金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立及其在大鼠、小鼠粪便检测中的应用.pdf

实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2023.022金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立及其在大鼠、小鼠粪便检测中的应用于灵芝,谢建芸,冯丽萍,魏晓锋(上海实验动物研究中心,上海 201203)摘要 目的建立一种快速灵敏的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）检测方法。方法选择金黄色葡萄球菌特异性基因nuc作为靶基因，设计并合成一对特异性引物和一条TaqMan探针，利用荧光定量PCR技术建立nuc基因的核酸检测方法，并在大鼠、小鼠粪便样本检测中进行应用。结果对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株中提取的DNA进行荧光定量PCR检测，结果显示金黄色葡萄球菌出现特异性扩增曲线，而其他非金黄色葡萄球菌未出现，表明设计的引物和探针对金黄色葡萄球菌检测具有特异性。将提取的金黄色葡萄球菌DNA进行10倍梯度稀释后测定其灵敏度，结果显示最低检出限是10 fg的DNA量，比普通PCR方法高2个数量级。本研究共检测91份样品，有4份来自同一设施的大鼠样品，扩增曲线为典型的S曲线；将该PCR产物测序并进行BLAST比对，该样本的基因序列与金黄色葡萄球菌的基因序列相似度为100%，表明该样本为金黄色葡萄球菌nuc基因核酸阳性，阳性率为4.40%，与细菌培养法的检测结果一致。核酸提取采用全自动核酸纯化仪，从核酸提取到检测结果判定快速，所需时间小于1.5 h。结论建立的以nuc为靶基因鉴定金黄色葡萄球菌的qPCR方法，具有快速、灵敏度高和特异性强的优点，可用于实验动物大鼠、小鼠粪便中金黄色葡萄球菌的检测。关键词 金黄色葡萄球菌；检测方法；荧光定量PCR；粪便；大鼠；小鼠中图分类号 Q95-33 文献标志码 A 文章编号 1674-5817（2023）05-0566-08Establishment of Fluorescence qPCR Method for Detection of Staphylococcus Aureus and Its Application in Feces Detection of Rats and MiceYU Lingzhi,XIE Jianyun,FENG Liping,WEI Xiaofeng(Shanghai Laboratory Animal Research Center,Shanghai 201203,China)Correspondence to:WEI Xiaofeng(0009-0009-5089-8342),E-mail:ABSTRACT Objective To establish a method for rapid and sensitive detection of Staphylococcus aureus.Methods The specific gene nuc of Staphylococcus aureus was selected as the target gene.A pair of specific primers and a TaqMan probe were designed and synthesized according to the published sequence of the nuc gene.Establish a nucleic acid detection method for nuc gene using fluorescence quantitative PCR technology,and apply it clinically in the detection of fecal samples from rats and mice.Results The DNA extracted from Staphylococcus aureus and other non-Staphylococcus aureus strains was detected by qPCR.The results showed that Staphylococcus aureus had a specific amplification curve,while other non-Staphylococcus aureus did not,indicating that the designed primers and probes were specific for Staphylococcus aureus.The sensitivity of this method was determined by diluting the DNA of Staphylococcus aureus by 10 times.The results showed that the detection limit of this method was 10 fg DNA,which was 2 orders of magnitude higher than that of ordinary PCR method.A total of 91 clinical samples were detected in this study,of which 4 rat samples from the same facility had a typical S-curve.