P2X7受体_NLRP3轴对痛风急性发作的调控作用机制研究.pdf

第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023632DOI:10.13463/ki.cczyy.2023.06.010P2X7 受体/NLRP3 轴对痛风急性发作的调控作用机制研究刘业洲，李 瑞，白 冰，崔月娜，贺 怡，陈邬锦，孙玉萍*（新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830000）摘要：目的 探究 P2X7 受体/NLRP3 轴在痛风急性发作小鼠模型中的调控作用机制。方法 将 C57 小鼠随机分为 5组：对照组（注射生理盐水，8 只）、模型组（构建痛风小鼠模型，8 只）、C 组为 NLRP3 抑制剂组（模型动物鞘内注射 NLRP3 抑制剂，8 只）、D 组为 P2X7 抑制剂组（模型动物鞘内注射 P2X7 抑制剂，8 只）、E 组为 P2X7 抑制剂+NLRP3 激活剂组（模型动物鞘内注射 P2X7 抑制剂+NLRP3 激活剂组，8 只）。造模结束称质量后处死小鼠，取各组小鼠的静脉血和肝肾组织。使用 ELISA 试剂盒检测促炎因子 IL-1、IL-6、TNF-表达情况；Western blot 检测小鼠肠组织中 NLRP3、IL-1、ASC、Caspase-1、P2X7 相关蛋白的表达情况。结果 与对照组比较，模型组小鼠 IL-1、IL-6、TNF-表达提高（P 0.05），NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 蛋白表达水平增加（P 0.05）；与模型组比较，抑制 NLRP3 表达，IL-1、IL-6、TNF-表达降低（P 0.05）；与模型组比较，抑制 P2X7 表达，IL-1、IL-6、TNF-、P2X7 与 NLRP3 的表达降低（P 0.05）；与模型组比较，抑制 P2X7 表达，同时过表达 NLRP3，IL-1、IL-6、TNF-表达无统计学意义（P 0.05）；NLRP3、ASC、Caspase-1 降低，P2X7 表达增加（P 0.05）。结论 P2X7 受体/NLRP3 轴能够促进痛风急性发作小鼠模型的炎症作用，可作为药物研发的重要靶点，对疾病的治疗具有参考意义。关键词：急性痛风性关节炎；炎性反应；NLRP3/P2X7 受体轴；小鼠模型中图分类号：R574.62 文献标志码：A 文章编号：2095-6258(2023)06-0632-05Study on the regulation mechanism of P2X7 receptor/NLRP3 axis on acute attack of goutLIU Yezhou,LI Rui,BAI Bing,CUI Yuena,HE Yi,CHEN Wujin,SUN Yuping*(School of Basic Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China)Abstract:Objective To explore the regulatory mechanism of P2X7 receptor/NLRP3 axis in the mouse models of acute attack of gout.Methods C57 mice were randomly divided into the control group(injection of normal saline,8 mice),the model group(construction of gout mouse model,8 mice),group C(NLRP3 inhibitor group,8 mice,intrathecal injection of NLRP3 inhibitor in model animals),group D(P2X7 inhibitor group,8 mice,intrathecal injection of P2X7 inhibitor in model animals),and group E(P2X7 inhibitor+NLRP3 activator group,8 mice,intrathecal injection of P2X7 inhibitor+NLRP3 activator in model animals).At the end of modeling,the mice were killed after weighing,and the venous blood,liver and kidney