1细胞培养中的每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也一致，没有试验动物的个体差异，而且可用于试验的数量远远超过动物和鸡胚，并且可在无菌条件下进行标准化试验，可重复好 2 感染细胞的病变可通过观察细胞产生的变化如细胞病变等来判定结果，也可结合疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。 3 细胞培养的重要途径之一是感染的动物组织内分离病毒以及病毒克隆，从样本分离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。通过细胞培养挑选产生的空斑（蚀斑）可达到克隆的目的（二）细胞培养的类型 1原代细胞（primary cell）动物组织经胰蛋白酶等消化、分散、获得单个细胞，在生长于培养皿中大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一，鸡胚成纤维细胞（CEF）4h左右即可贴壁，24h可长成致密单层，肾和睾丸生长较慢，原代细胞一般对病毒较易感染，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞 2 二倍体细胞株（diploid cell strain）将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化，例如培养猪瘟用的犊牛睾丸细胞、猪传染性胃肠炎用的乳猪肾细胞 3 传代细胞系（establishell cell line）与上述两类细胞不同，这类细胞在传代过程中染色体发生异常变异，在体外可无限制分裂的异倍体癌变细胞优点：传代及培养方便，可节约元材料，因此使用广泛缺点：1有的对分离的野毒不敏感 2实验室传代日久，可能污染支原体、霉形体、或隐性感染病毒。本厂传代细胞有CRFK F81 DK MARC—104 MARC- 145 PK15 BHK21 CHO VERO HELA （三）细胞培养的方法 1 静止培养将细胞悬液接入培养瓶或培养板中置于恒温箱内或温室中静止培养，细胞成长繁殖成单层或克隆。静止培养是最常用的细胞培养方法，广泛用于病毒研究和生物制品制造。例如扁瓶 37℃ 细胞培养板一般需在含5%的二氧化碳条件下培养。 2旋转培养将细胞液接入转瓶后放于恒温箱的转瓶机上，转数一般为10-12转/h 3悬浮培养是通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于细胞培养液内的方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产但克隆抗体的杂交瘤细胞。对于正常细胞（贴壁依赖性细胞）某些传代细胞不适用，这些细胞在悬浮下很快死亡。 4微载体培养微载体一细小的颗粒未细胞在载体，通过搅拌悬浮在培养液内使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点 5中空纤维细胞培养该技术模拟动物体内环境，使细胞能在中空纤维上形成类似组织的多层细胞生长，细胞周围犹如密布微血管，可以不断获得营养物质，同时又可将细胞代谢产物、废物和分泌物送到培养液中被运走。系统由中空纤维生物反应器、培养及容器、供养其和蠕动泵组成（四）单细胞的制备 1 原代细胞的制备原代细胞制备时首先选取适当组织或器官，如鸡胚体、犊牛睾丸、乳猪肾等，采用机械分散法如剪碎、挤压等使之成为小块（约为1mm3 ）然后用0.25%－０.5%胰酶(ph7.4－７.6)消化掉细胞间的组织蛋白,消化的时间长短与温度、组织的来源及大小等有关，一般37℃ 消化10－30min，４℃消化需要过夜。消化好的组织块去掉胰酶经吹打成分散的细胞，用于培养。　 2 传代细胞的制备单层细胞传代时多采用FDTA（乙二胺四乙酸二钠）-胰酶消化法，胰酶浓度为0.025%,其作用是消化细胞间的组织蛋白;EDTA 浓度为0.01%其作用是螯合维持细胞间结合的钙镁离子和细胞与细胞间的钙镁离子，使细胞易脱落和分散。单层细胞经 EDTA-胰酶消化，洗涤2~3次，再加入少量消化液消化，待细胞刚刚圆缩时即可加入营养液轻轻吹打，使之分散为单细胞。