生物酶工程省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

Ch6 Ch6 生物酶工程生物酶工程生物酶工程生物酶工程生物酶工程（生物酶工程（Biological Enzyme Engineering）：）：是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白催化特征或酶蛋白蛋白质特征等。改进酶蛋白催化特征或酶蛋白蛋白质特征等。本章主要介绍本章主要介绍 核酶、进化酶、杂合酶和抗体酶相关核酶、进化酶、杂合酶和抗体酶相关基本概念和基本知识。基本概念和基本知识。第1页Ch6-1 核酶核酶(Ribozyme)u到当前为止，除了我们传统概念酶到当前为止，除了我们传统概念酶蛋白质外，还蛋白质外，还发觉另一类含有催化活性物质发觉另一类含有催化活性物质核酸。核酸。u这里核酶要和核酸酶（这里核酶要和核酸酶（Nuclease）概念区分开来，前）概念区分开来，前者是酶化学本质是核酸；后者是指催化核酸水解酶，者是酶化学本质是核酸；后者是指催化核酸水解酶，其化学本质是蛋白质；其化学本质是蛋白质；u1981年年Cech等发觉四膜虫核糖体前体等发觉四膜虫核糖体前体RNA能够在没有能够在没有酶蛋白存在情况下，本身催化切除内涵子，完成加工酶蛋白存在情况下，本身催化切除内涵子，完成加工过程；发觉了含有催化活性过程；发觉了含有催化活性RNA，从而提出了核酶这，从而提出了核酶这个概念。个概念。u因为核酶含有很多与酶蛋白截然不一样特点，尤其在因为核酶含有很多与酶蛋白截然不一样特点，尤其在医学界优势更为突出，用于基因治疗能够克服一直困医学界优势更为突出，用于基因治疗能够克服一直困扰人们免疫问题。所以近些年来引发了酶工程研究领扰人们免疫问题。所以近些年来引发了酶工程研究领域极大热情。域极大热情。到当前为止，已经发觉天然核酶作用底物都是核酸，按其催到当前为止，已经发觉天然核酶作用底物都是核酸，按其催化反应可分两类：化反应可分两类：剪切型核酶：这类核酶主要催化本身或异体剪切型核酶：这类核酶主要催化本身或异体RNA切割，相当于核切割，相当于核酸内切酶作用。酸内切酶作用。当前发觉剪切型核酶包含三种：当前发觉剪切型核酶包含三种：锤头型核酶锤头型核酶 R.Symons研究一研究一些植物病毒些植物病毒RNA本身剪切功效后，提出了锤头状二级结构模型；本身剪切功效后，提出了锤头状二级结构模型；发卡型核酶发卡型核酶 发卡型核酶二级结构象一个发卡装，由发卡型核酶二级结构象一个发卡装，由50个碱基组个碱基组成，它和底物成，它和底物14个碱基共同组成一个发卡结构，识别次序是个碱基共同组成一个发卡结构，识别次序是NGUC，在，在N-G之间切割。之间切割。蛋白质蛋白质RNA 复合酶复合酶 由蛋白质和由蛋白质和M1RNA两个部分组成，其中蛋白质分子量两个部分组成，其中蛋白质分子量Da，RNA部分函部分函377个碱基。催个碱基。催化活性完全有化活性完全有RNA部分完成，蛋白质部分只是维护部分完成，蛋白质部分只是维护RNA构象，主构象，主要功效是剪切修饰要功效是剪切修饰tRNA。剪接型核酶：这类核酶主要催化剪接型核酶：这类核酶主要催化mRNA前体修饰加工，前体修饰加工，切除内含子，并完成片段拼接；切除内含子，并完成片段拼接；主要包含组主要包含组内含子内含子和组和组内含子。内含子。Cech 研究发觉四膜虫核糖体研究发觉四膜虫核糖体RNA前体，含有本身切前体，含有本身切除除413 碱基碱基intron，并进行片段拼接功效，深入研究，并进行片段拼接功效，深入研究发觉，其发觉，其Intron 本身含有催化本身含有催化RNA前体剪辑功效。前体剪辑功效。脱氧核酶：脱氧核酶：前述核酶化学本质是前述核酶化学本质是RNA，在发觉，在发觉RNA核酶后，很核酶后，很快就发觉了切割快就发觉了切割RNA和和DNADNA核酶。核酶。1994年，年，Breaker 利用体外选择技术，首次发觉了切利用体外选择技术，首次发觉了切割割RNADNA分子，命名为脱氧核酶（分子，命名为脱氧核酶（DNAzyme）关于核酶应用前景关于核酶应用前景关于核酶研究，主要目标是将其应用于基因治疗，总体上讲，当关于核酶研究，主要目标是将其应用于基因治疗，总体上讲，当前处于研究阶段。前处于研究阶段。