tissues of the mice in each group were taken.The expressions of proinflammatory factor interleukin 1(IL-1),IL-6 and tumor necrosis factor-(TNF-)were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit.The expressions of NLRP3,IL-1,ASC,Caspase-1 and P2X7 related proteins in mouse intestinal tissues were detected by Western blot.Results Compared with the control group,the expression levels of IL-1,IL-6,TNF-,NLRP3,ASC,Caspase-1,and P2X7 proteins were increased in the mode group,and there were significant differences(P0.05).Compared with the the model group,the expression of NLRP3 was inhibited,the expressions of 基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（2021D01C275）作者简介：刘业洲（1994），男，硕士研究生，主要从事肠道菌群及代谢性疾病相关研究*通信作者：孙玉萍，女，教授，博士研究生导师，电子信箱-第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023633 急性痛风性关节炎（Acute Gouty Arthritis，AGA）是因为尿酸钠晶体沉淀引起的一种慢性炎性风湿病1-2，近年来发病率逐年增高，并呈现出年轻化趋势3-4。该病病因可能是由于细胞外液尿酸钠或其结晶沉淀在关节滑膜组织，引起炎症反应。痛风病人的慢性炎症会持续很长时间，在急性期会加重，导致组织肿胀，但白细胞、CRP 等感染性指标不会有太大的改变，一般都是通过炎性因素来衡量炎症的严重程度5。P2X7 受体是一种双向功能受体，在受体的第2 跨膜区上，形成一个离子通路6；离子的运动与薄膜的电压有关，参与了炎症反应的发生与发展。因此，在诸多炎症性疾病均可检测到其异常的表达情况能够促进炎性介质如 IL-1、IL-6、IL-18、TNF-等释放。研究7表明，P2X7 可能激活其下游炎症相关的通路，通过激活NLRP3复合体，招募ASC和Caspase-1前体，使其成为有活性的 Caspase-1（IL-1 转化酶），持续的 ATP 刺激又可使 P2X7 受体阳离子通道转变成非选择性质膜孔，便于 IL-1 释放至细胞外发挥炎性作用8。本研究基于 NLRP3/P2X7 受体轴探讨 NLRP3与 P2X7 受体在痛风中的调节作用机制，以期为后续的药物研究探寻重要的靶点。1 材料与方法1.1 材料 C57 小鼠 40 只，9 周龄，体质量 2330 g，雄性，由新疆医科大学提供，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0001，伦理批号：S20130418-3。试验前将小鼠置于（232）屏障级动物房中饲养1 周，标准饲料，饮用水为自来水。1.2 药物与试剂 尿酸钠盐，由 Sigma（美国）公司制造，戊巴比妥钠，购于北京源博汇科生物技术研究所。吐温-80，Sigma（美国）公司，IL-1、IL-6、TNF-ELISA 试剂盒，购于北京欣博盛生物技术有限公司，批号：20191108；NC 薄膜，0.45 m 孔径，德国 Sartorius 制造；牛血清白蛋白（BSA），购自赛默飞（美国）公司，批号：930342；NLRP3 表达抑制剂 Dapansutrile，CAS 号：54863-37-5，购自上海麦克林生化科技有限公司；P2X7 表达抑制剂 A-740003，NLRP3 激活剂，货号：BMS-986299（compound 112），以上购自 MedChemexpress 安诺伦（北京）生物科技有限公司。一抗：NLRP3，货号 MA5-32255，稀释度 1:500，ASC，货号 PA5-50915，稀释度 1:500，Caspase-1，货号 14-9832-82，稀释度 1:500，P2X7，货号 PA5-28020，稀释度 1:500，以上均购自赛默飞（美国）公司，IL-1，货号 ab254360，稀释度 1:500，购自Abcam（美国）公司。