祖卡木颗粒对低氧性肺动脉高压的药效及机制研究.pdf

祖卡木颗粒对低氧性肺动脉高压的药效及机制研究刘芮绮袁天翊王冉冉郑瑞芳龚迪菲王守宝邢建国杜冠华方莲花(.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室北京.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室北京.新疆药物研究所新疆维吾尔药重点实验室乌鲁木齐)摘 要 目的 探究祖卡木颗粒对单纯低氧及低氧 诱导的低氧性肺动脉高压()小鼠的防治作用及其可能的作用机制 方法 利用多种数据库及相关文献搜集祖卡木颗粒中 种单味药的活性成分预测药物靶点并获得 相关靶点进行网络构建及富集分析 通过单纯二周低氧及四周低氧 诱导建立 小鼠模型观察小鼠右心室压力等主要药效学指标 染色观察肺组织病理变化 检测肺组织中 相关 蛋白质()、淋巴细胞瘤 基因()、磷脂酰肌醇 激酶()、内皮型一氧化氮合酶()、低氧诱导因子 亚基()蛋白表达水平 结果筛选得到祖卡木颗粒共 种活性成分与 有 个交集靶点涉及、等靶点 验证结果显示祖卡木颗粒可以显著降低 小鼠的右心室压力减轻右心室肥厚下调小鼠肺组织中、蛋白的表达上调、蛋白的表达 结论 祖卡木颗粒可能通过调节/及/信号通路对 起到防治作用关键词 祖卡木颗粒低氧性肺动脉高压网络药理学药效机制 相关 蛋白质/淋巴细胞瘤 基因磷脂酰肌醇 激酶内皮型一氧化氮合酶/低氧诱导因子 亚基中图分类号 文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(.)()././肺动脉高压()是一种由于肺血管阻力增加肺动脉压力上升导致的病理生理障碍其诊断标准为在海平面静息状态(不同的海拔高度可以换算为海平面)通过右心导管测量的平均肺动脉 压()(.)的病因和发病机制复杂多样与许多个体和环境因素有关通常导致肺血管收缩、肺血管平滑肌异常增生和肺血管重构最终导致右心衰竭甚至死亡目前根据不同的发病机制可将 分为 类其中第三类低氧性肺动脉高压()是由缺氧和肺部疾病导致的 主要包括慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化、特发性间质性肺炎、合并肺纤维化和肺气肿、结节病、阻塞性睡眠呼吸暂停和高海拔导致的低通气和缺氧相关的 等 在众多刺激因素中缺氧在 的产生与发展中起重要作用 通常由于高海拔或慢性缺氧肺疾病等导致缺氧进而导致肺血管收缩激活缺氧敏感的炎症反应和增殖途径以及肺实质的重塑和破坏 病理特征包括内皮细胞功能障碍、信号传导异常、多细胞和血管的异常增生等 这一过程导致更持续的血管阻力引起右心室压力升高及右心衰竭 目前临床治疗方案包括靶向血管收缩和增殖的信号通路但仅能缓解症状很难逆转右心室重构因此寻找新的潜在治疗药物具有重要意义祖卡木颗粒()作为一种维吾尔族的特色民族药具有调节异常气质及清热、发汗、通窍等功效用于治疗感冒咳嗽、发热无汗、咽喉肿痛、鼻塞流涕等 近年来对于其治疗新型冠状病毒肺炎等肺损伤疾病的研究提示祖卡颗粒对于肺部具有一定的保护和抗炎治疗作用生物信息学研究亦显示祖卡木复方可调控多条炎症相关信号通路 因此本文研究其对于肺动脉高压的潜在防治作用并开展了生物信息学研究、药效学验证以及其作用机制的探究 材料与方法.祖卡木主要成分筛选及靶点获取 根据祖卡木收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金面上项目资助项目()中国医学科学院医学与健康科技创新工程()新疆自治区重大科技专项课题()作者简介 刘芮绮()女辽宁抚顺人在读博士研究方向:心脑血管药理学与新药发现:电话:通信作者 杜冠华()男山东滕州人研究员博士研究方向:高通量药物筛选与新药发现 电话:通信作者 方莲花()女吉林图们人研究员博士研究方向:心脑血管药理学与新药发现 电话:颗粒配方:山柰、睡莲花、破布木果、薄荷、大枣、洋甘菊、甘草、蜀葵子、大黄、罂粟壳 通过 (:/./.)