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北方农业学报 2023袁51渊2冤院91-100JOURNAL OF NORTHERN AGRICULTURE朱教宁，高莉，张静璇，等.氨氮质量浓度对厌氧发酵产甲烷特性及产甲烷菌群落的影响 J.北方农业学报，2023，51（2）：9员-员园园.DOI：10.12190/j.issn.2096-1197.2023.02.11收稿日期：2023-03-09基金项目：山西省重点研发计划项目（202102140601012）；“十四五”国家重点研发计划项目（2021YFD1901105）；山西省科技重大专项计划“揭榜挂帅”项目（202101140601026）；山西省农业科学院农业科技创新研究课题（YCX2020YQ19）作者简介：朱教宁（1986），女，硕士，主要从事农业废弃物资源化利用的研究工作。通信作者：李永平（1979），男，副研究员，博士，硕士生导师，主要从事农业废弃物资源化利用的研究工作。氨氮质量浓度对厌氧发酵产甲烷特性及产甲烷菌群落的影响朱教宁1，2，3，高莉4，张静璇4，李永平1，2，3，汤昀1，2，3，史向远1，2，3，王秀红1，2，3（1.山西农业大学 山西有机旱作农业研究院，山西 太原030031；2.农业农村部有机旱作农业重点实验室，山西 太原030031；3.有机旱作农业山西省重点实验室，山西 太原030031；4.山西农业大学 资源环境学院，山西 太原030031）摘要：【目的】研究氨氮质量浓度对鸡粪和玉米秸秆混合厌氧发酵产甲烷特性及产甲烷菌群落的影响。【方法】以鸡粪和玉米秸秆的混合物作为发酵原料，以不添加氮源的处理为对照，通过添加外源氮源设置不同氨氮质量浓度 1 500、3 000、4 500、6 000 mg/L 中温厌氧发酵试验，测定分析不同处理的产甲烷特性和产甲烷菌群落变化规律。【结果】氨氮质量浓度3 000 mg/L 时，对发酵系统无明显抑制作用；氨氮质量浓度逸3 000 mg/L 时，厌氧消化系统受到明显的抑制，表现为产甲烷高峰期滞后、原料累积产甲烷量下降、游离氨（FAN）含量增加、挥发性脂肪酸（VFAs）积累。氨氮质量浓度为3 000、4 500、6 000 mg/L 时，其原料累积产甲烷量分别为 119.50、96.60、64.52 mL/gVS，较对照分别降低 16.66%、32.67%、55.03%，其中，6 000 mg/L 的氨氮质量浓度已超过了 IC50（半抑制浓度）。当氨氮质量浓度T1T2T3T4。T1 处理与 CK 无显著差异（P0.05），T2耀T4 处理均显著低于 CK（P0.05），氨氮质量浓度为 3 000、4 500、6 000 mg/L（T2耀T4 处理）时，其原料累积产甲烷量为119.50、96.60、64.52 mL/gVS，较 对 照 分 别 降 低16.66%、32.67%、55.03%。由此可知，原料累积产甲烷量随氨氮质量浓度的增加而降低，氨氮质量浓度为 3 000 mg/L 及以上时，对发酵系统的产甲烷过程94北 方 农 业 学 报51 卷注：P甲烷表示实际原料累积产甲烷量。Note：P甲烷indicates the actual material cumulative methane production.图 2不同氨氮质量浓度下各处理的原料累积产甲烷量Figure 2Material cumulative methane production of treatments under different ammonia mass concentration发酵时间/dFermentation time表 2不同氨氮质量浓度下各处理原料产甲烷动力学拟合结果Table 2Fitting results of material methane production kinetics of treatments under different ammonia mass concentration指标IndexP甲烷/（mL/gVS）P/（mL/gVS）V甲烷，m/mL/（d gVS）r/dR2143.48139.2611.612.930.996 8138.86134.729.083.690.996 5119.50115.887.694.870.997 496.6096.636.608.390.997 764.5265.204.4513.690.995 6CKT4T3T2T12.2发酵系统 pH 值和 VFAs 变化图 3 为各处理 pH 值和 VFAs 的变化曲线图。