1.3 实验仪器 3-18K 型，冷冻型高速离心机，德国 Sigma 公司生产；全自动酶标分析仪，安图实验仪器（郑州）有限公司；GLP-F300 型，全自动生化分析仪，迪瑞医疗科技股份有限公司，CS-1200 型；电泳槽，孚约生物科技（上海）有限公司，通用型；电泳仪，赛默飞生物有限公司。1.4 模型制作及分组 将单钠尿酸盐加入 0.9%的氯化钠注射液，再加入Twin-80（9:1），加1 mL 1.5 moLL-1 NaOH，加热，搅拌，配制为25 mg mL-1的尿酸钠混合液，4下贮存，使用前摇匀。采用随机数表法，将C57小鼠分成5组，分别为对照组（0.9%的氯化钠注射液，8 只）、模型组（8 只）、C 组（小鼠模型鞘内注射 P2X7 抑制剂，8只）、D组（小鼠模型鞘内注射NLRP3抑制剂，8只）、E 组（小鼠模型鞘内注射 P2X7 抑制剂+NLRP3 激活剂，8只）。模型制作参照文献7方法造模。使用0.9%氯化钠注射液（溶解单钠尿酸盐）C57 小鼠足部左后外侧踝部注射；以 0.9%的氯化钠注射剂作为对照组，每天 1 次，连续 7 d。造模组关节比健侧组皮肤温度IL-1,IL-6 and TNF-were reduced in group C(P0.05).Compared with the model group,the expression of P2X7 was inhibited,the expressions of IL-1,IL-6,TNF-,P2X7,and NLRP3 in group D were decreased(P0.05);The expressions of NLRP3,ASC and Caspase-1 were decreased and and the expression of P2X7 was increased in group E(P0.05).Conclusion P2X7 receptor/NLRP3 axis can promote inflammatory effect of acute attack of gout in mouse models,and can be used as an important target for drug development,and has reference significance for the treatment of the disease.Keywords:acute gouty arthritis;inflammatory response;NLRP3/P2X7 receptor axis;mouse model第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023634增高、肿胀、骨骼特征消失、脚爪弯曲、四肢无力负重、行走迟缓、后腿弯曲、跛行、三足步态等。1.5 取材与指标检测1.5.1 关节肿胀的测量 在小鼠受试踝关节处做标记，造模后 1、6、12、24、48、72 h 采用爪肿测量仪测量各组小鼠右后踝关节标记以下的容积。关节肿胀度（mL）=（造模后踝关节容积-造模前踝关节容积）。1.5.2 C57 小鼠炎症因子及相关蛋白测定 4 周后，用2%戊巴比妥钠（40 mg kg-1体质量）进行腹腔麻醉，用 765 g 离心力（离心直径 8.0 cm，15 min），将上部血清吸收，-20保存。血清尿酸、尿素氮、肌酐的全自动生化分析仪。用酶联免疫吸附试验方法（ELISA法）测定 C57 小鼠血浆中 IL-1、IL-6、TNF-含量，并严格按照 ELISA 试剂盒说明进行操作。1.5.3 蛋白表达 采用蛋白质免疫印迹法检测关节滑膜组织相关蛋白表达，戊巴比妥钠进行腹腔麻醉后，处死小鼠，取脚踝软骨组织，放在 1 个预冷却的磨盘里，用液氮磨碎直到用 RIVT 分析裂解液来获取软骨组织，提取组织蛋白，用 BCA 方法测定浓度。按照蛋白:5Loading Buffer 比例为 4:1 混合，在 95孵育 10 min。配制 SDS-PAGE 凝胶，按照等体积上样，100 V 恒压条件下电泳 100 min，此时可观察蓝色水平线进入玻璃板的底部。PVDF 膜经过甲醇活化后，以 300 mA 恒流转膜 60 min。5%脱脂奶粉封闭 1 h。PVDF 膜放在提前稀释好的一抗内，在4 过夜反应。PVDF膜放在二抗内，摇床结合1 h。ECL 发光。加入封闭液稀释的二抗溶液（稀释浓度为 1:2 000），并在室温条件下培养 60 min。使用PBST清洗后，使用ECL发光液显影，曝光和灰度值。1.6 统计学方法 采用 SPSS 26.0 软件进行数据分析。