生物负载测定省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物负载测定生物负载测定1第第1 1页页微生物定义和分类微生物定义和分类 原核类原核类：细菌、放线菌、支原体、：细菌、放线菌、支原体、蓝细胞蓝细胞 立克次氏体、衣原体立克次氏体、衣原体微生物微生物 真核类真核类：真菌：真菌(酵母菌、霉菌）、原生动物、酵母菌、霉菌）、原生动物、显微藻类显微藻类 非细胞类非细胞类：病毒、类病毒、朊病毒：病毒、类病毒、朊病毒2 定义：定义：一切肉眼看不见或看不清楚微小生物总称。一切肉眼看不见或看不清楚微小生物总称。第第2 2页页细菌细胞形态显微镜检照片细菌细胞形态显微镜检照片放大放大10001000倍杆菌倍杆菌放大放大10001000倍球菌倍球菌3第第3 3页页微生物细胞结构示意图微生物细胞结构示意图细菌细胞结构图细菌细胞结构图真菌细胞结构图真菌细胞结构图4第第4 4页页微生物五大共性微生物五大共性1 1、体积小，面积大、体积小，面积大 巨大营养吸收面、代谢废物排泄面和环境信息接收面巨大营养吸收面、代谢废物排泄面和环境信息接收面2 2、吸收多，转化快、吸收多，转化快 高速生长物质基础，活化工厂高速生长物质基础，活化工厂。3 3、生产旺，繁殖快、生产旺，繁殖快 大肠埃希菌大肠埃希菌20min20min分裂分裂1 1次，次，4848小时后重量则到达地球小时后重量则到达地球40004000倍。倍。注：因营养条件限制，实际不可能发生。注：因营养条件限制，实际不可能发生。4 4、适应强，易变异、适应强，易变异 极端环境惊人适应能力极端环境惊人适应能力5 5、分布广，种类多、分布广，种类多 空气、水体、土壤、动植物都有分布，微生物有空气、水体、土壤、动植物都有分布，微生物有1010多万种。多万种。5第第5 5页页微生物存在对医疗器械影响微生物存在对医疗器械影响活微生物对灭菌影响活微生物对灭菌影响 非过分灭菌工艺因医疗器械上生物负载增加，灭菌难非过分灭菌工艺因医疗器械上生物负载增加，灭菌难度加大，可能造成灭菌失败。度加大，可能造成灭菌失败。活微生物对使用者危害活微生物对使用者危害 灭菌不彻底无菌医疗医疗器械，依据使用方式不一样，灭菌不彻底无菌医疗医疗器械，依据使用方式不一样，可能出现炎症、菌血症等病理反应。可能出现炎症、菌血症等病理反应。微生物尸体对使用者危害微生物尸体对使用者危害 经典例子：经典例子：G G-菌细胞壁脂多糖成份菌细胞壁脂多糖成份(内毒素内毒素)经过输液经过输液进入人体血液，致使人体发烧。进入人体血液，致使人体发烧。6第第6 6页页基本概念基本概念生物负载定义生物负载定义 一件产品和一件产品和/或或无菌屏障无菌屏障上或其中存活微生物总数。上或其中存活微生物总数。对灭菌来说：生物负载应为无菌屏障内全部微生物。对灭菌来说：生物负载应为无菌屏障内全部微生物。因为，灭菌需要杀灭屏障内全部微生物。因为，灭菌需要杀灭屏障内全部微生物。对使用来说：生物负载应为产品与人体接触面，因为对使用来说：生物负载应为产品与人体接触面，因为屏障通常不与人自然腔道、血管、肌肉等接触。屏障通常不与人自然腔道、血管、肌肉等接触。对生产过程控制来说：生物负载应是屏障内全部微生对生产过程控制来说：生物负载应是屏障内全部微生物，反应过程控制水平。物，反应过程控制水平。7第第7 7页页基本概念基本概念校正因子校正因子correction factorcorrection factor 用于赔偿无法从产品和用于赔偿无法从产品和/或微生物培养中完全采集数值。或微生物培养中完全采集数值。培养条件培养条件 culture conditionsculture conditions 促进微生物复苏、生长和促进微生物复苏、生长和/或繁殖所采取培养基和培养方式。或繁殖所采取培养基和培养方式。