由图 3 可知，添加 NH4Cl 溶液的处理组初始 pH 值均较 CK 低，且氨氮质量浓度越高，pH 值越低。这是因2 期95朱教宁等：氨氮质量浓度对厌氧发酵产甲烷特性及产甲烷菌群落的影响产生了明显的抑制；其中 T4 处理的原料累积产甲烷量较 CK 下降超过 50%，6 000 mg/L 的氨氮质量浓度已超过了 IC50（半抑制浓度）。众多学者的研究结果表明，修正的 Gompertz 模型能较好地拟合有机物厌氧发酵的产气动力学过程19-21。为此，本试验采用修正的 Gompertz 模型对各处理反应体系的原料产甲烷量进行了拟合（表2）。由表 2 可知，各处理 R2均大于 0.995，理论产甲烷量与实测值差异较小，拟合结果较好。拟合数据显示，最大原料产甲烷速率和理论原料累积产甲烷量均随氨氮质量浓度的升高而降低，这与本试验结果一致。CK 的理论原料累积产甲烷量和最大原料产甲烷速率分别为 139.26 mL/gVS 和 11.61 mL/（d 窑 gVS）。氨氮质量浓度为 1 500 mg/L 的处理拟合值与 CK 相差较小；当氨氮质量浓度跃1 500 mg/L 时，理论原料累积产甲烷量和最大原料产甲烷速率均较 CK 降低，分别下降 16.79%耀53.18%和 33.76%耀61.67%。另外，氨氮质量浓度的升高，会延长迟滞时间，CK 的迟滞时间为 2.93 d，当氨氮质量浓度上升为 1 500、3 000 mg/L 时，迟滞时间分别增加至3.69、4.87 d，为 CK 的 1.26、1.66 倍；当氨氮质量浓度为4 500、6 000 mg/L 时，迟滞时间为 8.39、13.69 d，已增加至 CK 的 2.86、4.67 倍。图 3不同氨氮质量浓度下各处理的 pH 值及 VFAsFigure 3pH value and VFAs of treatments under different ammonia mass concentration发酵时间/dFermentation time发酵时间/dFermentation time96北 方 农 业 学 报51 卷为外加 NH4Cl 溶液后增加了系统中 NH4+的浓度，使得反应式 NH4+OH-NH3 H2O 向右进行，进而系统 pH 值下降。随着厌氧发酵反应的进行，各处理组pH 值整体上呈现先降低后升高的变化趋势。发酵第5 天，各反应体系中水解酸化菌迅速将大分子有机物转化为VFAs 等中间产物，引起 pH 值降低。随后CK 和 T1 处理的 pH 值开始逐渐升高，T2耀T4 处理则继续下降，反应进行到第 15 天时降为最低，分别为 7.64、7.44、7.24。由图 3 可知，各处理的 VFAs 质量浓度呈先升高后降低的整体趋势。反应开始后，各处理的 VFAs 质量浓度均迅速升高，随着反应的继续进行，CK 与 T1 组的 VFAs 被产甲烷菌快速消耗，且消耗速度远大于 VFAs 的产生速度，VFAs 的质量浓度快速下降。T2 的变化趋势与 CK 近似，但是VFAs 的下降速度明显放缓，这是因为产甲烷菌较水解酸化菌更容易受氨氮抑制，产甲烷菌的活性受限使得 VFAs 的消耗速度降低，相应的产甲烷速率明显下降，产甲烷高峰期滞后，这与孟晓山等22的研究结果一致。T3 和 T4 处理组氨氮质量浓度高，产甲烷菌活性受到严重抑制，VFAs 的质量浓度在反应前期不降反升，发酵第 15 天时的 VFAs 分别达到峰值 4 295.89、6 841.79 mg/L，VFAs 严重累积，之后随着产甲烷菌活性的慢慢恢复，VFAs 的质量浓度开始下降，这与 T3 和 T4 处理产甲烷峰值延迟至第 16、20 天相对应。2.3发酵系统 TAN 和 FAN 的变化由图 4 可知，各处理 TAN 质量浓度整体呈先升高后降低并趋于稳定的趋势，整个发酵过程中波动较小。反应初始阶段，鸡粪中含氮有机物质快速分解为氨氮，导致各处理发酵系统中的 TAN 增加。随后，CK 和 T1 处理中的氨氮被产甲烷菌生长利用，氨氮质量浓度在发酵第 5 天后开始降低。