计量资料呈正态分布，采用均数 标准差（sx）表示，多组数据比较采用单素方差分析（One-way ANOVA），多组间两两比较，采用方差分析；不同时间段比较，采用重复测量的方差分析。以P 0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 痛风性关节炎 C57 小鼠模型肿胀度与 IL-1、IL-6、TNF-表达的情况 与对照组 C57 小鼠的踝关节比较，C57 小鼠造模后踝关节的肿胀度显著升高（P 0.05），见表 1。模型组炎症因子表达水平高于对照组（P 0.05），见表 2。表 1 2 组 AGA 模型 C57 小鼠踝关节的肿胀度比较（sx，n=8）组别6 h24 h48 h72 h对照组0.120.040.150.030.110.030.120.04模型组0.570.06#0.760.14#0.710.09#0.520.06#注：与对照组比较，#P 0.05表 2 2 组 AGA 模型 C57 小鼠踝炎症因子表达比较（sx，n=8）组别IL-1IL-6TNF-对照组 65.6922.160.500.2315.663.83模型组186.4363.11#2.871.46#20.083.01#注：与对照组比较，#P 0.052.2 痛风性关节炎 C57 小鼠模型中 NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达比较 与对照组 C57 小鼠的踝关节比较，C57 小鼠造模后 NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 蛋白表达升高（P 0.05），见表 3。表 3 痛风性关节炎 C57 小鼠模型中 NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达比较（sx，n=8）组别NLRP3/-actinASC/-actinCaspase-1/-actinP2X7/-actin对照组 0.190.040.140.040.180.040.380.06模型组 1.310.07#1.040.08#1.590.09#3.260.14#注：与对照组比较，#P 0.052.3 抑制 NLRP3 与 P2X7 表达对小鼠模型中 IL-1、IL-6、TNF-、P2X7、NLRP3 表达情况的影响 与模型组比较，抑制 NLRP3 的表达，IL-1、IL-6、TNF-、NLRP3 的 表 达 降 低（P 0.05），P2X7 的表达差异无统计学意义（P 0.05），与模型组比较，抑制 P2X7 的表达，IL-1、IL-6、TNF-、P2X7、NLRP3的表达降低（P0.05）。见表4，图1。表 4 抑制 NLRP3 与 P2X7 表达对小鼠模型中 IL-1、IL-6、TNF-、P2X7、NLRP3 表达情况的影响（sx，n=8）组别IL-1IL-6TNF-P2X7/-actinNLRP3/-actin对照组 64.5723.220.520.2214.553.890.390.090.930.05模型组189.9945.762.991.5424.323.223.340.151.350.08C 组104.6932.33#1.570.32#18.433.86#3.390.140.370.06#D 组136.9637.37#1.670.45#16.493.55#2.410.09#1.000.04#注：与模型组比较，#P 0.05第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023635 注：A.对照组；B.模型组；C.C 组；D.D 组图 1 抑制 NLRP3 和 P2X7 表达对小鼠模型中 P2X7、NLRP3 蛋白表达的影响2.4 NLRP3/P2X7 受体轴对小鼠模型相关基因表达的影响 见表 5，表 6，图 2。表 5 NLRP3/P2X7 受体轴对模型动物 IL-1、IL-6、TNF-表达情况比较（sx，n=8）组别 IL-1IL-6TNF-对照组 64.5723.220.520.2215.553.89模型组189.9945.76#2.991.54#21.323.22#C 组104.6932.331.570.7218.433.62D 组136.9637.371.570.7218.993.55E 组176.9643.392.871.5020.443.67 注：与对照组比较，#P 0.05表 6 NLRP3/P2X7 受体轴对模型动物 NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达的影响（sx，n=8）组别NLRP3/-actinASC/-actinCaspase-1/-actinP2X7/-actin对照组0.190.040.140.040.180.040.380.06模型组1.310.071.040.081.590.093.260.14C 组0.370.060.390.050.440.063.390.45D 组1.000.060.640.050.740.070.410.09E 组1.070.07#0.920.06#1.230.07#3.300.14#注：与对照组比较，#P 0.05 注：A.