丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书.doc

丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
1. 目的
采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测，合用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。
2. 范围
合用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。
3. 职责
3.1 操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
3.2 专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
3.3 实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4. 原理
采用荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样本的检测。此外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5. 样本规定
5.1 合用标本类型：血清
5.2 标本采集
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2 ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.3 标本保存和运送
所采集的标本可立即用于测试或长期保存于-70℃，也可保存于-20℃待测，保存期为3个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运送时间不应超过4天。
5.4 拒收标本：拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。
6. 仪器和试剂
6.1 设备
AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
6.2 试剂
生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司
产品标准批号：YZB/国 7271-2023
最低检出量：最低检出量为500 IU/ml
试剂各组分见表1：
表1 试剂盒组分表
组 分 名 称
规 格
数 量
核酸提取试剂
RNA提取液A
200 ul/管
1
RNA提取液B
5 ml/瓶
2
DEPC H2O
3 ml/瓶
1
PCR 检测试剂
HCV内标溶液
100 ul/管
1
HCV反映液A
270 ul/管
1
HCV反映液B
30 ul/管
1
质控品
阴性质控品
200 ul/管
1
HCV强阳性质控品
200 ul/管
1
HCV临界阳性质控品
200 ul/管
1

7. 操作环节
7.1试剂准备（试剂储存和准备区）
7.1.1 进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检查流程登记表上做相应记录。
7.1.2 PCR反映液配制
7.1.2.1 取出HCV反映液A、HCV反映液AB，室温溶化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后使用。
7.1.2.2取出N个（N = 待测样本数+ 4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔）PCR反映管，HCV单人份扩增体系配制见表2：
表2 PCR反映液配置表
组分
HCV反映液A
HCV反映液B
总体积
用量/人份
27 ul
3 ul
30 ul
将各组分充足混匀，混合好后进行短时离心将管壁上的液体所有离心至管底，之后将30 ul扩增体系分装到PCR反映管，反映液分装时尽量避免产气愤泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。
7.1.3 75%乙醇配制：取2.25 ml的DEPC H2O，加入6.75ml的无水乙醇，振荡混匀，配制成75%乙醇，盖紧盖子，经传递窗传递到标本制备区。
7.2 RNA提取（标本制备区）
7.2.1 进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反映管和75%乙醇，放入标本制备区冰箱冷藏。
7.2.2 从冰箱取出待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、RNA提取液A、RNA提取液B和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。
7.2.3 打开金属浴，调节温度为65℃，使仪器自动升温。
7.2.4用镊子夹取n个1.5 ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上。（n= 待测样本数+ 3 = 待测样本数 +HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品）
7.2.5 向离心管中各加入10 ul内标溶液，再分别加入200ul样本，800 ul RNA提取液B，盖紧管盖，振荡混匀15s以充足混匀，室温放置5min（每隔1min旋涡振荡5s，使裂解更充足，解决结束后瞬时离心。）
7.2.6 加入200 ul无水乙醇，盖紧管盖，漩涡振荡混匀15s以充足混匀，瞬时离心，再加入20 ul RNA提取液A，漩涡振荡混匀5s，室温静置1min。8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.7 再加入200 ul RNA提取液B，盖紧管盖，充足混匀（用移液枪吹打），室温下8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.8 加预冷的75%乙醇400ul充足混匀，8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.9加预冷的75%乙醇400ul充足混匀，8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.10 打开管盖，放入金属浴，65℃干燥5 min，使液体挥发完全。
7.2.11 温育5min后，用镊子从金属浴中取出离心管，加入50 ul DEPC H2O，用移液枪吹打混匀，室温静置1min后，8000 rpm离心1min。离心管内的上清液即为病毒核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于-70℃。