研究报告 Research Reports基金项目 上海市科技创新行动计划“实验猪病毒多联检测技术的质量控制体系研究”（20140900302）；上海市科技计划项目“上海市水生实验动物专业技术服务平台”（22DZ2291200）第一作者 于灵芝（1980），女，博士，助理研究员，主要从事病原体核酸检测方法研究。E-mail：通信作者 魏晓锋（1980），男，硕士，副研究员，主要从事实验动物质量控制研究。E-mail：。ORCID：0009-0009-5089-8342566实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)The PCR products were sequenced and BLAST compared.The gene sequence of this sample was 100%similar to that of Staphylococcus aureus,indicating that the sample was positive for the nucleic acid of Staphylococcus aureus nuc gene,with a positive rate of 4.40%.The result was consistent with that obtained by bacterial culture method.The nucleic acid extraction adopted a full-automatic nucleic acid purification instrument,and the time required from nucleic acid extraction to detection result determination was less than 1.5 h.Conclusion The qPCR method established in this study to identify Staphylococcus aureus with nuc gene as the target gene has the advantages of fast,high sensitivity and specificity,and can be used for the detection of Staphylococcus aureus in feces of rats and mice.Key words Staphylococcus aureus;Method of detection;Fluorescent quantitative PCR;Feces;Rats;Mice金黄色葡萄球菌是一种常见的人兽共患的条件性致病菌，携带大量的毒力因子，能够引起广泛的感染，从常见的皮肤感染如疖病和脓疮等，到严重的深部感染如心肌炎、肺炎和乳房炎等1-3。虽然我国2022年12月发布的国家标准实验动物 微生物、寄生虫等级及监测将大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠（仓鼠）、兔的病原菌项目中金黄色葡萄球菌由必须检测项目变更为必要时检测项目4。目前实验动物国家标准中检测方法主要是细菌分离培养和生化方法，但该检测方法耗时长，检测过程比较繁琐5。因此，需要一种高灵敏度和高特异性的方法进行快速检测。TaqMan探针法荧光定量PCR因其特异性强、灵敏度高、重复性好和快速的特点，在医学检测和诊断方面已得到了大力推广和应用。粪便携带来自宿主的微生物，因此在实验动物领域，鼠粪便样本常被用于检测其携带的病原体，进行实验动物鼠的质量检测。本研究检测的样本为粪便，是一种无创的采样方式，可节约活体动物的使用，符合动物福利的3R原则。本研究采用金黄色葡萄球菌特异性的nuc基因作为检测靶基因，建立以粪便为样本类型、以磁珠法为基础的核酸自动提取方式，以及基于TaqMan探针法的荧光定量PCR共同组成的一套完整的金黄色葡萄球菌检测方法，进行性能评估，并将其应用于大鼠、小鼠粪便样本中的检测。1材料与方法1.1菌株来源所用的标准菌株金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、支气管鲍特杆菌（ATCC14065）、嗜肺巴斯德杆菌（ATCC35149）、绿脓杆菌（ATCC27853）、沙门氏菌（CMCC50115）、肺炎克雷伯杆菌（CMCC46117）和表皮葡萄球菌（CMCC26069）均由本实验室保存。1.2引物设计根据GenBank中登录的金黄色葡萄球菌特异性保守基因 nuc 为候选靶基因（GeneBank：CP007447.1），通过 NCBI（网址：https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线引物设计软件设计PCR引物，并将其进行BLAST特异性分析。1.3样本处理收集委托检验的大鼠、小鼠粪便样本，取黄豆粒大小于 2 mL 离心管中，加入 1 mL 生理盐水（0.9%NaCl溶液），浸泡510 min，捣碎，振荡，500 r/min离心5 min，取上清液200 L进行DNA提取。1.4基因组的提取取0.2 mL样本上清液或菌液，采用32通道全自动核酸纯化仪Purifier 32，麦诺迪（上海）生物科技有限公司及配套的磁珠法核酸提取试剂提取核酸，按说明书操作。用NanodropND-1000（美国Nanodrop公司）进行核酸浓度定量，并稀释至所需浓度。1.5PCR检测体系的建立Probe qPCR Mix购自宝生物工程（大连）有限公司。引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。荧光定量PCR 仪（CFX Opus 96）购自美国Bio-Rad公司。