回收率回收率 recovery efficiency recovery efficiency 用一特定技术从产品上采集和用一特定技术从产品上采集和/或培养微生物能力测定值。或培养微生物能力测定值。样品份额（样品份额（SIPSIP）sample item portion sample item portion 从某一产品单元上取出用于试验部分从某一产品单元上取出用于试验部分。8第第8 8页页产品选择产品选择基本标准基本标准选择和处理用于生物负载测定产品程序，应能确保所选产选择和处理用于生物负载测定产品程序，应能确保所选产品对包含包装材料和过程常规生产含有代表性。品对包含包装材料和过程常规生产含有代表性。若为若为生物负载测定目标对产品进行分类生物负载测定目标对产品进行分类，应统计每一分类，应统计每一分类内包含这一产品理由。理由应包含所选产品在是整个分类内包含这一产品理由。理由应包含所选产品在是整个分类里含有代表性标准。里含有代表性标准。因为生物负载测定易受时间推因为生物负载测定易受时间推 移影响而改变，应考虑生物移影响而改变，应考虑生物 负载测定取样时限。负载测定取样时限。9部分液体产品可能部分液体产品可能存在支持微生物生存在支持微生物生长现象长现象第第9 9页页SIPSIP取样基本要求取样基本要求假如已验证生物负载在本产假如已验证生物负载在本产品上或内是均匀分布，则品上或内是均匀分布，则SIPSIP能够是该产品任何部分能够是该产品任何部分。不然，样品应包含能代表所不然，样品应包含能代表所制产品每种对应材质而随机制产品每种对应材质而随机选取产品部位。选取产品部位。若已知生物负载分布，能够若已知生物负载分布，能够从认为对灭菌工艺最有严峻从认为对灭菌工艺最有严峻挑战产品部分选择挑战产品部分选择SIPSIP。10SIP选择选择产品产品表面积表面积植入物（不可吸收）植入物（不可吸收）质量质量粉粉末末手术服手术服植入物（可吸收）植入物（可吸收）长度长度管路（直径一致）管路（直径一致）体积体积流体流体第第1010页页生物负载测定生物负载测定测定方法定方法微生物的采集微生物的采集（洗脱系数洗脱系数）采集微生物的技采集微生物的技术能力能力（追求合适的采集技（追求合适的采集技术）微生物的可能种微生物的可能种类和和它它们在在产品上的位置品上的位置采集技采集技术对微生物活性的影响微生物活性的影响（避免采集技（避免采集技术对微生物的微生物的伤害）害）检测时产品的物理或化学特性品的物理或化学特性（确（确认：抑菌物：抑菌物质存在与否，如何去除）存在与否，如何去除）微生物的培养微生物的培养（培养系数修正培养系数修正）微生物微生物计数数11第第1111页页生物负载微生物判定生物负载微生物判定判定意义 经过微生物判定，了解微生物基原来源，为日常微生物控制提供依据；灭菌工艺适合性提供依据（是否存在耐受特定灭菌因子芽孢菌存在）。通常判定方法常规判定：染色特征；细胞形态；菌落；选择性培养使 用；生化特征；分子水平判定：DNA测序后与数据库提供遗传序列比对。12第第1212页页生物负载测定方法确认若测定方法中包含采集产品上微生物，则对该技术适当性若测定方法中包含采集产品上微生物，则对该技术适当性评价；评价；确定回收率确定回收率,方便得到修正系数；方便得到修正系数；液体类产品非常便捷液体类产品非常便捷,通常不需要回收率通常不需要回收率.对包含培养条件和微生物计数技术在内微生物计数适当性对包含培养条件和微生物计数技术在内微生物计数适当性评价；评价；不是全部微生物能够经过单一培养基能有效培养出来。不是全部微生物能够经过单一培养基能有效培养出来。微生物判定技术适合性评价。微生物判定技术适合性评价。13第第1313页页 常规测定和数据判读常规测定和数据判读确定样品大小和取样频率。