M2型巨噬细胞外泌体包裹m...前列腺癌恶性进展的机制研究_关翰.pdf

收稿日期 修回日期 基金项目 安徽省自然科学基金项目（）；安徽高校自然科学研究项目（）；蚌埠医学院“”人才培育计划（）；蚌埠医学院第一附属医院优秀青年科学基金项目（）作者单位 蚌埠医学院第一附属医院 泌尿外科，安徽 蚌埠 作者简介 关 翰（），男，博士，副主任医师，副教授通信作者 陈志军，硕士研究生导师，主任医师，副教授：文章编号（）基础医学 型巨噬细胞外泌体包裹 促进前列腺癌恶性进展的机制研究关 翰，孙文衍，汪 盛，陈志军摘要目的：探究 型巨噬细胞外泌体包裹 对前列腺癌（，）恶性进展的影响并探讨其分子机制。方法：在成功建立 型巨噬细胞的基础上，抽提并鉴定其外泌体，检测外泌体中差异表达的，同时在不同 细胞中验证，选取 进行研究；细胞中转染 荧光标记的 与 细胞共培养，荧光显微镜观察 细胞中 荧光表达情况；和 细胞中转染 进行增殖、迁移等细胞功能学实验及裸鼠皮下成瘤实验；通过数据库筛选叉头盒转录因子（）作为靶基因，通过 、荧光素酶报告基因实验及免疫荧光实验进行验证；干扰 后进行细胞功能学实验，观察是否能逆转 对 及 细胞功能学的影响。结果：成功建立 细胞并抽提其外泌体，其中 在 细胞外泌体中高表达；荧光定量 实验结果证明 在 及 中表达量显著高于，在 细胞中表达量高于 细胞，细胞与 细胞共培养后，细胞可通过外泌体传递 至 细胞内；敲低 和 细胞中 的表达量后显著降低其增殖、迁移能力并促进其凋亡，在 中敲低 表达后裸鼠皮下成瘤体积显著减小；、荧光素酶报告基因实验及免疫荧光实验结果证明 可以直接结合，抑制 入核并抑制 细胞；挽救实验结果说明转染 后可逆转 对 和 细胞迁移的抑制作用。结论：细胞可通过外泌体传递 进入 细胞靶向 抑制其恶性进展。关键词 前列腺肿瘤；型巨噬细胞；外泌体；叉头盒转录因子中图法分类号 文献标志码 ：，（，）：（）：，；，；（），；，：，；，；，；，；：蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 ；前列腺癌（，）是男性常见的恶性肿瘤，在导致男性癌症死亡的原因里名列前茅。早期 的治疗方案为去雄激素治疗，随着病情 的 进 展，多 数 会 进 展 为 去 势 抵 抗 型（，），这一阶段的 已对雄激素不敏感，是目前的治疗难题。同时，有 的 病人最终发生远处转移，成为导致死亡的主要原因，探究促使 发生恶性进展的机制，使病人获得更好的预后显得尤为重要。近年来 的肿瘤微环境受到越来越多的关注，因其在调节肿瘤进展和转移扮演着重要角色。肿瘤相关巨噬细胞（，）是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞群，在肿瘤转移过程中具有广泛的促肿瘤作用。巨噬细胞在局部微环境中可能会对不同的刺激表现出不同的表型。一般说来，在各种外界因素刺激下，巨噬细胞可以分化为经典的促炎型 巨噬细胞和抗炎型 巨噬细胞，型巨噬细胞能促进肿瘤进展，因此，似乎更有可能被归类为 巨噬细胞，尽管其具有同时表达 和 标志的混合表型。型巨噬细胞释放的细胞因子或蛋白与肿瘤细胞的耐药、侵袭和转移密切相关。外泌体是直径在 之间的脂质双层膜囊泡。外泌体可以包裹微小、长非编码、蛋白质和其他生物活性物质，调控生理和病理条件下细胞的活动，可以由癌细胞或非癌细胞分泌，并可以被微环境中的其他细胞吸收，从而影响到其他细胞的生物学功能。在前期研究中，笔者发现在 组织中 型巨噬细胞含量比前列腺增生组织高，并鉴定了一些在 型巨噬细胞外泌体和 外泌体中差异标的，其中 在 型巨噬细胞外泌体内高表达。本研究进一步体外和体内实验表明，可通过 外泌体传递至 细胞内，并可靶向叉头盒转录因子（）增强 细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化（，）的能力。现作报道。