现代微生物学实验技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

绿色糖单孢菌发酵绿色糖单孢菌发酵及胞外酶提取及胞外酶提取北京林业大学 生物科学与技术学院-10-20第1页试验目了解发酵应用广泛性了解利用发酵罐进行高密度培养技术掌握发酵罐使用原理和方法掌握酶活测定方法第2页试验原理试验原理绿色糖单孢菌（Saccharomonospora viridis）是一个耐热耐碱放线菌，产胞外木素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶。发酵：微生物把一些原料养分在适当发酵条件下经特定代谢路径转变成所需产物过程。影响发酵条件：培养基成份、温度、诱导时机及诱导剂、溶解氧、pH等。第3页试验材料试验材料菌株：绿色糖单孢菌（Saccharomonospora viridis）培养基l种子培养基：大豆蛋白胨种子培养基：大豆蛋白胨1%1%、酵母粉、酵母粉0.2%0.2%、酶水解酪、酶水解酪素素0.2%0.2%、氯化钠、氯化钠0.6%0.6%、葡萄糖、葡萄糖1%1%l发酵培养基：种子培养基中加入诱导物发酵培养基：种子培养基中加入诱导物0.2%xylan0.2%xylanpH 7.88.0灭菌温度：115，30min第4页试验试验方法方法步骤：种子液的准备固体培养基挑取单菌落接种于种子培养基中，培养于45、120rpm，3d发酵培养取一定比例的种子培养基接于发酵培养基中（1:200）粗酶液提取10000rpm、4离心15min酶活测定木聚糖酶活xylanase第5页数据分析生长曲线及产酶曲线木聚糖酶比活（包含木糖标准曲线、蛋白含量标准曲线等）第6页生长曲线及产酶曲线生长曲线及产酶曲线生长曲线测定：在发酵培养过程中，从接种后每6h取样（3ml），测定其在OD600条件下吸光度值，至发酵结束。以同条件下未接种培养液为空白对照，培养时间为横坐标，菌液OD600吸光度值为纵坐标绘制绿色糖单孢菌在生长曲线。产酶曲线测定：在发酵培养过程中，从接种后每6h取样（2ml），分别测定其木聚糖酶和纤维素酶比活。比活。第7页木聚糖酶活测定方法制作木糖标准曲线。用PH7磷酸缓冲液分别配制浓度1mg/mL木糖溶液。取十支带有刻度25mL试管，分别吸入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL木糖溶液。加入磷酸缓冲液，使每支试管溶液体积为1.5mL。每支试管中加入1.0 mLDNS溶液，在沸水中反应5min,反应后快速冷却至室温。向每支试管中加入10 mL蒸馏水，在540nm处测定溶液吸光值。第8页木聚糖酶活测定方法酶活测定方法：1.粗酶液稀释10倍作为待测酶液；2.用pH7磷酸缓冲液配制得到1%木聚糖溶液作为木聚糖酶底物，在试管中加入0.5mL底物，0.1mL酶液和0.9mL磷酸缓冲液，于60下水浴20min，加入1mLDNS试剂，在沸水中煮5min,冷却后加蒸馏水10mL混匀后，540nm处测定其吸光度。第9页蛋白含量测定方法考马斯亮蓝G-250法蛋白质浓度123456样品蛋白ml（c=0.1mg/ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水ml1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250ml555555蛋白含量g020406080100第10页3组分工第一组：菌株S.v 发酵培养基：STS+xylan第二组：菌株S.v-artp1 发酵培养基：STS+xylan第三组：菌株S.v-artp2 发酵培养基：STS+xylan第11页4组分工10.20 早晨 固体平板挑去单菌落接种于STS液体培养基中活化培养；准备好活化液以1：200百分比接种于发酵培养基中45，120rpm发酵培养；下午：16:00 取5ml发酵液，3ml用来测定吸光度，2ml编号存放于4 22:00 取5ml发酵液，3ml用来测定吸光度，2ml编号存放于4第12页天天 早晨 10:00 下午 16:00 晚上 22:00以上操作共7天，10.27日早晨将7天保留样品（21个）测木聚糖酶比活。第13页第14页