测定方法要规定,并形成作业指导书根据生物负载使用目标确定判定程度,通常判定是否存在芽孢生物负载数据用于确定灭菌工艺处理程度，则根据具体要求进行应满足灭菌工艺设定、验证和常规控制特定标准中规定关于生物负载数据使用切实可行要求。规定医疗器械上或屏障内生物负载可接收限量。中国有GB15980-1995标准，但未有明确国际标准。如果生物负载信息用于设定灭菌条件，则限量比较好设定。根据一段时间得到生物负载测定数据来确定趋势，进行趋势管理。14第第1414页页生物负载测定方法维持产品和/或生产过程改变 通常重新进行回收率测试或生物负载测试。生物负载测定方法改变 应对生物负载测定常规方法任何改变进行评价。评价测定结果改变影响；设 新回收率。先前进行确实认和回收率是否仍有效。生物负载测定方法重新确认15第第1515页页重复回收重复回收确定回收率确定回收率重复回收进行重复回收进行回收率回收率确认确认 使用自然产品，首次采集微生物数值占连续屡次采集总数使用自然产品，首次采集微生物数值占连续屡次采集总数值比值。值比值。方法理论基础方法理论基础 生物负载确实认方法应重复进行，直到回收微生物累计数生物负载确实认方法应重复进行，直到回收微生物累计数量没有显著增加。每重复一次后，从产品上或产品部分上量没有显著增加。每重复一次后，从产品上或产品部分上洗脱液全部回收并计数。比较连续回收得到累计结果。洗脱液全部回收并计数。比较连续回收得到累计结果。注意注意：本方法未必准确。产品上回收微生物数量及实际存在微生物数本方法未必准确。产品上回收微生物数量及实际存在微生物数量之间确实切关系永远无法验证量之间确实切关系永远无法验证。16第第1616页页重复回收重复回收确定回收率确定回收率产品要求 本身含有一定微生物负载水平，假如产品本身负载水平低，则不适合采取该方法，应采取产品人工接种法。重复采集次数 准确重复次数通常取决于 产品特征，组成生物负载微生物和初始污染水平等。预试验可用于确定重复次数。在一些产品上，进行重复处理后有必要确定产品上是否还存在存活微生物。这能够经过以下方法实现：用熔化回收培养基涂在产品表面上，让培养基变硬，然后使产品在要求培养条件下进行培养形成菌落计数。将产品浸于液体回收培养基中，在要求培养条件下，检验是否生长。浸于液体培养基并培养后，若产品中一小部分出现存活微生物，可经过MPN方法来计数结果。不过若全部结果都表明有微生物生长，则不能采取MPN法，应重新考虑确认方法。17第第1717页页重复回收修正系数18处理处理产品数产品数123451605070554521012523310200401001琼脂覆盖21210总菌落计数总菌落计数7364795349第一次处理：6050705545总数：7364795849第一次处理回收率：第一次处理回收率：82%78%89%95%92%第一次处理后平均回收率：第一次处理后平均回收率：=87.2 =87.2%范围=78%95%计算中已包含了琼脂覆盖得到菌落数。一些医疗器械可能会无法应用琼脂覆盖。利用首次利用首次处处理后平均回收率，理后平均回收率，回收效率修正系数可回收效率修正系数可为为：有些应用中可使用平均回收率范围最低值，以反应出最坏情况。有些应用中可使用平均回收率范围最低值，以反应出最坏情况。这一决定将会影响数据使用。这一决定将会影响数据使用。第第1818页页产品接种法产品接种法确定回收率确定回收率产品接种法产品接种法确定回收率确定回收率 产品上人工接种微生物后，首次采集微生物数量占 接种到产品上微生物比值。可为每一产品计算百分率，并用其确立回收率。产品要求 产品首先应进行适合灭菌，并确保可能对微生物有抑制灭菌介质有效去除。如用EO灭菌时，则应验证残留水平是否存在对微生物抑制作用。19第第1919页页产品接种法产品接种法确定回收率确定回收率接种微生物 最惯用 需氧菌芽孢接种，因为使用细菌繁殖体时，常因干燥失去活性，所以通常不使用繁殖体。