shRNA SIRT3基因对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及机制研究.pdf

收稿日期 2020-02-25摇 修回日期 2022-06-11基金项目 河南省科技发展计划基金项目(142102310459)作者单位 1.陕西省榆林市第一医院 检验科,719000;2.陕西省榆林市医药卫生健康发展研究中心,719000;3 陕西省榆林市第二医院 检验科,719000作者简介 王晓亮(1983-),女,主任检验师.文章编号 1000鄄2200(2023)05鄄0629鄄04检验医学shRNA SIRT3 基因对乳腺癌细胞MCF鄄7 侵袭能力的影响及机制研究王晓亮1,郑摇 伟2,赵摇 娜3摘要目的:探讨 shRNA SIRT3 基因对乳腺癌细胞 MCF鄄7 侵袭能力的影响及机制。方法:以人乳腺癌细胞系 MCF鄄7 细胞为实验对象。按照处理方法将乳腺癌 MCF鄄7 细胞分成 3 组,即空白对照组(不转染慢病毒的乳腺癌 MCF鄄7 细胞组)、阴性对照组(乳腺癌 MCF鄄7 细胞转染无序序列慢病毒载体)和 shRNA 干扰组(乳腺癌 MCF鄄7 细胞转染 shRNA SIRT3 序列慢病毒载体)。采用实时荧光定量 PCR 和 Western blotting 等方法检测 SIRT3 和凋亡相关因子 caspase鄄3、caspase鄄9 的表达水平;采用Transwell 试剂盒检测细胞的侵袭能力。结果:shRNA 干扰组 SIRT3 mRNA 相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组(P 0.01),caspase鄄3 mRNA、caspase鄄9 mRNA 相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)。Western鄄blotting检测结果显示,shRNA 干扰组 SIRT3 蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)。Transwell 实验结果显示,shRNA 干扰组迁移细胞数均明显少于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)。结论:shRNA鄄SIRT3 的慢病毒干扰载体可促进人乳腺癌细胞的凋亡,抑制人乳腺癌细胞的侵袭。关键词 乳腺肿瘤;沉默信息调节因子;断链 RNA 干扰;慢病毒转染中图法分类号 R 737.9 摇 摇 摇 文献标志码 A摇 摇 摇 DOI:10.13898/ki.issn.1000鄄2200.2023.05.018Effect of shRNA SIRT3 gene on invasive abilityof breast cancer cell MCF鄄7 and its mechanismWANG Xiao鄄liang1,ZHENG Wei2,ZHAO Na3(1.Department of Laboratory Medicine,The First Hospital of Yulin City,Yulin Shanxi 719000;2.Medical and Health DevelopmentResearch Center,Yulin Shanxi 719000;3.Department of Laboratory Medicine,The Second Hospitalof Yulin City,Yulin Shanxi 719000,China)Abstract Objective:To explore the effect of shRNA SIRT3 gene on invasive ability of breast cancer cell MCF鄄7 and its mechanism.Methods:Human breast cancer cell line MCF鄄7 cells were used as experimental subjects.According to the treatment method,breastcancer MCF鄄7 cells were divided into three groups:blank control group(breast cancer MCF鄄7 cells without lentivirus transfection),negative control group(breast cancer MCF鄄7 cells transfected with disordered sequence lentivirus vector)and shRNA interference group(breast cancer MCF鄄7 cells transfected with shRNA SIRT3 sequence lentivirus vector).The expression levels of SIRT3 and apoptosis鄄related factors caspase鄄3 and caspase鄄9 were detected by RT鄄PCR and Western blotting,and the invasive ability of cells was detected byTranswell kit.Results:The relative expression of SIRT3 mRNA in the shRNA interference group was lower than that in the negativecontrol group and