和 (:/./)两 个 数 据 库 检 索 收 集 全 部 主 要 成分 口服生物利用度()和类药性()是评价化合物在药物代谢过程中的重要参数活性化合物的选择参数设置为.其中洋甘菊、破布木果和蜀葵子的个别成分通过文献中获得并利用 数据库及 数据库检索获得化合物的 号 基于结构相似性原理在 数据库中检索化合物可能性大于.的靶点(:/./).肺动脉高压疾病相关靶点获取 以“低氧性肺动脉高压”为关键词在 数据库(:/.)和 数据库(:/.)中进行检索并去除其中的重复基因筛选评分大于 的靶点 将活性成分靶点与 相关靶点的交集作为祖卡木颗粒治疗 的潜在靶点.中药活性成分关键靶点疾病网络和靶点通路网络构建 使用 .进行网络可视化分析节点的度值、中心性、平均最短路径等拓扑参数并分析其中的主要节点信息.蛋白相互作用()网络构建 使用 数据库(:/./)通过蛋白质之间的直接的物理相互作用和间接的功能相关性构建祖卡木颗粒潜在靶点之间的交互关系网络.基因本体()和京者基因组百科全 书()富集分析使用 (:/./.)数据库进行分析 将主要成分与疾病相关的交集基因输入选择物种为“人类”并分别进行生物过程、分子功能、细胞组成和 途径富集分析 将 值最小的前 项及其参数上传到微生信(.)在线平台中进行进一步的可视化分析.实验验证.实验动物 无特定病原体()级雄性 小鼠 只体质量约 购自斯贝福医药导报 年 月第 卷第 期(北京)生物技术有限公司 实验动物于中国医学科学院药物研究所动物饲养中心饲养 恒温()、恒湿(相对湿度)环境自由摄食饮水适应性饲养 后进行实验 实验动物生产许可证号(京)实验动物使用许可证号(京)实验动物伦理编号 针对动物的所有实验条件和实验操作均符合中国医学科学院药物研究所动物伦理委员会指导原则.药品与试剂西地那非(美国 公司纯度:.)以.羧甲基纤维素钠()溶液配制成 混悬液祖卡木颗粒(新疆银朵兰药业股份有限公司生产批号:)以温水配制成 溶液(美国 公司纯度:.)使用时将 用二甲亚砜()()聚山梨酯()超纯水()混合溶剂配制成 溶液其他试剂均为国产分析纯.仪器与设备 生物机能试验系统(成都泰盟科技有限公司)微型压力导管(美国 公司 )高速冷冻离心机(美国 公司 )酶标仪(美国 公司)低氧舱(广州华粤行公司).单纯低氧两周预防给药实验 在单纯低氧两周预防给药模型中将 只小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、西地那非组及祖卡木组实验方案如图 所示 祖卡木组灌胃给予祖卡木颗粒混悬液.西地那非组灌胃给予西地那非溶液.正常对照组、模型对照组均灌胃给予等体积相应溶剂 动物适应性饲养后预防给药 每日 次 此后除正常对照组饲养在常氧环境中外其余 组置低氧舱饲养 周氧含量 期间每日给药 次 使用模型为低氧诱导的肺动脉高压经典模型给药剂量由祖卡木颗粒说明书剂量换算得小鼠剂量.低氧 周 治疗给药实验 分组及给药剂量同“.节”如图 所示动物适应性饲养 图 单纯低氧 周预防给药实验方案.图 低氧 周 治疗给药实验方案.后除正常组饲养在常氧环境中其余 组置低氧舱饲养 周氧含量 前 周每周皮下注射()次 第 周起每日给药 次.称重观察 实验过程中观察小鼠状态和死亡情况记录体质量等指标.实验动物处理实验终点时用异氟烷麻醉小鼠通过米勒导管测量右心室收缩压()并通过腹主动脉取血 将小鼠由腹部剪开至胸腔打开胸腔暴露心脏针头由右心室心尖进入用.