T2耀T4 处理由于产甲烷菌受到不同程度的抑制，TAN 未被及时利用继续慢慢升高，之后随着产甲烷菌活性的恢复，TAN 开始缓慢降低，整个发酵过程 TAN 均维持在一个较高的水平上。至反应结束时，T2耀T4处理的 TAN质量浓度分别为3660.62、5912.22、9004.38mg/L。反应体系中氨氮的存在形式有两种，包括 NH4+和 FAN，二者对产甲烷菌均有毒害作用，而 FAN 的毒性更大23。FAN 的变化情况见图 4，各处理初始 FAN 的质量浓度较高，为 283.58耀697.14 mg/L，这主要是由于初始pH 值较高（7.87耀8.72）引起的，随着反应的进行FAN 先降低后升高，整体上初始氨氮质量浓度越高，FAN 的质量浓度越高。有研究认为，200 mg/L 是厌氧发酵系统的 FAN 抑制阈值24-25。CK 和 T1 处理的 FAN 除了初始值高于 200 mg/L 的 FAN 抑制阈值外，其余发酵时段均低于这一抑制阈值。值得注意的是，发酵第 15 天时，T2耀T4 处理的 FAN 质量浓度均处于 200 mg/L 以下，这是因为发酵前期高氨氮质量浓度抑制了产甲烷菌的正常代谢，造成了 VFAs 积累、pH 值下降；由公式（2）可知，温度一定，TAN 的变化较稳定时，pH 值降低 FAN 也随之降低。TAN、VFAs、pH 值和 FAN 的这种相互关系导致此时系统发酵时间/dFermentation time发酵时间/dFermentation time图 4不同氨氮质量浓度下各处理的 TAN 及 FANFigure 4TAN and FAN of treatments under different ammonia mass concentration2 期97朱教宁等：氨氮质量浓度对厌氧发酵产甲烷特性及产甲烷菌群落的影响出现了“抑制型稳态”，即系统各指标在正常范围内，但产甲烷量很低26-27。其余发酵时间，T2耀T4 处理的 FAN 质量浓度均高于 200 mg/L，至反应结束时T2耀T4 处理的 FAN 质量浓度分别达 288.38、375.01、535.30 mg/L。2.4 产甲烷菌群落的变化由图 5 可知，CK 和 T1 处理中甲烷鬃菌属（Methanosaeta）为优势菌属，相对丰度分别为42.38%、27.37%；甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）、甲烷囊菌属（Methaanoculleus）和Candidatus_Methanoplasma 的 相 对 丰 度 分 别 为4.23%、2.64%、0.05%和 6.02%、8.50%、0.38%。随着氨氮质量浓度的提升，Methanosaeta 的相对丰度整体 下 降，而 Methanosarcina、Methaanoculleus 和Candidatus_Methanoplasma 的相对丰度逐渐上升。当氨氮质量浓度为 3 000 mg/L 时，Methanosaeta 的相对 丰 度 降 至15.36%，而Methanosarcina、Methaanoculleus 和 Candidatus_Methanoplasma 的相对丰度分别上升至 9.98%、12.04%和 1.75%。当氨氮质 量 浓 度 进 一 步 提 升 至 4 500、6 000mg/L 时，Methanosaeta 的 相 对 丰 度 继 续 下 降 至 12.88%、6.69%，Methanosarcina 和 Methaanoculleus 的相对丰度 则 分 别 提 高 至 22.05%、26.80%和 12.33%、18.77%，二者取代 Methanosaeta 成为优势菌属，Candidatus_Methanoplasma 的相对丰度也分别提升至 2.43%、8.56%。据报道，Methanosaeta 为严格的嗜乙酸型产甲烷菌属，在低氨氮质量浓度的厌氧发酵系统中，往往占据主导地位，但对氨氮特别是 FAN 较为敏感，氨氮质量浓度高时其含量会明显下降28。