the blank control group,and the relative expression of caspase鄄3 mRNA and caspase鄄9 mRNA was higher than thosein the negative control group and the blank control group(P 0.01).The protein expression levels of SIRT3,caspase鄄3 and caspase鄄9detected by Western blotting showed the same trend.The results of the Transwell experiment showed that the number of migrated cells inthe shRNA interference group was less than that in the negative control group and the blank control group(P 12 h)。SIRT鄄3 一抗经一抗稀释液 1颐 10 000 稀释后加入样本离子膜。第 2 天用 PBST 稀释液洗膜,重复 3 次,加用山羊抗小鼠 IgG 二抗经二抗稀释液 1颐 1 000 稀释后孵育二抗1.5 h,用 PBST 稀释液洗膜,重复 3 次,而后用DAB 显影液处理样本。Image J 软件分析蛋白条带。1.7摇 Transwell 小室实验检测细胞的迁移摇 3 组细胞经胰蛋白酶消化后收集,按说明书要求,将基底膜的基质原液放在冷藏冰箱(4 益)过夜融化,然后与预冷的无血清的 DMEM 培养基按照 1颐 3 比例配置侵袭 上 室 凝 胶 液 体,以 每 孔 55 滋L 的 量 包 被Transwell 小室的上室,放置37 益孵育箱,2 h 后使上室成胶。然后上室每孔接种 200 滋L 不含血清的细胞培养液,下室加入 10%胎牛血清的 DMEM 培养液500 滋L。将 Transwell 板放置在 37 益孵育箱中培养24 h 后用结晶紫染色。然后将 Transwell 板用倒置036J Bengbu Med Coll,May 2023,Vol.48,No.5光学显微镜,拍照,并进行细胞计数。所有实验均重复 3 次。1.8摇 统计学方法摇 采用方差分析和 q 检验。2摇 结果2.1摇 免疫组织化学染色摇乳腺癌组织和癌周组织的 SIRT3 免疫组织化学染色结果显示,肿瘤组织的SIRT3 棕色染色明显强于癌旁组织。2.2摇 3 组 SIRT3 mRNA、caspase鄄3 mRNA 和 caspase鄄9 mRNA 表达比较摇 shRNA 干扰组 SIRT3 mRNA 相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase鄄3 mRNA、caspase鄄9 mRNA 相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)(见表 2)。摇 表2摇 3 组 SIRT3 mRNA、caspase鄄3 mRNA、caspase鄄9 mRNA相对表达量比较(n=3;x 依 s)分组SIRT3 mRNAcaspase鄄3 mRNA caspase鄄9 mRNA空白对照组1.00 依0.01*1.00 依0.02*1.00 依0.02*阴性对照组1.08 依0.01*1.11 依0.03*0.53 依0.03*shRNA 干扰组 0.42 依0.013.17 依0.118.29 依0.10F3 892.001 003.5015 077.34P0.010.010.01MS组内0.0010.0050.004摇 摇 q 检验:与 shRNA 干扰组比较*P 0.012.3摇 3 组 SIRT3、caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量比较摇Western鄄blotting 检测结果显示,shRNA 干扰组 SIRT3 蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)(见表 3)。摇 表 3摇 3 组 SIRT3、caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量比较(n=3;x 依 s)分组SIRT3 蛋白caspase鄄3 蛋白caspase鄄9 蛋白空白对照组1.00 依0.01*1.00 依0.01*1.00 依0.39*阴性对照组3.50 依0.35*2.00 依0.34*3.00 依0.43*shRNA 干扰组 0.50 依0.325.00 依0.248.00 依0.32F103.33225.04266.27P0.010.010.01MS组内0.0750.0580.147摇 摇 q 检验:与 shRNA 干扰组比较*P 0.012.4摇 Transwell 实验检测细胞迁移摇shRNA 干扰组迁移细胞数均明显少于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)(见表 4)。3摇 讨论摇 摇 恶性肿瘤是威胁人类生存的重大公共卫生问题之一,寻求恶性肿瘤的治疗靶点具有十分重要的研究意义8-9。SIRT3 基因与恶性肿瘤的侵袭性密切相关10-11。本研究构建 shRNA鄄SIRT3 慢病毒干扰载体,探讨 shRNA鄄SIRT3 对乳腺癌细胞的侵袭作用机制,为临床乳腺癌的治疗提供新的治疗靶点。