以样本或细菌的基因组DNA作为模板进行荧光PCR扩增。在提取体系中，以金黄色葡萄球菌标准菌株的菌液作为核酸提取阳性对照，正常鼠的粪便作为核酸提取阴性对照。在扩增体系中，以金黄色葡萄球菌标准菌株的DNA为阳性对照，正常鼠的粪便基因组DNA为阴性对照。1.6特异性试验采用建立的方法，分别对金黄色葡萄球菌和其他6种非目的菌，包括支气管鲍特杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌和表皮葡萄球菌的DNA进行检测。以金黄色葡萄球菌标准菌株的567实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)DNA 为阳性对照，纯水作为阴性对照，进行特异性验证。1.7标准曲线的建立及灵敏度试验将金黄色葡萄球菌DNA样品进行10倍梯度稀释，得到1 ng/L、100 pg/L、10 pg/L、1 pg/L、100 fg/L、10 fg/L和1 fg/L系列标准模板。利用荧光定量PCR测定各稀释度的循环阈值（cycle threshold，Ct），以Ct值为纵坐标，以起始模板浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，并进行该方法的灵敏度分析。1.8重复性试验将金黄色葡萄球菌DNA样品进行10倍梯度稀释，设置2个水平的重复性对照，包括10 pg和10 fg，在同一次试验中进行10次重复检测进行组内重复性评估，在5次不同的试验中进行组间重复性评估（n=5）。对各稀释度的Ct值进行统计，计算同一检测中每个样品各反应管之间的变异系数（coefficient of variation，CV）。1.9样本应用委托检验的鼠粪便样本共91份，包括小鼠粪便样本62份和大鼠粪便样本29份，其中有4份大鼠样本来自同一设施。提取体系中，用金黄色葡萄球菌标准菌株的菌液作为核酸提取阳性对照，正常鼠的粪便作为核酸提取阴性对照。扩增体系中，扩增阳性对照用已提取的金黄色葡萄球菌DNA，扩增阴性对照用正常鼠的粪便DNA。样本按所建立的核酸提取方法、反应体系和程序进行荧光PCR检测。1.10PCR产物测序鉴定将阳性样本的荧光定量PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行克隆测序验证。将返回的PCR产物序列通过GenBank中的BLAST程序进行序列同源性分析（网址：https：/blast.ncbi.nlm.nih.gov）。1.11对比试验按国家标准GB/T 14926-2001 实验动物 微生物学检测方法（1）（2）进行金黄色葡萄球菌的常规分离培养和鉴定。将加入生理盐水的粪便样本涂布在高盐甘露醇平皿，36 培养48 h（经技术判断的标准方法偏离）后，观察培养结果。若有可疑样品则按国家标准中实验步骤继续进行下一步纯化和鉴定工作。2结果2.1nuc基因作为检测靶基因设计的引物根据nuc基因设计的引物组包括Nuc-F（5-GT-GGCTTAGCGTATATTTATGC-3）和 Nuc-R（5-AA-GTTGTTCATGTGTATTGTTAGG-3），探针为 5-FAM-CGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGC-3BHQ1，片段长度为113 bp。经BLAST比对，引物和探针的特异性良好。2.2荧光PCR方法的建立以金黄色葡萄球菌ATCC6538基因组DNA作为模板进行PCR检测，其他非目的菌基因组DNA和纯水作为阴性对照。反应体系如下：Probe qPCR Mix（2）10 L、Nuc-F（10 mol/L）0.4 L、Nuc-R（10 mol/L）0.4 L、Nuc-P（10 mol/L）0.8 L、模板 1 L，加纯水7.4 L至20 L。设置荧光PCR仪至FAM荧光检测通道（淬灭集团为None）。PCR参数设置：95 30 s，1个循环；95 5 s，60 30 s，40个循环。荧光信号收集在60 30 s时进行。保存所设置程序后，将反应管放入仪器，开始运行。2.3特异性结果经BLAST分析，该套引物探针仅能扩增出金黄色葡萄球菌，证明理论上特异性良好。用金黄色葡萄球菌和6种其他非目的细菌的基因组DNA为模板，进行特异性检测。结果表明，仅以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板的反应有扩增曲线，以其他6种细菌基因组DNA和纯水为模板的反应均为阴性（图1）。2.4标准曲线的建立及灵敏度结果金黄色葡萄球菌DNA样品经10倍梯度稀释后进行荧光定量PCR。由图2A可见，标准菌株DNA在1 ng/L、100 pg/L、10 pg/L、1 pg/L、100 fg/L 和 10 注：红色S型曲线代表阳性对照。RFU是相对荧光单位。Note：Red S-type curve represents the positive control.RFU，Relative fluorescence unit.图1 金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR特异性检测结果Figure 1 Specificity for Staphylococcus aureus detected by real-time fluorescent quantitative PCR568实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)fg/L之间具有良好的线性关系，其线性回归方程为Ct=-3.063l g（DNA量）+36.047。根据公式计算得到扩增效率E=10（-1/k）-1=1.089（k为斜率），即扩增效率为108.9%，相关系数R2=0.995，说明用所建立的方法扩增该标准菌株DNA的效率较高。