孟晓山等22研究发现，当氨氮投加量超过 4 000 mg/L 时，发酵系统的产甲烷菌群结构发生改变，Methanosaeta 逐渐被 具有较强 氨氮耐 受 能 力 的 Methanosarcina 和Methaanoculleus 替代；YANG 等15的研究结果也表明，随着氨氮的质量浓度由 2 g/L 提高至 5 g/L，嗜乙酸型产甲烷菌属 Methanosaeta 减少，而氢营养型产甲烷菌属 Methaanoculleu 增加，这与本试验结果一致。Methanosarcina是一种兼性营养型产甲烷菌属，能同时利用乙酸和氢气进行产甲烷活动，且其自身为不规则的细胞团结构，对高质量浓度氨氮具有较强的抗性29。Methaanoculleus 为氢营养型，研究人员发现在高氨氮环境中 Methaanoculleus 的相对丰度会大幅提升30，但是由于氢营养型产甲烷菌属的产甲烷速率明显低于嗜乙酸型产甲烷菌属，高氨氮质量浓度的厌氧发酵体系的产甲烷效率普遍较低31，这与本试验中氨氮质量浓度逸3 000 mg/L 时，产甲烷量降低相吻合。Candidatus_Methanoplasma 为甲基型和氢型混合营养产甲烷菌属32，在本试验中其相对丰度随着氨氮质量浓度的升高而增加。孙娟等33的研究结果表明，在发酵系统 VFAs 质量浓度越高Candidatus_Methanoplasma 的相对丰度越大，这与本试验结果相符。图 5各处理产甲烷菌的相对丰度（属水平）Figure 5Relative abundance of methanogens under different treatments（genus）相对丰度/%Relative abundance98北 方 农 业 学 报51 卷3讨论玉米秸秆为富碳物料，干物质含碳量通常在80%以上，将二者混合进行厌氧发酵有利于平衡原料的碳氮比，在一定程度上减缓氨氮抑制34。但是在本试验中，氨氮质量浓度在 3 000 mg/L 时即出现了明显的氨氮抑制，说明玉米秸秆的添加对鸡粪氨氮抑制的缓解效果并不明显，这与 JAN 等35、孙辰36的研究结果一致。张玉秀等37也研究认为，通过添加富碳物料调节 C/N 来缓解氨氮抑制，其反应过程较慢，仅在系统未被完全抑制前有一定的效果。在本试验条件下，当氨氮质量浓度逸3 000 mg/L时，产甲烷菌群发生了明显的改变，表现为优势菌群由嗜乙酸型产甲烷菌属向氢营养型产甲烷菌属转变，表明产甲烷途径已由氢利用型为主取代了乙酸利用型为主22。因此，有学者通过微生物长期驯化和接种、增强发酵系统中氨氮耐受能力较强的产甲烷菌株的群落数来缓解氨氮抑制。蒋建国等38通过长期驯化可使餐厨垃圾厌氧消化在氨氮质量浓度为3 000 mg/L 的环境中长期稳定运行；FOTIDIS 等39通过长期驯化，将氨氮抑制的阈值由 5 000 mg/L提升至 7 000 mg/L。然而，微生物的生长速度较慢，驯化接种往往耗时过长，很难应对发酵体系中氨氮质量浓度的快速上升，因此，接种驯化在高负荷、高氨氮质量浓度环境中的缓解效率还有待进一步探讨38，40。4结论（1）随着氨氮质量浓度的升高，鸡粪和玉米秸秆混合厌氧发酵的原料累积产甲烷量逐渐降低。氨氮质量浓度约3 000 mg/L 时，对发酵系统无明显抑制作用；氨氮质量浓度逸3 000 mg/L 时，厌氧发酵系统受到氨氮抑制，FAN 质量浓度随氨氮质量浓度的提升不断增加，VFA 质量浓度逐渐升高直至出现累积，原料累积产甲烷量不断下降。（2）修正的 Gompertz 模型较好地反映了各处理组反应体系的产气动力学过程，获得了不同氨氮质量浓度条件下鸡粪与玉米秸秆混合厌氧发酵的理论原料累积产甲烷量和最大产甲烷速率。拟合结果表明，随初始氨氮质量浓度的提升，理论原料累积产甲烷量和最大产甲烷速率逐渐降低，迟滞时间延长。（3）氨氮质量浓度约3 000 mg/L 时，嗜乙酸型产甲烷菌属 Methanosaeta 为优势产甲烷菌。当氨氮质量浓度逸3 000 mg/L 时，随着氨氮质量浓度的提升，Methanosaeta 的相对丰度逐渐降低，其主导地位逐渐 被 氨 氮 耐 性 更 高 的 氢 营 养 型 产 甲 烷 菌 属Methanosarcina 和 Methaanoculleus 取代。1 张河民.畜禽粪污厌氧消化研究进展J.广东化工，2019，46（19）：117-118.2 李丹阳，孙少泽，马若男，等.山西省畜禽粪污年产生量估算及环境效应J.农业资源与环境学报，2019，36（4）：480-486.3 于琼.秸秆预处理及添加剂对玉米秸秆与鸡粪混合厌氧发酵产沼气特性的影响 D.