氯化钠溶液进行灌注至灌洗液无明显红色、器官泛白为止 取小鼠心、肝、脾、肺、肾用.氯化钠溶液冲洗干净滤纸吸干水分分析天平称质量脏器指数()脏器质量/小鼠体质量沿心耳下缘将整个心室从心脏上剪下沿心室间隔边缘剪下右心室称量右心室()及左心室加室间隔()质量计算/()确定有无右心室肥厚.染色观察病理损伤情况分离小鼠左肺立即用盐水冲洗然后在 多聚甲醛中固定 在脱水和清除后将肺包埋在石蜡中 石蜡包埋的组织用 染色 在光学显微镜下观察切片的形态变化获得显微照片.蛋白质印迹法()检测蛋白表达 将小鼠肺组织剪碎并在冰上研磨收集组织在.离心管内加入适量 裂解液经组织匀浆和超声处理后置于冰上继续裂解直至裂解完全经 离心 取上清 采用 蛋白浓度检测法进行总蛋白定量 取总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白转膜 将蛋白转移至聚偏氟乙烯()膜 膜浸泡于 脱脂牛奶(配制)室温下封闭 以 相关 蛋白质()()、淋巴细胞瘤 基因()()、内皮型一氧化氮合酶()()、低氧诱导因子 亚基()()、磷脂酰肌醇 激酶()()、兔抗()、鼠抗()抗体进行孵育 过夜 洗膜后二抗与 膜于室温下作用 再次洗膜 将发光液 和 等量混匀在 膜上滴加适量的 发光试剂室温下作用 并使用全自动化学发光分析仪进行检测.统计学方法采用 .版软件作图 进行数据统计分析以.的靶点 个低氧性肺动脉高压疾病靶点去重后筛选评分 的靶点 个取交集后共同靶点 个 见图 图 祖卡木颗粒主要活性成分靶点、疾病靶点和共同靶点.祖卡木颗粒中抗 相关成分与靶点的相互作用分析 利用 软件构建了化合物靶点网络图 如图 所示网络由 个节点(主要成分 个、化合物 个和 相关靶点 个)和 个相互作用组成 外圈代表祖卡木处方中的各药物及其主要成分中间蓝色矩形表示通过文献及预测的祖卡木与 的共同靶点连线表示其相互作用节点越大、颜色越深表示该节点度值越大 结果表明网络中度参数较高的化合物包括山奈酚、木犀草苷、槲皮素、芦荟大黄素、甲氧基甲基异黄酮等这些化合物可能在祖卡木的抗 作用中发挥更重要的作用.构建 与分析网络度值是指连接的链接数与相邻节点数是反应节点在网络中重要性的拓扑参数 使用 工具构建了祖卡木颗粒治疗 的潜在靶点 网络节点代表靶点边表示 的相互作用节点的颜色强度与网络中的度值成正比 如图 所示 等关键靶点与其他靶点的相互联系更强也参与多种信号通路可能在祖卡木的抗 作用中发挥更关键的作用医药导报 年 月第 卷第 期图 祖卡木药物主要成分靶点网络图.图 祖卡木对 潜在靶点构建 的网络生物学分析.分析利用 平台对祖卡木治疗 中的潜在靶点进行富集分析包括这些靶点参与的生物过程、分子功能、细胞组成 途径富集分析 点的大小表示富集目标的数量点的颜色代表基于 值的显著性程度 如图 所示潜在的治疗靶点参与多个生物过程包括“低氧反应”“药物反应”“激素反应”包括“血浆组成”“膜筏”在内的细胞组成(图)以及“酶结合”“激酶活性”在内的分子功能(图)提示低氧过程可能是疾病进展的重要因素.分析 为了进一步阐述靶点和通路之间的关系使用 数据库和 在线工具进行通路富集分析 颜色深浅表示不同的 值(.)而圆圈的大小表示数目 结果显示这些靶点主要参与增殖相关通路等(图).实验验证结果.单纯低氧两周预防给药模型药效学评价 实验中观察到模型对照组小鼠与正常对照组比较欠活泼精神萎靡 如图 所示预防给药阶段 组小鼠的体质量均呈逐渐增加其中祖卡木组的上升趋势最为明显 进入低氧环境后 组小鼠体质量均明显降低与模型对照组比较西地那非与祖卡木对体质量无明显改善 是检测肺动脉高压的金指标 如图 及 所示与正常对照组比较模型对照组小鼠 显著升高(.)与模型对照组比较西地那非组(.)与祖卡木组(.)