表 4摇 3 组 Transwell 实验检测细胞的迁移情况(x 依 s)分组n细胞数/个空白对照组3125.36 依0.96*阴性对照组3125.84 依0.53*shRNA 干扰组350.29 依0.24F13 503.14P0.01MS组内0.420摇 摇 q 检验:与 shRNA 干扰组比较*P 0.01摇摇caspase鄄3 是一种蛋白酶,1994 年 Fernandez鄄Alnemri 等在 BenBank 表达序列标记(expressionsequence tag,EST)数据库中找到一段与 ICE/CED鄄3活性中心同源的序列,用它合成探针后,筛选人Jurkat T 淋巴细胞 cDNA 文库,从中克隆到一种新基因,因其编码相对分子量为 32 000 的半胱氨酸蛋白酶而称之为 CPP3212-13。本研究采用实时荧光定量 PCR 方法和蛋白水平 Western鄄blotting 方法,结果显示,shRNA 干扰组 SIRT3 mRNA 和 SIRT3 蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase鄄3 mRNA、caspase鄄9 mRNA 及相应蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组。提示shRNA鄄SIRT3 在乳腺癌细胞的凋亡中具有明显作用,蛋白水平亦证实了 shRNA鄄SIRT3 在乳腺癌细胞的侵袭能力具有明显抑制作用。肿瘤的侵袭能力是恶性肿瘤与良性肿瘤的重要区别14,同时也是检验一种治疗方法针对恶性肿瘤的检验指标15。本研究采用 Transwell 试剂盒检测shRNA鄄SIRT3 慢病毒干扰载体的侵袭能力,结果显示,shRNA鄄SIRT3 慢病毒干扰载体可有效抑制人乳腺癌细胞的侵袭。综上,shRNA鄄SIRT3 的慢病毒干扰载体可促进人乳腺癌细胞的凋亡,抑制人乳腺癌细胞的侵袭。但本实验存在不足,如缺乏动物模型体内的检测,尚有待进一步研究证实。参考文献1摇 YOUN HJ,HAN W.A review of the epidemiology of breast cancerin asia:focus on risk factorsJ.Asian Pac J Cancer Prev,2020,21(4):867.2摇 SHI H,LIU J,TU Y,et al.Oolong Tea extract induces DNAdamage and cleavage and inhibits breast cancer cell growth and136蚌埠医学院学报 2023 年 5 月第 48 卷第 5 期tumorigenesisJ.Anticancer Res,2018,38(11):6217.3摇 THOMAS M,KELLY ED,ABRAHAM J,et al.Invasive lobularbreast cancer:a review of pathogenesis,diagnosis,management,and future directions of early stage diseaseJ.Semin Oncol,2019,46(2):121.4摇 SUN YS,ZHAO Z,YANG ZN,et al.Risk factors and 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技师应注重手动控制及个性化扫描方案的设计,在满足诊断需求的前提下最大限度降低患儿辐射剂量。本研究的不足之处在于:(1)图像质量主观评分与观察者的读片习惯与倾向有关,评分结果可能存在争议;(2)未对辐射剂量进行实际测量,研究中所获得的 CTDIvol 为机器自动给出,可能与实际有/或不相符;(3)有研究12-13显示,CTDIvol 和 DLP 评估患儿 CT 检查时受到的辐射剂量并不准确,目前人们尝试采用体型特异性剂量估算值来评估患儿辐射剂量,但肘关节用这种方法评估存在困难,今后我们会对这方面进行深入研究。参考文献1摇 马连菊,李武,付加珍.16 排螺旋 CT 肘关节外伤扫描方法的优化探讨J.西部医学,2011,23(7):1350.2摇 李克伟,戎帅,滕勇,等.3D 打印技术个性化手术治疗儿童DDHJ.中国矫形外科杂志,2019,27(5):465.3摇PEARCE MS,SALOTTI JA,LITTLE MP,et al.Radiationexposure from CT scans in childhood and subsequent risk ofleukaemia and brain tumors:a retrospective cohort studyJ.Lancet,2012,380(9840):499.4摇 钱伟亮,丰川,周丹静,等.FBP、iDose4和 IMR 重建算法对低剂量双下肢 CTA 图像质量的影响J.中国医学影像技术,2017,33(2):290.5摇 边传振,张楠,刘鹏,等.呼吸频率及螺距对儿童胸部 CT 检查图像质量及辐射剂量的影响J.中国临床医学影像杂志,2019,30(7):468.6摇 卞柳利,姚利华.64 排螺旋 CT 肘关节优化体位扫描技术的应用J.中国 CT 和 MRI 杂志,2017,15(6):145.7摇 赵飞,李磊,蒲进,等.双定位像结合 Care Dose 4D 和 Care kV技术在降低肺部 CT 辐射剂量的临床应用价值J.中华放射医学与防护杂志,2017,37(5):389.8摇 陈光文,赵黎明,彭盛坤,等.MSCT 薄层联合三维重组技术对局限性腹膜炎的诊断价值J.西部医学,2018,30(7):1041.9摇 袁知东,刘远健,江国银,等.双上肢均不能上举患者胸腹部CT 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