上海：上海交通大学，2020.4 魏丹丹，刘健峰，王昌梅，等.玉米秸秆厌氧消化产气特性研究 J.中国沼气，2021，39（4）：19-24.5 王晓娇.混合原料沼气厌氧发酵影响因素分析及工艺优化 D.杨凌：西北农林科技大学，2013.6 ORHAN Y，BURAK D.Ammonia inhibition in anaerobicdigestion：A reviewJ.Process Biochemistry，2013，48（5/6）：901-911.7 周曼.鸡粪干式厌氧消化氨抑制解除技术研究D.北京：中国农业科学院，2020.8 乔玮，毕少杰，熊林鹏，等.氨氮浓度对鸡粪中高温甲烷发酵的影响 J.中国环境科学，2019，39（7）：2921-2927.9 BUJOCZEK G，OLESZKIEWICZ J，SPARLING R，et al.High solid anaerobic digestion of chicken manureJ.Journal of Agricultural Engineering Research，2000，76（1）：51-60.10汤昀，李永平，庞震鹏，等.鸡粪玉米秸秆混合厌氧发酵产气特性分析 J.山西农业科学，2020，48（7）：1093-1097.11苏有勇.沼气发酵检测技术 M.北京：冶金工业出版社，2011.12国家环境保护总局，水和废水监测分析方法 编委会.水和废水监测分析方法 M.4 版.北京：中国环境科学出版社，2002.13庞震鹏，李永平，朱教宁，等.猪粪玉米秸秆不同干物质比厌氧发酵产气及稳定性研究J.安全与环境学报，2019，19（5）：1767-1775.14李永平，庞震鹏，朱教宁，等.牛粪与玉米秸秆不同配比厌氧发酵的产气性能 J.西北农林科技大学学报（自然科学版），2020，48（10）：73-81援15YANG Z Y，WANG W，HE Y F，et al.Effect of ammoniaonmethaneproduction，methanogenesispathway，microbialcommunityandreactorperformanceundermesophilicandthermophilicconditionsJ.RenewableEnergy，2018，125：915-925.16JONG H P，JEONG J Y，GOPALAKRISHNAN K，et al.Effects of acclimation and pH on ammonia inhibition formesophilicmethanogenicmicrofloraJ.WasteManagement，2018，80：218-223.17ROSSI E，PECORINI I，FERRARA G，et al.Dry anaerobicdigestion of the organic fraction of municipal solid waste：Biogasproductionoptimizationbyreducingammoniainhibition J.Energies，2022，15（15）：5515.18高文萱，张克强，梁军锋，等.氨胁迫对猪粪厌氧消化性能的影响 J.农业环境科学学报，2015，34（10）：1997-2003.19陈雪，袁海荣，邹德勋，等.餐厨垃圾和稻草两相厌氧发酵及其动力学J.环境工程学报，2015，9（5）：2405-2411.20王菊华，陈玉保，李睿帆，等.底物质量分数对混合蔬菜废弃物厌氧发酵的影响及动力学研究 J.河南农业大学学报，2019，53（6）：934-940.21李超，刘刚金，刘静溪，等.基于产甲烷潜力和基质降解动力学的沼气发酵物料评估 J.农业工程学报，2015，31（24）：262-268.22孟晓山，张玉秀，隋倩雯，等.氨氮浓度对猪粪厌氧消化及产甲烷菌群结构的影响 J.