材料与方法 细胞的获取、和 三种前列腺癌细胞以及前列腺上皮细胞 购自 细胞库，细胞培养液为 （），含 的胎牛血清以及双抗（）。细胞培养在 、饱和湿度的细胞培养箱中进行。人单核细胞系 购自广州赛库，在含有 胎牛血清（）、青霉素和 链霉素的 中培养。为了诱导 细胞向 型巨噬细胞转化，在 细胞中加入 （南京春秋生物），然后再与 和 培养。流式细胞仪检测、标志物的表达。外泌体的抽提与鉴定 细胞和 型巨噬细胞在 中培养 后，将条件培养液 离心，再 离心，去除细胞和细胞碎片。将离心后的上清液以 离心 和 离心 。离心后的外泌体悬浮于 磷酸盐缓冲液（）中。超速离心机型号为 。透视电镜观察外泌体形态，使用纳米粒子跟踪分析（）证明外泌体 ，并且进一步使用 检测外泌体标志物。使用红色亲脂荧光染料 标志通过高速离心法抽提的外泌体。将 标记的外泌体分别与 和 细胞孵育 ，使用荧光显微镜（，）观察 和 细胞对 标记的外泌体的摄取情况。细胞的共培养 荧光标记的 购买自西安瑞禧生物科技有限公司，购买自 公司。将前列腺癌细胞 种入 孔板中，小室内种入转染过 的 型巨噬细胞，共培养 后使用荧光显微镜进行观察，对照组加入外泌体抑制剂。荧光定量 实验 提取细胞中的，使用外泌体 提取试剂盒（）按照说明书进行操作获取外泌体中的。逆转录试剂盒（）按照说明书进行操作。逆转录引物为，内参和 的 逆 转 录 引 物 为 。将 逆转录为。荧光试剂盒购买自罗氏公司。八连管中加入引物，模板、荧光染料，无菌去离子水补足体积至 。上机检测仪器 条件设置为 ，个循环，循环条件 ，。循环结束后在 时收集数据，绘制扩增曲线。以 作为内参，通过 法计算 的相对含量。，细胞的转染基于 数据库，从上海吉玛公司购买获得 （）、（）、（）和 （）以及 （）和具有非特异性序列的阴性对照 （）。将 和 细胞接种在 孔板中，并按照制造商的方案使用（）进行转染。在转染后 ，使用细胞进行功能测定。慢病毒颗粒的包装如下：个慢病毒表达质粒由上海吉玛公司构建，含有针对 的，并用于在 存在下感染 细胞。通过嘌呤霉素筛选细胞，并通过 确认 的敲低。的 引物如下：；上 下 游 引 物 序 列：，；，。实验 细胞转染 后，均匀接种于孔板（个细胞 孔）中。然后将细胞在 、的潮湿环境中培养、和 。在每个时间点，将细胞与 细胞计数试剂盒溶液（碧云天）孵育，然后在 、中孵育 ，以评估细胞的增殖能力。用分光光度计在 波长处测定吸光度。每次实验重复 次。及 实验 和 试剂盒均购买自罗氏公司，实验步骤简述如下。实验：将处理完毕的细胞接种到 孔板中，加入 培养基后在细胞培养箱中培养 。用 多聚甲醛固定，甘氨酸孵育，根据说明书加入试剂后使用荧光显微镜观察细胞图像；实验：每组转染细胞接种于密度为 的培养皿中 。弃去培养基，用 洗涤 次。然后用 的多聚甲醛固定细胞，用 的 进行透膜，按照说明书操作完成剩余步骤后使用荧光显微镜观察。实验收集细胞进行裂解，提取总蛋白。使用聚丙烯酰氨凝胶电泳 分离蛋白，随后使用 膜（）进行转膜。转膜完毕后使用 的脱脂奶粉封闭 ，使用一抗 孵育过夜。洗涤后二抗（）孵育 ，用 洗涤 膜，随后用 发光检测试剂盒（碧云天）在化学发光检测系统进行显色。定量分析采用 软件进行（）。抗体信息：（，），（，），（，），（，）。流式细胞凋亡检测 细胞铺 孔板，待生长至分别转染，后可进行实验。洗涤细胞 次，采用不含 的胰蛋白酶消化细胞，计数调整浓度，染色（吉凯生物），流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞迁移和侵袭检测分别使用不带有 和预铺 的 小室进行细胞迁移和侵袭实验。小室上层为无血清培养基，下层为含血清的培养基。加入细胞培养 后固定，结晶紫染色，去除上层细胞，显微镜下计数穿过薄膜的细胞。划痕实验 将细胞接种在 孔板中用丝裂霉素（）预处理 排除增殖的影响。