芽孢悬液分布在产品上，应包含最难洗脱 部位。但应注意为了刻意追求WORST CASE，将芽孢全部接种在最难位置，造成回收率过低异常。20第第2020页页接种法修正系数接种法修正系数制备悬液稀释液，每0.1mL中含有100个芽孢。向器械所选部分接种0.1mL该稀释悬液，并在单项流状态下干燥。注意接种体积，体积过大不易干燥；体积过小，则分布不均匀。使经接种产品经受得住所选采集技术，采集平均芽孢数是35，其范围为2545之间。回收率修正系数以下：21第第2121页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备袋蠕动 将试验样品和一已知体积洗脱液装在一个无菌胃型袋中。开动往复式搅棒，使洗脱液贯通试验样品内外。应要求处理时间。该方法尤其适合用于软质、纤维和/或吸附性材料，但可能不适合用于能刺破袋任何材质（如带针或含有坚硬部分器械）。若使用了较大大量洗脱液，可能会生成含有低浓度微生物悬浮液。可使用膜过滤法滤掉洗脱液。22第第2222页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备超声波洗脱 将试验样品浸入装有已知体积洗脱液适当容器中。将容器连同内装物一起在超声波清洗器中进行处理，或将超声波探头浸入到容器内洗脱液中进行处理。超声波也能使微生物失去活性，尤其是大能量传输时，使用超声波探头会比超声波清洗器更有可能使其失去活性。依据要求应验证超声法。应要求超声处理常规频率和处理时间。而且，还应要求试验样品在超声波清洗器中安放位置。应注意限制同时进行处理试验样品数量，方便阻断超声处理源。该方法尤其适合用于不透液体固体试验样品以及形状复杂产品。该方法对一些医疗器械可能产生破坏作用，尤其是对带有电子部件器械，如植入式脉冲发生器。超声处理能量和超声处理连续时间不应太强或太长，以免破坏微生物并造成死亡，或是使洗脱液过热。23第第2323页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备振摇（机械或手工方式）将试验样品浸入装有已知体积洗脱液适当容器中，并用机械振动器（如往复式、轨道或机械腕摇床）进行振摇。也可用手工振摇，但其效力会因操作人员而异。应要求振摇时间和频率。能够加入一定大小玻璃微珠增加表面磨损以及由此提升回收效率。加入玻璃微珠大小以及振摇时间和频率不能造成过热和/或对微生物造成可能破坏。增加玻璃微珠将增加微生物可附着表面积。24第第2424页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备涡旋混合 将试验样品浸入装有已知体积洗脱液密闭容器内，该容器压在放置在旋涡混合器旋转垫以形成涡旋。涡旋形成取决于手动施加压力。涡旋中改变会使微生物洗脱产生差异。应要求所用容器、混合时间以及设定混合器速度。该方法操作简单快捷，但仅适合用于小试验样品。冲洗 让洗脱液经过试验样品内腔。能够靠重力或泵来使液体流动。另外也可将洗脱液充入产品中，夹住并抖动。应要求器械与洗脱液接触时间、冲洗速度及液体体积。器械结构及腔体尺寸会限制从内表面完全移除微生物所必须冲力。25第第2525页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备搅切（碎裂）将试验样品浸入装有已知体积洗脱液适当容器内。在要求一段时间内搅切或振摇试验样品时间。依据试验样品和搅切器来要求搅切时间，但不应超出会造成洗脱液过热和对微生物造成破坏。该技术提供了将试验样品分成足够小部分方法，方便经过接种平板培养技术对微生物进行计数。擦拭 含有吸附性材料棉拭子通常被固定于杆或把手上。样品材料能够是可溶性或不可溶性。