因1 fg的核酸量3个平行样本只扩增出1个，无法稳定地扩增，故本方法中DNA核酸量的最低检出限为10 fg（图2B）。2.5重复性结果通过对10 pg/L和10 fg/L这2个稀释度的DNA进行组内（表1）和组间（表2）重复性检测，重复性的变异系数均小于2%，表明建立的荧光PCR方法重复性好，方法稳定可靠。2.6样品检测结果用建立的方法对91份样品进行检测，扩增阳性对照和核酸提取阳性对照均呈典型的S型曲线，扩增阴性对照和核酸提取阴性对照均无S型曲线，证明阴阳性对照均成立。有4份来自同一设施的大鼠样品扩增曲线为典型的S型曲线，可判定为金黄色葡萄球菌核酸阳性，总阳性率为4.40%（图3）。2.7PCR产物测序鉴定将所测样本的序列如图4A，用NCBI的BLAST程序进行序列同源性分析，结果显示该序列与金黄色葡萄球菌的基因序列相似性为100%，表明所测样本为金黄色葡萄球菌核酸阳性（图4B）。2.8比对试验结果细菌分离培养方法共鉴定出4份金黄色葡萄球菌，阳性率为4.40%（4/91），与本研究建立的以nuc基因为靶基因的荧光定量PCR方法检测结果一致。3讨论分子检测方法建立的关键是寻找特异的检测靶点。对于细菌的分子鉴定方法，最常使用的是对其 16S rRNA6和23S rRNA7保守序列进行扩增与比对。不同种细菌的16S rRNA和23S rRNA序列均有所区别，采用PCR方法对该序列进行扩增，对得到的扩增片段进行测序，然后与已有的基因序列数据库进行比对，即可确定所需鉴定的细菌种属。但是，有的菌种由于种间差异小，单独依靠16S rRNA不能鉴定到种。并且由表1 组内重复性实验数据（Ct值）及变异系数（CV）Table 1 Intragroup repeatability data(Ct)and coefficient of variation(CV)DNA量DNA quantities10 pg10 fg10次检测结果（Ct值）10 test results(Ct value)125.2333.32225.1733.93324.9934.33425.2334.72525.1633.77625.0433.68725.233.56825.1533.93925.1633.841025.2134.18CV值/%CV value/%0.331.18注：Ct为循环阈值。Note：Ct，cycle threshold.表2 组间重复性实验数据（Ct值）及变异系数（CV）Table 2 Intergroup repeatability data(Ct)and coefficient of variation（CV）DNA量DNA quantities10 pg平均数1Mean 1平均数2Mean 2标准差SDCV/%5次检测结果（Ct值）5 test results(Ct value)133.1334.4432.7232.1333.8333.2533.420.190.56234.0832.2732.6032.8835.0533.38336.0033.4732.3534.2132.6033.73434.1934.0431.9033.1433.9933.45533.0234.5632.5632.9033.4133.29DNA量DNA quantities10 fg5次检测结果（Ct值）5 test results(Ct value)126.0425.8026.1725.8725.8625.9525.930.190.75226.1025.8925.3925.9625.7825.82326.2025.8325.8625.8626.1025.97426.1226.1525.7625.9026.1226.01526.0826.1025.9125.6625.6925.89注：Ct为循环阈值。Note：Ct，cycle threshold.569实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)于微生物基因的多样性，某些靶基因的保守性和特异性均具有一定缺陷，这会对PCR检测结果的准确性造成影响，如编码肠毒素的基因8。不同地区、不同样本的金黄色葡萄球菌所携带的编码基因也不同。因此，如果将产肠毒素编码基因用作靶基因，往往会导致目标细菌漏检9。金黄色葡萄球菌除了可以用 16S rRNA 进行检测10，还可利用耐药性相关基因（mecA11-13和femA14-16）和毒素相关基因（SEA17、SEB18、SEC19、SED20、SHE21、SEI22和SEJ23）等作为靶基因。以上虽然同为金黄色葡萄球菌的靶基因，但各有不同的特点和用途：如16S rRNA基因在保守区设计引物，因保守区序列保守性太强，可能会扩增出其他菌，影响鉴定；耐药基因和毒力基因主要是指导临床用药，防止抗生素滥用。因此，需要探索更多的靶基因以追求更准确的检测结果。目前已经鉴定到一种由金黄色葡萄球菌产生的细胞 外 耐 热 核 酸 酶（thermonuclease，TNase）24。Brakstad等25获得TNase的单克隆抗体，具有作为快速和特异性检测金黄色葡萄球菌的试剂的潜力（ELISA法），证明对金黄色葡萄球菌是特异的。编码TNase的nuc基因已被克隆和测序26。Chesneau等27克隆了186 bp的nuc基因片段，进行DNA杂交试验，可特异性地识别金黄色葡萄球菌。在乳制品和血液培养物中进行的基于nuc基因的金黄色葡萄球菌检测，与培养法等比较，有较高的一致性，确定nuc基因有金黄色葡萄球菌种属特异相关的序列，为nuc基因作为金黄色葡萄球菌检测的靶基因提供了有力的数据支持28-31。Brakstad等32用普通PCR方法，以nuc基因作为靶基因检测金黄色葡萄球菌的检出限为0.69 pg DNA，提示用于扩增nuc基因的PCR技术有可能通过直接检测临床标本来快速诊断金黄色葡萄球菌感染。