使用无菌移液管尖端在孔中形成直伤口，并使用 去除漂浮细胞。倒置显微镜在 和 拍摄细胞迁移图像，并通过 分析软件测量细胞迁移距离，选择了 个距离并取平均值。平板克隆实验 细胞以每孔 个细胞的密度接种于 孔板中，在培养箱中培养 。处理时细胞用 清洗 次，甲醇固定 ，室温下用 结晶紫染色 。用 软件计数含有 个以上细胞的集落。裸鼠皮下成瘤实验 周龄 裸鼠购自扬州大学比较医学中心。所有动物实验均经蚌埠医学院第一附属医院机构动物爱护使用委员会和伦理委员会批准。实验根据美国国家实验动物护理和使用研究所健康指南进行。将转染慢病毒的 细胞胰酶消化后悬浮在 中，将细胞（个）注射到裸鼠侧腹皮下种植 周。周后，通过颈椎脱位处死裸鼠。用游标卡尺测量肿瘤最长直径和最短直径，体积 （长径 短径）计算肿瘤体积。部分切除组织用于 检测。免疫荧光实验 将细胞用 洗涤 次，用多聚甲醛固定，使用 透膜。向细胞中加入抗体并在 下孵育过夜。第 天将在室温下孵育 的细胞与二抗一起孵育。随后的实验在黑暗中进行。在 孵育 并用 清洗 次后，使用荧光共聚焦显微镜（型）进行观察。蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 荧光素酶报告基因实验 由上海吉玛基因合成了 非翻译区（）片段，其中包含可能的 结合序列。将野生型和突变型 亚克隆到 载体中，获得 和。将 和 细胞接种于 孔板中，在 下用 试剂分别与 模拟物或、或 质粒共转染，后用双荧光素酶报告分析系统进行检测。采用化学发光法检测荧光素酶活性。重复测量 次，计算平均值。统计学方法采用 检验、方差分析及 检验。结果 成功构建 型巨噬细胞并抽提鉴定其外泌体 通过流式细胞仪检测、及 的表达量，结果可见 型巨噬细胞标志物 表达量较 和 型巨噬细胞相比均明显升高（见图 和表）。同时抽提 型巨噬细胞进行电镜观察，可见抽提的外泌体呈典型的茶托形状（见图）。纳米粒子跟踪分析显示外泌体粒径的集中趋势在 左右。检测外泌体膜标志物 及 阳性，同时不表达（见图），结合外泌体电镜照片、粒径分析及 检测外泌体膜标志物，确定抽提物质为 型巨噬细胞外泌体。表、型巨噬细胞标志物 和 阳性率比较（；）分组 阳性率 阳性率 组内 检验：与 比较；与 比较 型巨噬细胞外泌体包裹 传递至 细胞内 荧光定量 结果显示，与人正常前列腺上皮细胞 相比，在前列腺癌细胞系、和 中均高表达（），与 细胞相比，在 型巨噬细胞中显著高表达（和 ）（见表）。转染 荧光标志的 后的 型巨噬细胞与 细胞在非接触共培养体系中共培养后 中 表达量显著升高（），但在共培养体系中加入外泌体抑制剂，共培养后 中 表达无明显变化（）（见表）。使用红色 荧光标志外泌体，并与 细胞共培养，荧光显微镜可观察到外泌体被 细胞吸收，蓝色 荧光为细胞核，红色为 荧光（见图 ）。转染 荧光标志的 后的 型巨噬细胞与 细胞非接触共培养，荧光显微镜观察到 中存在 的绿色荧光，在共培养体系中加入 则荧光显微镜在 中无法观察到绿色荧光。抽提 荧光标志的 后的 型巨噬细胞外泌体与 细胞共培养，亦可在细胞中观察到 的绿色荧光（见图），代表 可通过 型巨噬细胞外泌体传递至 细胞内。表 在不同细胞中的相对表达量（）分组 相对表达量 组内 检验：与 比较 表 在 和 中的相对表达量（）分组 相对表达量 表 不同分组外泌体与 细胞共培养后 相对表达量的变化（）分组 相对表达量 组内 检验：与 比较 ；与 比较 ，可促进 和 细胞的增殖、侵袭迁移能力并抑制其凋亡通过瞬时转染 进行细胞功能学实验，克隆形成实验、实验结果验证抑制 后细胞增殖能力减弱（）（见表 及图 ）；实验、凋亡实验证实抑制 后促进细胞凋亡（）（见表 及图 ）；侵袭实验、细胞划痕实验证实抑制 后抑制细胞侵袭及迁移能力（）（见表 及图 ）。