通常使用方法是用洗脱液湿润棉拭子，并用棉拭子擦拭界定好试验样品表面。在有些情况下，能够先润湿表面，然后用干棉拭子擦拭，这么可提升回收效率。然后将棉拭子转放至洗脱液中，并搅动从棉拭子上洗脱微生物。另外，若使用是可溶性棉拭，拭子会溶解到稀释液中。擦拭法是对不规则形状产品或难靠近区域取样一个有效方法。该方法也可用于大面积区域取样。该方法会因擦拭方式不一样而更易犯错。而且，经过擦拭不可能将表面上全部微生物都搜集起来。有些微生物会被棉拭子本身吸附，以致于被检测不到。棉拭子中不应含有灭菌剂或抑菌剂。26第第2626页页洗脱液体27溶液水中浓度水中浓度应用缓冲蛋白胨水0.067 mol/L磷酸盐；0.43%氯化钠；0.1%蛋白胨；通用六偏磷酸钠林格氏溶液 1/4 强度溶解海藻酸钙拭子蛋白胨水 0.1%1.0%通用磷酸盐缓冲溶液0.02 mol/L磷酸盐；0.9%氯化钠；通用林格氏溶液1/4 强度通用氯化钠0.25%0.9%通用硫代硫酸盐林格氏溶液1/4 强度中和余氯水稀释含水样品；稀释含水样品；计数前制备可溶材计数前制备可溶材料等渗压溶液；料等渗压溶液；此表并未包含全部。表面活性剂，如聚山梨醇酯此表并未包含全部。表面活性剂，如聚山梨醇酯（TweenTween）8080能够添加到洗脱液和稀释液中。依据详细应用，能够添加到洗脱液和稀释液中。依据详细应用，通常浓度在通常浓度在0.01%0.01%0.1%0.1%之间。应使用适当浓度表面活性剂，之间。应使用适当浓度表面活性剂，并加以特殊处理以预防泡沫形成。并加以特殊处理以预防泡沫形成。第第2727页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备接触板 接触板或玻璃片可用凝固培养基放在样品表面上，使存活微生物能附着到该培养基表面，然后再培养接触板或玻璃片，至形成可计数菌落。该方法优点在于使用方便。结果与凝固培养基接触表面直接相关。表面上自然集聚细胞群、菌落在琼脂表面散布、琼脂干燥、可能存在厌氧菌等都是潜在不利原因。因为该方法回收率通常较低，所以只有在其它方法不适用情况下才使用。接触板和玻璃片通常只适合用于平或规则表面。琼脂覆盖 当生物负载低以及产品结构适合时，在产品表面涂上熔化琼脂培养基（最高温度在45），培养至产生可见菌落。表面上自然集聚细胞群、菌落在琼脂表面散布、琼脂干燥、可能存在厌氧菌等都是潜在不利原因。28第第2828页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备最大可能数（MPN法）MPN法是一个沿用已久并有充分文件依据，用于估算在产品内随机分布存活微生物数量方法。它主要用于食品和水产品等行业（与液体、粉末和半固体产品或者原材料一起使用）。这种方法尤其适合用于生物负载平均数低产品。这种方法包含（按体积或者重量）对产品进行重复取样，其中每次取样样品中均含有相同数量可存活微生物（因而要求分布随机性），然后经过将样品转到液体培养基并培养，单独记下有可存活微生物存在每个样品。当含有足量洗脱液，可将其一系列稀释液接种于营养培养基中，使部分接种培养基在随即培养中不产生可见生长。用表现出生长稀释度，估算出样品中或产品取样绝大部分中存在存活微生物数量；关于此估算值，95%可信区间是相对宽。该估算和其置信界限来自MPN表格（DeMan18），此表是在一定假设条件下编制，即依据泊松分布原理，重复取样样品中存在可存活微生物数量是围绕一个平均数量分布。MPN方法应用关键要求是微生物总数在整个（研究中）产品上随机分布。所以，对于液体用医疗器械、黏性液体、粉末，或在单一产品使用如洗脱液等液体估算生物负载情况下，MPN方法能够有生物负载测定值。不过，这种方法并不普遍适合用于在固体医疗器械上生物负载测定。