某些半悬浮培养或悬浮培养的细胞如SP2/0瘤细胞，不需要消化，采用机械吹打即可形成单细胞。 3细胞冻存于复苏细胞株与细胞系均需要保存于液氮中（-196℃）。为防止细胞在冻存过程中因渗透压、PH值等变化以及机械损伤而影响活力，须向培养液中加入亲水性强、毒性小、易通过细胞膜的DMSO（二甲基亚砜）作为保护剂，从而使冰点降低，在缓慢冻结下能使细胞水分在冻结前透过细胞外，以防止细胞内形成冰晶对细胞造成的伤害。DMSO终浓度为5%－15%，常用10%。为保持细胞最大活率，一般采用慢冻快融法。常用冷冻速度为每分钟下降1－２℃，当当温度达-25℃时，速度可增至5－１０℃/min，到-100℃时则可迅速浸入液氮中。也可采用如下程序：取对数生长期细胞消化后离心，将细胞沉淀用冻存液（10%DMSO，20%犊牛血清，70%MEM）悬浮至200万－500万/ml细胞数，分装于细胞冻存管后4℃放置1h，然后-20℃冰箱放置2h，再放入-70℃冰箱4－６h后放入液氮保存。复苏时要求快速融化以防止损害细胞。通常将从液氮中取出的细胞管置３７－４０℃水浴４０－６０s融化，离心后除去冻存液，然后将细胞悬浮于培养液中培养。必要时待细胞完全贴壁后换液一次，以防止残留的DMSO对细胞有害。细胞在液氮中可贮存３－５a。通常，每冻存１a应再复苏１次。（五）细胞培养要素 1培养液以往多用天然培养液，现多用合成培养液。合成培养液有多种，如Eagle氏液、RPMI-1640、MEM和199等，各有其特点和适用范围。Eagle液主要成分为13种必需氨基酸、8种维生素、糖和无机盐等成分RPMI-1640、199乳汉液还含有其它氨基酸。不同培养液适用于不同细胞，乳汉液多用于鸡胚成纤维细胞培养；Eagle液主要适用于各种二倍体细胞，是最常用的细胞培养液，RPMI-1640、MEM液主要用于传代细胞的培养。 2血清在细胞培养液中必须添加一定量的血清方能获得成功。血清中除了含有细胞生长的部分氨基酸外，还有促进细胞生长和贴壁的成分。血清中的。-球蛋白和白蛋白能促进细胞生长，刺激细胞的生长活力；白蛋白具有解除脂肪酸、胰酶及金属离子等的毒性作用;糖蛋白、α２-球蛋白和β脂蛋白G２能促进细胞贴壁。此外，血清中的一些滤过物质乃是刺激和促进细胞生长的重要因子。不同动物种血清的作用差别很大，即使同一种动物种的不同个体间的差异也很显著。实践证明，同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于马血清；马血清又优于兔血清和鸡血清。目前国内多用犊牛血清，使用前须经５６℃灭活３０ min，并进行细胞毒性试验。生长液血清含量一般为５%－２０％。不同种细胞要求血清量也不同，大部分细胞生长液中加入１０％血清已可满足细胞生长要求。维持液中血清量为0％－5％。最好尽可能不加入血清以维持细胞活力，并避免血清对病毒增殖的抑制作用。目前国内外正在研制无血清培养液，以避免血清中某些物质对细胞生长和病毒复制的影响。无血清培养液由基础培养液和血清替代因子组成。常用的基础液为MEM、199、DMEM、F12、RPMI-1640、DMEM+F12（1：1，称SFFD）和RPMI-1640+DMEM+F12（2：1：1，称RDE等。血清替代因子有激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、聚赖氨酸）和微量元素（如硒）4类几十种，其中有些是主要而且必需的，有些为辅助作用因子。多数无血清培养液须补加3－8种血清替代因子。３细胞接种量　　　在适宜的培养条件下，需要有一定量活细胞才能生长繁殖，这是因为细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，作用也小。此外，细胞接种量和形成单层的速度也有关，接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多对细胞生长也不利。一般为鸡胚成纤维细胞为１００万／ml，小鼠或地鼠肾细胞为50万/ml，猴肾细胞量为30万/ml，传代细胞为10－30万/ml。 4 PＨ细胞生长的PH为6.6－7.8,但量适PH YL 7.0－7.4。