环境工程学报，2018，12（8）：2346-2356.23TIAN H L，FOTIDIS I A，MANCINI E，et al.Differentcultivationmethodstoacclimatiseammonia-tolerantmethanogenicconsortiaJ.BioresourceTechnology，2017，232：1-9.24JIANGY，MCADAME，ZHANGY，etal.Ammoniainhibition and toxicity in anaerobic digestion：A criticalreviewJ.JournalofWaterProcessEngineering，2019，32：100899.25RAJAGOPAL R，MASS魪D I，SINGH G.A critical reviewon inhibition of anaerobic digestion process by excessammonia J.Bioresource Technology，2013，143：632-641.26余少杰，薛竣，时昌波，等.外加氨氮对玉米秸秆厌氧发酵的影响 J.环境科学与技术，2013，36（11）：142-147.27宋柳莹.鸡粪厌氧发酵过程中的氨抑制机理及抑制恢复策略研究 D.济南：山东大学，2020.28王逸雪.氨氮胁迫下餐厨垃圾厌氧消化系统微生物响应研究 D.重庆：重庆大学，2019.参考文献：2 期99朱教宁等：氨氮质量浓度对厌氧发酵产甲烷特性及产甲烷菌群落的影响29张虹，李蕾，彭韵，等.氨氮对餐厨垃圾厌氧消化性能及微生物群落的影响J.中国环境科学，2020，40（8）：3465-3474.30NIU Q G，KUBOTA K，QIAO W，et al.Effect of ammoniainhibition on microbial community dynamic and processfunctional resilience in mesophilic methane fermentationof chicken manureJ.Journal of Chemical Technology&Biotechnology，2015，90（12）：2161-2169.31XU K W，LIU H，CHEN J.Effect of classic methanogenicinhibitors onthe quantity and diversityofarchaealcommunity and the reductive homoacetogenic activityduring the process of anaerobic sludge digestionJ.Bioresource Technology，2010，101（8）：2600-2607.32顾航，肖凡书，贺志理，等.湿地微生物介导的甲烷排放机制 J.微生物学报，2018，58（4）：618-632.33孙娟，李东，郑涛，等.微量元素对蔬菜废弃物连续厌氧消化系统微生物群落结构的影响 J.应用与环境生物学报，2019，25（1）：156-163.34宋佳楠，于佳滢，冯磊，等.鸡粪和玉米秸秆混合干发酵特性及微生物多样性研究J.可再生能源，2022，40（3）：292-298.35JANM，FRANZISKAS，KATHRINH，etal.UseofbiocharsinanaerobicdigestionJ.BioresourceTechnology，2014，164：189-197.36孙辰.农业生物质特性与厌氧消化产气产酸关系研究D.上海：上海交通大学，2016.37张玉秀，孟晓山，王亚炜，等.畜禽废弃物厌氧消化过程的氨氮抑制及其应对措施研究进展 J.环境工程学报，2018，12（4）：985-998.38蒋建国，王岩，隋继超，等.厨余垃圾高固体厌氧消化处理中氨氮浓度变化及其影响 J.中国环境科学，2007，27（6）：721-726.39FOTIDIS I A，KARAKASHEV D，KOTSOPOULOS T A，etal.Effect of ammonium and acetate on methanogenicpathway and methanogenic community compositionJ.FEMS Microbiology Ecology，2013，83（1）：38-48.40孟伟，查金，张思梦，等.餐厨垃圾厌氧消化过程氨氮抑制及缓解办法综述 J.环境工程，2019，37（12）：177-182.（责任编辑刘誉）100北 方 农 业 学 报51 卷