高正琴等33在小鼠中用普通PCR技术扩增nuc基因片段，证实了该片段对金黄色葡萄球菌具有特异性，该方法检出限为3 pg DNA，可用于临床样品金黄色葡萄球菌感染时的检测，适合应用于实验大鼠、小鼠的微生物质量监测。王鹏飞34采用实验动物回盲部内容物或粪便作为临床样本，用普通PCR技术检测金黄色葡萄球菌nuc基因，最小检出DNA核酸量为1 pg。陆文俊35将样本的金黄色葡萄球菌经过9 h过夜纯培养之后，其基因组 DNA 水平的检测灵敏度能达到 0.196 fg DNA。上述方法均采用直接普通PCR技术，或培养后再进行注：从左向右的曲线依次代表的核酸量为1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg和1 fg。Note：The amounts of nucleic acid represented by the curves from left to right is 1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg and 1 fg，respectively.图2 金黄色葡萄球菌进行实时荧光定量PCR的标准曲线（A）和灵敏度检测结果（B）Figure 2 Standard curve（A）and sensitivity（B）for Staphylococcus aureus detected by real-time fluorescent quantitative PCR注：红色S型曲线代表扩增阳性对照，黑色S型曲线代表核酸提取阳性对照，蓝色S型曲线代表阳性样本。Note：The red S curve represents the positive control for amplification，the black S curve represents the positive control for nucleic acid extraction，and the four blue S curves represent the positive samples.图3 金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR的临床检测结果Figure 3 Clinical detection results for Staphylococcus aureus by real-time fluorescent quantitative PCR detection570实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)普通PCR扩增。普通PCR技术从提取DNA到PCR扩增及电泳结束需数小时，且灵敏度较低。先分离培养再进行PCR的技术，虽然灵敏度有了明显提高，但耗时更久，不易于快速检测。本研究建立了以金黄色葡萄球菌特异性基因nuc为靶基因，采用TaqMan探针-荧光PCR技术检测金黄色葡萄球菌，并以鼠粪便为样本进行了应用和测序验证。本研究结合全自动核酸纯化仪进行核酸提取，具有简易、方便及提取效率高等优势，从核酸提取到检测结果判定所需时间小于1.5 h，适合快速检测。本方法仅可扩增出金黄色葡萄球菌，特异性强；最低检出限为10 fg 的 DNA 量，比直接普通 PCR 方法高 2 个数量级33-34，灵敏度高；阳性样本用PCR产物测序并进行BLAST比对，该样本的基因序列与金黄色葡萄球菌的基因序列相似度为100%，表明该样本为金黄色葡萄球菌nuc基因核酸阳性，所检样本的阳性率为4.40%，与细菌培养法检测结果一致。金黄色葡萄球菌是条件性致病菌，对其快速灵敏检测的意义在于，可方便研究者了解感染情况，便于采取后续措施。本研究的局限性主要是菌株的数量有限，包括目标菌株和非目标菌株，这对于特异性结果的准确性非常重要。因此，需检测更多的菌株，才能使检测结果更具有准确性和说服力。综上所述，本研究建立的金黄色葡萄球菌特异性基因nuc为靶基因的荧光定量PCR方法，特异性强、灵敏度高、重复性好并且检测速度快。经临床样本检测验证，本方法可用于大鼠、小鼠粪便样本中金黄色葡萄球菌的检测。作者贡献 Author Contribution 于灵芝负责引物设计并送合成，筛选扩增条件，性能评估，临床试验比对，数据处理，以及论文初稿的写作；谢建芸和冯丽萍负责论文的细菌培养、数据处理及论文修改；魏晓锋负责实验总体设计及关键性修改，实验结果的核对与把关，论文定稿把关。利益声明 Declaration of Interest 所有作者均声明本文不存在利益冲突。图4 PCR产物测序序列（A）和BLAST比对结果（B）Figure 4 Sequence of PCR product（A）and the result of BLAST（B）571实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)参考文献References1AHMAD-MANSOUR N,LOUBET P,POUGET C,et al.Staphylococcus aureus toxins:an update on their pathogenic properties and potential treatmentsJ.Toxins,2021,13(10):677.DOI:10.3390/toxins13100677.2HOWDEN B P,GIULIERI S G,WONG FOK LUNG T,et al.Staphylococcus aureus host interactions and adaptationJ.Nat Rev 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