表 转染 后细胞增殖能力的变化（）分组克隆数量 阳性细胞率 阳性细胞率 蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 ，可抑制 细胞裸鼠皮下成瘤的瘤体生长转染慢病毒稳定干扰 细胞内 的表达，进行裸鼠皮下成瘤实验，通过小动物成像仪观察瘤体 荧光（见图），处死裸鼠后测量瘤体体积，干扰 后可明显抑制瘤体生长（见图），实验检测干扰 组瘤体组织中 对比对照组表达显著升高（）（见图、表）。表 流式细胞凋亡实验验证转染 后细胞凋亡能力变化（；）分组 表 转染 后细胞迁移及侵袭能力的变化（）分组划痕愈合比例 侵袭细胞数量 表 转染 后细胞成瘤能力变化（）分组瘤体质量 靶向 促进 入核，促进前列腺细胞 预测网站结合文献选取 作为 潜在下游靶基因进行验证，荧光素酶报告基因实验结果提示 序列能直接结合到 区（）（见表）。实 验 结 果 显 示 转 染 后可抑制 及 细胞 进展，同时 表达量升高，核内 表达量减低（见图），为进一步直观验证，免疫荧光实验观察到转染 后 荧光强度减低，同时 荧光向细胞核外转移（见图）。在前列腺增生及 组织中验证 表达量，提示增生组织中 表达量较高（）（见表）。表 荧光素酶报告基因实验各组荧光比值变化（）分组 组内 检验：与 组比较 ；与 组比较 表 及前列腺增生组织中 相对表达量（）分组 相对表达量增生组织 组织 功能回复实验验证 可逆转 对细胞侵袭能力及 造成的影响 为验证 效率，通过 实验检测干扰 后的表达，结果证明干扰后 细胞中的 表达量显著减低（见图），同时干扰 表达后 细胞侵袭能力下降（见图），为进一步探究 与 的关系，共转染后进行侵袭实验及 检测 相关指标，结果说明 可逆转 蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 对细胞侵袭能力及 造成的影响（）（见图 及表）。讨论 近年来越来越多的学者将注意力集中在肿瘤微环境中的细胞相互作用上，其中肿瘤相关巨噬细胞是研究的重点和热点。肿瘤相关巨噬细胞衍生的趋化因子和细胞因子，如、和转化生长因子，显著影响癌症进展的各个方面，包括免疫逃逸、肿瘤扩散和治疗耐药等。此外有研究表明，浸润的巨噬细胞群与癌细胞的生物学行为呈正相关关系，并与病人预后不良密切相关。在本课题组前期研究中发现，前列腺肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞数量高于前列腺增生组织，提示肿瘤相关巨噬细胞可能在 恶性进展中发挥作用。大多数研究都集中在巨噬细胞分泌的细胞因子、分子或其他蛋白质上，但考虑到 对癌细胞进展的调节作用，还需要更多地关注。是一种非编码的单链 分子，与靶基因的 结合，在转录后调节 的表达。以往的研究仅局限于细胞或组织的 差异表达，而忽略细胞外泌体的作用，它们也可能通过包裹运输 来介导细胞与细胞之间的相互作用。例如，外显子介导的载脂蛋白（）的穿梭参与了 信号通路的激活，从而促进了胃癌细胞的迁移。此外，膀胱癌细胞分泌的转化生长因子可诱导成纤维细胞表型转化为与癌症相关的成纤维细胞。有研究团队发现 衍生的外切体中包含的 和 通过靶向 表达促进结肠癌细胞的迁移和侵袭。有研究报道，上皮性卵巢癌中 细胞的失衡主要归因于 外切体产生的 水平异常，因此，笔者推测 外体释放的 影响 细胞的恶性行为。为了验证笔者的假设，笔者进行了微阵列分析，从 和 型巨噬细胞的外体中筛选出差异表达的 并进行进一步实验。在促进或抑制各种恶性肿瘤发展方面的不同作用使其难以达成共识。通过搜索相关文献，尚未见明确证据表明 在 发生或进展中的调节作用研究，这使得笔者值得进行进一步的研究。随后的 结果也与基因芯片结果吻合。笔者验证了外泌体释放的 可以直接被受体 细胞吸收，并检测到 细胞中 标记的 的绿色荧光信号，而添加外泌体抑制剂时未检测到绿色荧光。在进行细胞功能学实验后，笔者发现 在体外和体内可以显著促进 细胞的增殖并抑制细胞凋亡。