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。细胞代谢产生的各种酸性物质可使PＨ下降，而培养液中的ＮaＨＣＯ３产生ＣＯ２又使PＨ增高。必要时可使加入氢离子缓冲剂HEPES（１０－１５mmol/L）以增加培养液的缓溃能力。５温度细胞培养的最适宜温度应与细胞来源的动物提温一致，在此基础上，如升高2~3℃，则对细胞产生不良影响，甚至在24h死亡。低温对细胞影响小，在20~25℃时对细胞仍可缓慢生长。此外，成功的细胞培养还需要严格的无菌操作及洁净的培养器皿。（六）细胞培养的污污染染问题细胞培养污染是指在细胞培养过程中，有害的成分或异物混入细胞培养环境中，包括微生物（细菌、真菌、支原体、病毒和原虫等）、化学物和异种细胞等。但微生物的污染最常见，化学物污染较少，而细胞交叉污染近几年来随着细胞种类的增多也有发生。１．细菌污染　　多见于消毒不彻底、操作不严格和环境污染所致，表现为营养液很快混浊和PＨ下降，随着细胞死亡脱落。常见的污染有大肠杆菌、假单细胞菌和葡萄球菌等。应用抗生素预防或处理污染细胞有一定效果。２．真菌污染　　也与消毒不彻底和操作不严格有关。在培养液中可见白色或黄色小点状悬浮物，镜检时可见菌丝结构。念珠菌或酵母菌污染后镜检可见卵圆形菌分散于细胞周边和悬浮于营养液内，有折光性。真菌污染时可用两性霉素或制霉菌素处理，但效果不理想。３．支原体污染　　支原体在细胞培养中最常见，不易察觉，危害较大。目前细胞支原体污染率为50％－60％，主要源于犊牛血清、实验人员、细胞原始材料及已污染细胞。支原体污染可多方面影响细胞的功能和活力，如引起细胞产生病变、竞争细胞的营养、抑制或刺激淋巴细胞转化、造成细胞染色体缺损及促进或抑制病毒增殖等。检测支原体污染的方法很多，如相差显微镜法、荧光染色法和电镜观察法等。迄今尚无消除支原体污染的简便方法。日前多用以下方法：（1）抗生素（四环素、金属素、卡那霉素、泰乐霉素、新生霉素）处理；（2）41℃处理18h；（3）加入特异性抗支原体高免血清等。这些方法在一定程度上能降低支原体在细胞培养中的滴度，但很难彻底清除。４．病毒污染病毒污染是指细胞培养中出现非目的的病毒。其来源有：（1）组织带毒。如约胚成纤维细胞常有禽呼肠孤病毒；在某些细胞株和细胞系内也有潜在的病毒污染，如PK15细胞常有猪圆环病毒污染。（2 ）培养液带毒。主要是在病毒污染实验室中，培养液配制过程中受到污染。病毒污染后细胞往往出现病变。有些病毒虽不出现病变，却干扰目的病毒的增殖。细胞一旦污染病毒，就很难排除。因此主要以预防为主，如选择SPF动物组织、营养液配制用水和器皿应消毒后使用等。此外，在犊牛血清中，有时会发现一种新的细胞培养有害的胶原虫，一旦经污染就难于消除。目前惟一的方法是将犊牛血清37℃培养１个月以上，然后高速离心取沉淀物镜检检查胶原虫。此外，对SP2/0等肿瘤细胞可腹腔注射小鼠，利用巨噬细胞杀死部分胶原虫，然后再抽取细胞进行培养检验。（七）病毒增殖技术１．细胞的选择　　　病毒须在敏感的宿主细胞中增殖，病毒培养的宿主一般选择相应易感动物的细胞。如增殖口蹄疫病毒可选择牛、猪或地鼠细胞；马传染性贫血病毒选择马属动物的细胞等。但非敏感动物的细胞有时也能使病毒生长，如鸭胚成纤维细胞可培养马立克氏病毒。通常病毒的细胞感染谱是通过试验获得的（表４.３）同一病毒在不同敏感细胞增殖后其毒价不尽相同．２．细胞培养病毒要素　　　　病毒在敏感细胞上增殖需要一定条件，包括维持液、犊牛血清量、温度、PH、病毒接毒量和方法等，只有在最佳条件下，病毒才能大量增殖，毒价才会最高。表4-3 常见病毒细胞感染谱病毒敏感细胞口蹄疫病毒狂犬病病毒伪狂犬病病毒日本乙型脑炎病毒猪瘟病毒猪水泡病病毒猪传染性胃肠炎病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒猪细小病毒猪脑心肌炎病毒牛病毒性腹泻-黏膜病病毒牛流行热病毒牛传染性鼻气管炎病毒马传染性贫血病毒鸡传染性喉气管炎病毒鸡痘病毒鸡传染性法氏囊病病毒鸡马立克氏病病毒鸭瘟病毒小鹅瘟病毒兔黏液瘤病毒犬瘟热病毒犬传染性肠胃炎病毒犬传染性肝炎病毒犬细小病毒犬副流病毒猫泛白细胞减少症病毒水貂传染性肠炎病毒水貂阿留申病毒ＢＨＫ21、ＰＫ15、ＩＢＲＳ21细胞，牛、猪、羊肾原代细胞ＢＨＫ21、Ｗ126细胞，鸡胚成纤维细胞猪、兔肾原代细胞，鸡胚成纤维细胞、ＢＨＫ21 