经典情况是，在这些器械上组成低平均值生物负载若干微生物分布通常是随机，一个总数微生物总是有高百分比不可检测有机物和少许带“峰值”微生物（实质组成平均值生物负载）。在MPN应用中，“峰值”将会被简单地统计为一个正值，因而，只以公式化方式组成此平均值，而不是用数字表示。这可能造成对生物负载预计过低，而得出一个不符合要求结果。MPN法易于操作，而且该方法是基于统计学，所以它更适合用于普通性评定而不是准确测定。29第第2929页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备膜过滤法洗脱液过滤后，将滤器放到适宜培养基上进行培养，形成可见菌落，是对存活微生物计数一个有效方法。通常，孔径小于0.45过滤器适于采集微生物。对含有类似纤维状产品残留物等微粒洗脱液进行膜过滤可能比较困难，因微粒会阻塞过滤器。膜过滤法更适合用于微生物浓度较低悬液。30第第3030页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备平板倾注 使用平板倾注技术，将一定量悬浮液在在约45温度与融化琼脂相混合，然后倾注到平板放至凝固。对平板进行培养至菌落形成并进行计数。平板涂抹 平板涂抹技术是用涂抹器将一定量悬液涂在固体营养基表面。螺旋涂板 螺旋涂板技术利用自动装置将一定量微生物悬液涂在固体培养基表面上。悬液涂抹是以递减速度从培养板中心以螺旋线轨迹向周围运动。经过培养后，对全板或部分板，利用专用计数栅和计数技术来统计原始悬液中存活微生物数量。31第第3131页页微生物采集技术和设备微生物采集技术和设备检测微生物其它方法 预计生物负载时还可使用菌落计算以外其它方法。这包含测定新陈代谢物活性（比如：新陈代谢物测定或落射表面荧光）。这些方法称为“间接法”，为了建立起与以往确定存活微生物数量关系，它们必须对照菌落计数进行校准。这些技术一个主要限制就是需要相对较高微生物数悬浮在样品洗脱液中。普通来说，所检测到微生物数量下限超出100 CFU。32第第3232页页微生物判定（一）微生物判定方式和意义微生物判定方式和意义方式方式 形态判定、培养及生理特征、生化特征、核酸特征判定 数值判定和自动判定意义意义 从判别污染微生物可了解洁净室清洁，消毒步骤效性，尤其是对消毒剂有效性评定有所帮助。微生物判别结果也对调查污染起源有参考价值。33第第3333页页惯用微生物操作技术接种：将含有或可能含有微生物样品或培养物，种入培养基技术方法。斜面培养基接种法、半固体培养基接种法、液体培养基接种法、平板培养基接种法。分离：使用一定分离技术，将混杂存在微生物尽可能在培养基中分开而且生长，从而取得单一一个菌株方法。划线分离法、涂布分离法、倾注分离法培养：通常接种后培养基都要在适宜环境中条件下进行培养。主要是温度、湿度、培养时间，尤其是氧气和二氧化碳需求。需氧培养法、厌氧培养法、微需氧培养法、二氧化碳培养法34第第3434页页惯用微生物操作技术染色：原因：微生物细胞含水量普通为80%90%，菌细胞对光吸收和反射与水溶液相近，在光学显微镜下，菌体透明，与背景几乎无差异，故常借助染色使菌体吸着染料产生与背景较显著差异。惯用细菌染色法单染色法：仅使用一个染料，只能观察形态和排列复染色法：革兰染色法，可将全部细菌分成2类，革兰阳性菌、革兰阴性菌。芽孢染色法：很有用一个染色法，因为芽孢对灭菌压力比较大，存在灭菌失败风险尤其是依据生物负载设定么军参数方法。鞭毛染色法35第第3535页页微生物判定（二）核酸特征判定之一核酸特征判定之一16SrRNA16SrRNA序列分析序列分析 基本步骤：基本步骤：36DNA提取PCR扩增 凝胶成像检测琼脂糖凝胶电泳回收 序列分析数据库比对第第3636页页微生物判定（三）16SrRNA 16SrRNA序列分析注意事项序列分析注意事项引物选择引物选择PCRPCR条件设定条件设定37第第3737页页