为了寻找可能导致 的促肿瘤发生作用的下游靶点，笔者通过靶基因预测网站选取交集结合文献，预测 作为 的下游靶基因，通过荧光素酶报告基因测定和蛋白质印迹 验 证。是 叉 头 盒 转 录 因 子 家 族 ，（、和）的重要成员，它已被证明为调节肿瘤的恶性过程的重要因子，包括细胞增殖、侵袭和转移。在促进或抑制多种恶性肿瘤的 过程中发挥着与不同的作用。一方面，与 协同作用以促进细胞迁移和，同时，参与 通路来参与 介导的结直肠癌 进展。然而另一方面，被发现受到上游 的抑制，例如 和，从而阻碍了乳腺癌和肺腺癌中的 。在 发育过程中，绝大多数研究似乎都承认 通过受其上游 和 调节或调节下游转录因子（包括）发挥抑制作用。在此基础上笔者发现 的表达可能受到 的抑制，从而促进 细胞的增殖和侵袭。从理论上讲，可以与细胞质中的 发生功能性相互作用，抑制 在细胞核中的积累并促进其降解，从而抑制已知 标志物和癌症转移关键调节剂的激活。本研究发现 通过抑制 表达发挥其对 恶性进展的促进作用，并进一步证明干扰 导致 在 细胞中的易位并显增加 标志物的表达。表 功能回复实验各组细胞侵袭能力变化（）分组 蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 本研究仍有一定的局限性，是肿瘤转移的关键步骤，还可以进行体内肺或骨转移测定以确定 是否会影响 细胞转移。此外，笔者的数据不支持涉及 途径或调节 表达的上游介质的进一步分子探索。除了考虑 和其他潜在靶 之间的共同结合位点之外，识别和验证其他靶标及其效果对于提供额外的治疗方案是必不可少的。总之，本研究发现在 型巨噬细胞中分离出的外泌体的驱动下，细胞在肿瘤微环境恶性行为进一步发展，此外，笔者说明了 轴在诱导 和加速 恶化中的作用，提示笔者可以通过研究针对 轴的治疗方法来治疗 病人。参考文献，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：骆欣敏，何玉，吴凤娇，等 外泌体 在子宫内膜癌中表达及其临床意义 蚌埠医学院学报，（）：杨硕，杨清玲 外泌体介导的 调控 对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响 蚌埠医学院学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学青年科学基金项目（）作者单位 安徽中医药大学第一附属医院 耳鼻喉科，临床实验中心，安徽 合肥 作者简介 邱筱婷（），女，硕士研究生通信作者 霍星星，主管检验技师：；朱玲，硕士研究生导师，副主任医师：文章编号（）基础医学原发性干燥综合征小鼠唾液腺组织及唾液的转录组和蛋白质组分析邱筱婷，巩红校，朱 玲，霍星星摘要目的：通过对实验性干燥综合征（）小鼠的唾液腺组织和唾液进行转录组学和蛋白质组学分析，探讨原发性干燥综合征（）的发生机制。方法：建立 模型，留取唾液腺组织和唾液，分别通过高通量转录组测序和基于 的蛋白质组学分析，了解唾液腺组织和唾液中相关 和蛋白表达，通路富集分析用于识别异常的调控路径，并进一步进行 和蛋白质关联分析。结果：通过唾液腺病理检查与唾液量测定成功验证 模型，并鉴定出 个差异表达基因和 个差异表达蛋白。通过对转录组学和蛋白质组学数据的整合分析，发现 个蛋白质重叠。对异常调控的基因和蛋白的富集通路分析显示，与肾素 血管紧张素系统（）、溶酶体和细胞凋亡的信号通路显著相关，其中、在转录和蛋白水平上具有一致的调控趋势，可能是 的潜在诊断生物标志物。结论：致病机制可能与、溶酶体和细胞凋亡信号通路相关，、可能是 发病过程的关键分子。关键词 原发性干燥综合征；转录组；蛋白组；唾液腺；小鼠中图法分类号 文献标志码 ：，（，）：（）（）：，：，（），：，；，：，（）：，（）：（本文编辑 刘梦楠）蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期