7.2.13 取出已分装好的PCR反映管，向相应编号的PCR管中加入解决好的的样品（涉及待测标本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各20 ul，空白对照不加模板，盖紧反映管。8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区。（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。）
7.3 PCR扩增（扩增区）
7.3.1 从传递窗中取出PCR反映管，放入仪器样品槽内。
7.3.2 在“Set up”按相应顺序设立空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测标本，并在“sample name”一栏中设立样本名称，探针检测模式设立：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：NONE。具体设立方法参考《AB 7500核酸扩增仪标准作业指导书》。
7.3.3 打开“Run Method”窗口设立循环条件：
50℃ 15 min，1个循环；
95℃ 5min ，1个循环；
94℃ 15s → 55℃ 45 s（收集荧光）， 45个循环；
7.3.4 保存文献，运营仪器。
8. 结果分析
8.1 反映结束后，操作人员可根据实际情况自行调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可设在5-20。在Log图谱窗口设立的Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线。点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面查看结果，记录样本数值（C）。
8.2 假如反映体系扩增曲线在FAM检测通道无明显对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则鉴定样品的HCV RNA阴性。
8.3 假如反映体系扩增曲线在FAM、VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道CT≤45；或者扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期且CT≤45 ，在VIC检测通道无对数增长期，则鉴定样品的HCV RNA阳性性。
9. 质量控制
每次实验均需检测阴性质控品、HCV 强阳性质控品、HCV临界阳性质控品。质控品结果满足质量控制规定期方可进行检测结果的判断。
9.1 试剂盒自带质控
（1）阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期，VIC检测通道扩增曲线有明显对数增长期。
（2）HCV 阳性质控品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期，且强阳性质控品FAM检测通道CT≤30，临界阳性质控品FAM检测通道≤36。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，且0.97≤r≤1。
9.2 室内质控
每次实验应选择适当的HCV RNA质控品做室内质控。
9.3 以上规定（9.1和9.2）需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需从新进行。
10. 干扰因素
10.1 环境中存在RNase，可降解RNA，导致实验结果假阴性，因此实验过程应戴手套，帽子，防止皮屑、毛发等的RNase，实验用品需高压灭菌后使用，尽量避免污染。
10.2 临床标本中内源性克制物：血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、脂类、等都可克制PCR反映，标本应避免溶血、脂血、黄疸等。
10.3 外源性克制物：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套上的滑石粉、标本容器上的克制物等，标本应按采集规定采集，操作中应小心谨慎，标本容器及实验用品应鉴定合格。
10.4 标本的交叉污染：操作过程中应细心认真，防止交叉污染，尽量使用带鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取，以及时发现交叉污染。
11. 生物参考区间： 1.0×102 IU/ml~1.0×108 IU/ml
12. 警示/危急值：HCV RNA检测无警示/危急值。
13. 异常结果解决
如遇HCV RNA检测结果与临床诊断或资料，或与近期历史检测结果不相符合，应及时与临床医生联系、沟通，查找因素并采用措施，于《疑问报告发放解决登记表》中记录解决过程。如需复查，需及时保存标本。
14. 临床意义
HCV感染诊断的指标，指导临床治疗。
15. 变异的潜在来源
标本保存不妥或反复冻融，都会影响检测结果的准确。
16. 注意事项
16.1 实验过程中必须穿专用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要时戴防护眼罩，接触标本后必须及时更换手套。
16.2 阳性质控品和检测样本均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。
16.3 实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。
16.4 样品的解决操作应在生物安全柜内进行。
16.5所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。
16.6 样本核酸提取后，建议立即进行下一步实验，否则请保存于-20℃待用（24 h）。
16.7 操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。
16.8 加样时应使样品完全落入反映液中，不应有样品粘附于管壁上，尽快盖紧管盖。上机前注意检查各反映管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
16.9 标本制备区所用到的试管、吸头等需打入盛有消毒剂的容器，并与废物一起灭菌后方可丢弃。
16.10 扩增完毕立即取出反映管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。
16.11 实验中用过的吸头请直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
16.12 每次实验均应有质量控制。
16.13 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精解决工作台和移液枪，然后用紫外线灯照射30 min。
17. 记录保存
与丙型肝炎病毒核酸定量相关的使用维护保养要如实具体记录，并按规定定期归档保存。
18. 参考文献
中山大学达安基因《丙型肝炎病毒核酸定量检测（PCR-荧光探针法）试剂盒说明书》
19. 相关表格
19.1 SYHR-MP0304-15.01.V1 《基因检测流程登记表》