均显著下降 小鼠的右心室指数和心脏指数是评价心室重构的重要指标 与正常对照组比较模型对照组右心室指数显著增加(.)模型对照组西地那非组与祖卡木组比模型对照组显著降低(.)与正常对照组比较模型对照组和西地那非组的心脏指数(图)和心室指数(图)有轻微增加而祖卡木组轻微下降但差异无统计学意义不同脏器指数可以作为评价药物调节作用的重要指标 肺指数通常可代表肺性病变的严重程度由于炎性渗出等原因使肺重量增大肺指数越大提示肺病变越严重 如图 至 显示与正常对照组比较模型对照组的肺指数显著升高(.)与模型对照组比较西地那非组与祖卡木组的肺指数仅轻微降低无明显变化 脾脏是体内免疫的中枢西地那非组与正常对照组比较脾指数明显降低而祖卡木组比西地那非组明显升高 肝指数与肾指数均无明显影响.低氧 周 治疗给药模型药效学评价如图 所示当对模型对照组、西地那非组和祖卡木组进行低氧加皮下注射 后 组小鼠体质量明显下降 给药后祖卡木组体质量水平与其他两组比较上升趋势最为明显将小鼠肺组织固定、包埋、切片 染色法观察肺组织尤其是肺动脉血管病理变化(图)与正常对照组比较模型对照组小鼠肺血管明显增厚(.)西地那非组和祖卡木组肺部病理状态有所改善(.)如图 及 所示与正常对照组比较模型对照组小鼠 显著升高(.)与模型对照组比较西地那非组与祖卡木组 均显著下降(.生物过程.细胞成分.分子功能.分析图图 祖卡木颗粒对 潜在靶点的 富集分析图及 分析图.)提示两者对肺动脉高压均有一定治疗效果且祖卡木效果优于阳性药西地那非 与正常对照组比较模型对照组右心室指数显著上升(.)右心室指数祖卡木组与模型对照组比较显著下降(.)提示祖卡木对于减缓肺高压引起的右心室重构有一定作用 与模型对照组比较西地那非组右心室指数也有一定降低(图)对于心重指数和心室指数 组均无明显统计学差异(图 及)图 至 显示与正常对照组比较其余 组的肺指数显著升高与模型对照组比较祖卡木组的肺指数有所降低 而对于脾指数与正常对照组比较模型对照组脾指数明显降低西地那非组与祖卡木组均有所回升.祖卡木下调肺组织中 的表达并上调 的表达 为了探讨祖卡木对缺氧诱导的血管重构保护作用的可能机制本研究检测了肺组织中 以及 的蛋白水平 结果表明缺氧可上调 的表达(.)并下调 的表达(.)而西地那非和祖卡木可以有效逆转这一情况(.)见图.祖卡木上调肺组织中 及 的表达并降低 的表达 是具有磷脂酰肌醇激酶活性的二聚体由调节亚基 和催化亚基 组成 分为三类:内皮型 ()、诱导型()、神经元型()实验使用 方法检测了小鼠肺组织中 亚基、磷酸化、及 的蛋白表达水平 图 所示与正常对照组比较模型对照组、及 的蛋白表达水平显著下调 的表达显著上调(.)西地那非和祖卡木均可以显著上调、及 的表达水平并下调 的表达(.)讨论祖卡木颗粒作为我国民族药的重要瑰宝在治疗医药导报 年 月第 卷第 期与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.图 四组小鼠体质量趋势、右心指数及脏器指数().()上呼吸道疾病以及急性肺损伤等疾病中发挥了重要作用 既往研究主要集中在其对于呼吸道感染及肺部疾病的抗炎和免疫治疗作用而缺乏对于 的防治研究及其可能机制的探讨 本研究首先通过网络药理学分析手段对祖卡木颗粒中的主要生物活性化合物、潜在靶点和信号通路进行分析预测其可能的分子作用机制并在动物体内进行预防及治疗实验药效的初步验证最后通过分子生物学分析验证其发挥作用的潜在信号通路首次发现了祖卡木颗粒对于 的防治作用本研究通过网络药理学构建了多组分和多靶点网络图更好地阐明了疾病和药物相关的基因靶点相互关系 通过 富集结果分析发现、等基因可能是祖卡木颗粒作用的关键靶点 的激活突变在许多疾病中常见导致 活性增加、下游信号转导增强、细胞增殖和肿瘤生长 此外和 分析预测祖卡木颗粒的潜在作用机制可能与低氧及增殖相关信号通路有关为后续实验验证及信号通路的选择提供了理论依据研究发现 可以调控 的表达缺氧诱导因子作为肺缺氧反应的重要调节因子与 的发病机制相关 可进一步调节参与糖代谢和血管生成的下游蛋白的表达如血管内皮生长因子等缺氧条件启动 亚基与 亚基的核转位和结 与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.