鸡胚成纤维细胞、仓鼠肾细胞ＰＫ15细胞、猪肾细胞ＰＫ15细胞、ＩＢＲＳ21细胞，猪肾细胞猪肾、猪甲状腺细胞，唾液腺细胞Ｍarc145、ＣＬ2621，猪肺泡巨噬细胞ＰＫ15细胞ＳＴ细胞、猪肾细胞鼠胚成纤维细胞（FMF）、ＢＨＫ21细胞牛肾细胞、牛睾丸细胞牛肾、睾丸细胞，ＢＨＫ21、Ｖero细胞牛睾丸细胞、猪肾细胞、ＨeＬa细胞驴、马白细胞鸡胚肾细胞鸡胚成纤维细胞、鸡胚肾细胞鸡胚成纤维细胞鸡、鸭胚成纤维细胞鸡、鸭、鹅胚成纤维细胞鹅胚成纤维细胞乳兔肾细胞、鸡胚成纤维细胞鸡胚成纤维细胞、犬肾细胞、Ｖero细胞 MDCK细胞.FK81细胞.NLFK细胞.CRFK细胞.猫.犬肾细胞 MDCK细胞、犬睾丸细胞、肾细胞 MDCK细胞.FK81细胞.犬猫胚肾细胞.水貂肺细胞系(CCL-64) Ｖero细胞，犬、猴肾细胞ＦＫ81细胞、NLFK细胞、CRFK细胞、FLF31细胞、猫肾细胞ＦＫ81细胞、NLFK细胞、CRFK细胞，猫、水貂肾细胞水貂肾细胞（1）血清细胞培养必须加入一定量血清。但是，血清中存在一些非特异性抑抑制因子，它们对某些病毒的生长和增殖有抑制作用，经56℃30min不能被灭活。所以犊牛或成牛血清对某些病毒增殖的明显的抑制作用，如水貂传染性肠炎病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等。为了克服血清中非特异性抑制因子的作用，病毒维持液内犊牛血清含量一般不超过2%。大多数病毒细胞培养维持液不加血清，但对同步接毒的病毒细胞培养，如细小病毒必须加入一定量血清。为降低血清对病毒增殖的抑制，有时用高岭土或受体破坏酶（RDE）处理可起到一定效果。（2）温度病毒细胞培养的温度多数为37℃，此温度有利于病毒吸附和侵入细胞，如脊髓灰质炎病毒在1℃时对细胞的吸附率是其在37℃时的1/10；口蹄疫病毒于37℃可在3－5min内使90％的敏感细胞发生感染，而在25℃时需要20min，15℃以下则很少引起感染。有些病毒的量适温度或高于37℃，如狂犬病病毒适宜温度为30－40℃，最适宜温度为32℃；犬疱疹病毒量适宜增殖温度为35－37℃，通常用36℃；阿留申病毒在31。8℃条件下能在猫肾细胞复制增殖。（3）pH 细胞在生长过程中产生各种酸类物质，使生长液pH下降。细胞感染病毒后由于代谢障碍而使产酸能力下降，且因细胞在破坏释放碱性成分，故维持液pH值下降很慢。但大部分病毒感染细胞后需要3~7d才会出现明显病变，在此期间维持也重酸性物质仍可蓄积较多，导致维持液pH降至很低。因此在配制液时ph一般在7.6~7.8才能防止细胞过早老化，有利于病毒增殖。如果维持液pH下降过快或过低，可用7.5%NaHCO3液调整，如腺病毒细胞培养，由于感染细胞的有丝分裂受阻，糖酵解增高，产酸量增高，维持液pH下降很快。（4）接种量与接种方法病毒接种一般按维持液的1%~10%（V/V）量接入。接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价；接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒，如水泡病毒。为获得培养液中典型病毒和高度感染性，接种时必须用高稀释度的病毒液，如应用高浓度的病毒也传代，在第3~4代时会出现明显的缺陷病毒，发生自我干扰现象，病毒滴度下降。科学的接种量应以TCID50为依据。病毒的接种方法有两种：异步接毒和同步接毒。异步接毒是指细胞长成单层后倒去生长液，按维持液的1%－10%（V/V）量接毒，37℃吸附1h后加入维持液。多数病毒采用该种接毒方式。同步接毒是在种植细胞的同时或在种植细胞后4h内将病毒接入，主要用于病毒复制发生在细胞有丝分裂盛期的病毒，如细小病毒等。 3．支原体污染问题支原体污染影响病毒的增殖，可使病毒蚀斑形成单位平均下降10倍。如痘病毒、犬瘟热病毒、马立克病毒和新城疫病毒等，均能被鸡毒支原体所抑抑制。但支原体污染使病毒增殖强的例子也有报道，如精氨支原体污染的鼠胚成

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