对照组；B.模型组；C.C 组；D.D 组；E.E 组图 2 NLRP3/P2X7 受体轴对模型动物 NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表达的影响3 讨论 痛风性关节炎是由于患者嘌呤代谢能力较低，血尿酸水平增高，形成尿酸盐，积存于关节相关软组织，引起关节部位出现炎症和病损，多发于中年男性9。痛风可以喝一些低脂饮食来降低尿酸值，避免复发。痛风的家族性、基因类型目前的研究还不够全面10，痛风可引起关节囊、滑囊、骨质、软骨及其他组织的炎症反应，主要表现为高尿酸血症、软组织损伤及反复的关节炎，可分为急性或长期，且易复发，严重时会引起关节的腐蚀和损伤，活动障碍合并症、发病与促进嗜酸性白细胞浸润、生成促炎细胞因子等因素相关，是一种以炎症为特点的代谢性自限性疾病，尿钠通过炎性组织液进入关节软骨，侵入关节的软骨，造成骨质疏松，导致损伤是痛风发生的病机与重要因素11。近年来，随着临床上痛风发病率的急剧增加，该疾病已经引起病患家属以及全社会的广泛关注。随着不同的医学研究团体的深入研究，痛风的致病机理与调控机制逐步被人们认知。本研究探讨痛风发作的分子机制，以期为后续药物的开发与深度理解疾病的发病机制提供参考。本研究采用 C57 小鼠模型进行研究。模型动物的炎症因子显著高于对照组动物，且 P2X7 与NLRP3 基因的表达显著高于对照组（P 0.05）。本研究与研究12-13结果一致，均证实了 P2X7 与NLRP3 在痛风相关疾病中的差异表达。本研究在抑制 P2X7 表达后的结果证实，小鼠模型的炎症因子表达显著降低，即炎症作用显著降低，证明 P2X7高表达可能是导致痛风炎症作用的潜在分子机制之一；单独抑制 NLRP3 的表达，得到了与上述研究相类似的结果，综合以上结果表明，NLRP3 与 P2X7的高表达可能是导致模型动物炎症的重要内在机制，研究14-17均支持本研究的结论。并且，本研究结果证实了 NLRP3 与 P2X7 受体在模型动物中调控作用。本研究将 P2X7 的表达抑制，并同时过表达 NLRP3 A B C D E A B C A B C A B D A B DP2X7-actinNLRP3-actinP2X7-actinNLRP3-actinNLRP3-actinASC-actinCaspase-1-actinP2X7-actin第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023636表达，进一步证明了 P2X7 对下游 NLRP3 的调控作用，证明 P2X7 是通过 NLRP3 进一步发挥小鼠模型中的炎症作用。本研究结果证实了 P2X7 受体/NLRP3 轴在调控痛风发作小鼠模型中的潜在机制作用，并且与多个相关性研究结果进行对比，进一步证实了本研究结果的可靠性。王敬博18研究表明青梅复方对急性痛风性关节炎的干预作用可能是通过 NLRP3 发挥作用，邢艳阳19证实了 NLRP3 与 P2X7 在泻浊解毒通络法治疗急性痛风的作用机制，康佩芝20的研究结果表明了 P2X7R/NLRP3 信号通道在痛风清热方对急性痛风性关节炎 C57 小鼠局部组织中炎性信号表达的机制作用。以上研究结果均证实了本研究的靶点通路可能在后续的药物研发和新治疗方法中的潜在靶点作用。综上所述，本研究证实了 P2X7R/NLRP3 信号通道在痛风小鼠模型中的作用机制，为后续的药物开发与新型治疗方法的靶点选择提供了见解与支持。参考文献：1 李佳川,李思颖,宋琴,等.基于多层次交互网络和体内实验探讨藤茶总黄酮抗痛风性关节炎的作用机制 J.中国中药杂志,2022,47(17):4733-4743.2 刘剑刚,杨钊田,杨卫彬.急性痛风性关节炎模型大鼠炎性反应及 Toll 样受体通路相关蛋白表达 J.中华风湿病学杂志,2021,25(11):747-753,3.3 贾超,范秋玉,刘亚,等.白细胞介素-11 促进巨噬细胞 M2 极化及对痛风性关节炎的保护作用 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