图 组小鼠体重趋势、病理图(染色)、右心指数及脏器指数().()()合而激活的 通过诱导或抑制广泛的基因参与调节血管张力、血管生成、红细胞生成、细胞代谢、增殖、存活和自噬反应从而启动对缺氧的适应性反应因此在 病理状态下 表达量增高此外 属于脂质激酶家族其特点是能够磷酸化质膜中肌醇磷脂中的肌醇环 基团 是内皮细胞合成 所必需 信号通路在各种细胞迁移增殖、炎症反应和氧化应激的调节中起着重要作用且 受 的调控 被认为与氧水平密切相关并激活 通路而 在无医药导报 年 月第 卷第 期 与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.与正常对照组比较.图 祖卡木对肺组织中/蛋白表达水平的影响()./()与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.图 祖卡木对肺组织中/蛋白表达水平的影响()./()氧情况下有助于 的稳定 在包括木樨草素、桔梗汤、丹参酮 等多种复方药物及天然产物对于 及其他肺部疾病的研究中发现/及 途径是药物发挥作用的关键通路肺动脉重塑与肺动脉平滑肌细胞过度增殖和凋亡抑制有关 也被证明通过抑制促凋亡蛋白在细胞增殖和凋亡中发挥重要作用 细胞凋亡是在生理或病理条件下细胞自发死亡的过程在细胞发育和分化过程中发挥重要作用 其中 是一种重要的抗凋亡蛋白而 是一种促凋亡蛋白增强线粒体凋亡通路抑制肺动脉平滑肌细胞增殖可以改善 也是许多针对 中血管增殖重构的药物研究的经典通路 根据生物信息学分析的结果预测祖卡木治疗肺高压的潜在靶点可能与缺氧及增殖相关通路最为密切且 可能作为一个核心靶点 因此我们选择 作为核心靶点探究其下游两个通路(及)以及增殖相关通路/进行进一步验证本研究选择单纯低氧 周与低氧 周 个动物模型进行药效学探究 单纯低氧 周小鼠模型可模拟突发性低氧所致机体障碍是快速评价治疗 药物效果的首选模型因此选择其作为药效初筛模型 是一种血管新生抑制剂能抑制低氧所致肺血管新生低氧合并 模型可加重小鼠肺血管损伤与临床患者病理表现相近可作为长期药效评 价模型 在 个模型中均验证了祖卡木颗粒对于 的预防及治疗作用其可以显著降低 明显减轻小鼠右心室肥厚效果优于阳性药西地那非为了探究祖卡木颗粒对 治疗作用的分子机制本研究检测了肺组织中相关信号通路的变化 研究结果显示祖卡木可下调肺组织中 的表达并上调 的表达提示祖卡木可能通过抑制细胞的增殖发挥治疗作用此外可上调肺组织中 及 的表达并降低 的表达提示激活 及抑制 信号通路可能是祖卡木发挥治疗作用的潜在机制本研究可以为祖卡木颗粒的基础研究以及临床应用提供思路和拓展也为 的临床治疗提供潜在的治疗药物 但目前这些结果只是祖卡木颗粒作用机制的线索后续还应采用/及/抑制剂等对该通路进行干预以确证祖卡木颗粒的作用机制综上所述论文通过网络药理学手段分析预测了民族药祖卡木颗粒治疗 的作用靶点并通过两种实验动物模型进行了药效学验证及分子生物学分析 首次揭示了祖卡木颗粒可能通过/及/通路对 起到治疗作用为后续开发新的治疗药物及拓展祖卡木颗粒适应证提供了新的选择参考文献 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