u开发企业治疗对象治疗对象研究阶段研究阶段American CyanamidColumbia UniversityGene ShearsInnovirOsaka UniversityRibozyme Ph.Inc.Tokyo UniversityuB细胞白血病-淋巴瘤u人免疫缺点病毒u人免疫缺点病毒u乙肝病毒，丙肝病毒u乙肝病毒，丙肝病毒u丙肝病毒u人免疫缺点病毒u血管生长因子u丙肝病毒临床前期临床前期临床前期临床前期一、二期临床一、二期临床临床前期临床前期临床前期临床前期临床前期临床前期一、二期临床一、二期临床临床前期临床前期临床前期临床前期关于核酶用于基因治疗研究存在主要问题关于核酶用于基因治疗研究存在主要问题 体内运输与细胞吸收及残留问题：体内运输与细胞吸收及残留问题：切割位点特异性选择问题：切割位点特异性选择问题：本身稳定性问题：本身稳定性问题：毒性和免疫原性问题：毒性和免疫原性问题：第2页Ch6-2 酶分子定向进化酶分子定向进化（Directed Evilution）u酶分子定向进化是指在分子水平上，人为地创造特殊进化条件，酶分子定向进化是指在分子水平上，人为地创造特殊进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质酶蛋白。基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质酶蛋白。u对酶蛋白分子改造，主要包含两个方面，即酶分子改造合理化对酶蛋白分子改造，主要包含两个方面，即酶分子改造合理化设计（设计（Rational Design）和非合理设计（）和非合理设计（Irrational Design）u合理化设计：主要指事先已经搞清楚了酶蛋白结构，有明确修合理化设计：主要指事先已经搞清楚了酶蛋白结构，有明确修饰目标，定点改造某一结构活某氨基酸而设计改造修饰方案，饰目标，定点改造某一结构活某氨基酸而设计改造修饰方案，如酶蛋白化学修饰、酶蛋白基因定点突变等；如酶蛋白化学修饰、酶蛋白基因定点突变等；u非合理设计：非合理设计：事先无须确定基因改造修饰目标，设计酶蛋白基事先无须确定基因改造修饰目标，设计酶蛋白基因改造技术和方法，设计基因改造方案，然后按照预定目标要因改造技术和方法，设计基因改造方案，然后按照预定目标要求，进行筛选。酶分子定向进化就属于非合理设计。求，进行筛选。酶分子定向进化就属于非合理设计。1.酶分子定向进化方法：酶分子定向进化方法：当前已经研究成功酶蛋白分子定向进化方法只要包当前已经研究成功酶蛋白分子定向进化方法只要包含一下几个方面：含一下几个方面：易错易错PCR方法；方法；DNA改组方法；改组方法；基因家族之间同源重组方法；基因家族之间同源重组方法；易错易错PCR法：法：易错易错PCR是在利用是在利用PCR（Polymerase Chain Reaction）技术在）技术在Taq聚合酶催化下，对目标基因进行聚合酶催化下，对目标基因进行扩增，经过调整反应条件（提升扩增，经过调整反应条件（提升Mg 2浓度、加入浓度、加入Mn 2 改变反应体系中四种改变反应体系中四种dNTP百分比浓度等）百分比浓度等），改变，改变Taq酶催化目标基因扩增中突变频率，以一定频率随机酶催化目标基因扩增中突变频率，以一定频率随机构件了基因突变库，然后选择或筛选符合需要突变体。构件了基因突变库，然后选择或筛选符合需要突变体。易错易错PCR关键在于一下两点控制：关键在于一下两点控制：每个目标基因突变碱基数要严格控制：突变率不应每个目标基因突变碱基数要严格控制：突变率不应太高，太高时酶基因突变太大，酶固有活力不易保持，太高，太高时酶基因突变太大，酶固有活力不易保持，太低不易实现酶分子有效进化，普通理论上讲每个靶太低不易实现酶分子有效进化，普通理论上讲每个靶基因导入突变碱基数控制在基因导入突变碱基数控制在1.55个；个；普通一次突变极难取得有用突变，所以在设计易错普通一次突变极难取得有用突变，所以在设计易错PCR时，是设计连续易错时，是设计连续易错PCR 扩增，连续进行随机突扩增，连续进行随机突变，从而取得符合进化目标突变体。变，从而取得符合进化目标突变体。易错易错PCR定向进化应用实例：定向进化应用实例：利用易错利用易错PCR定向进化定向进化L天冬氨酸酶实例天冬氨酸酶实例设计工作程序：易错设计工作程序：易错PCR筛选突变体筛选突变体（优势突变（优势突变重组重组筛选）；筛选）；研究结果：研究结果：取得了一株酶活力提升取得了一株酶活力提升28倍突变体；而且倍突变体；而且进化酶进化酶pH稳定性和热稳定性都显著优于原始酶。稳定性和热稳定性都显著优于原始酶。深入测序研究表明进化后突变体共发生了深入测序研究表明进化后突变体共发生了7个碱基突变，个碱基突变，其中其中3个突变位点引发了氨基酸改变个突变位点引发了氨基酸改变Asn217Lys；Thr233 Arg；Val367 Gly第3页Ch6-2 酶分子定向进化酶分子定向进化（Directed Evilution）uDNA改组技术改组技术uDNA改组技术是在易错改组技术是在易错PCR方法基础上发展起来，方法基础上发展起来，构想经过易错构想经过易错PCR取得两个或两个以上正突变突变取得两个或两个以上正突变突变体，假如将这些正突变突变部位整合到一个突变体体，假如将这些正突变突变部位整合到一个突变体上，会取得更为突出定向进化效果。上，会取得更为突出定向进化效果。u详细方法是将多个正突变突变体混合，然后用脱氧详细方法是将多个正突变突变体混合，然后用脱氧核糖核酸酶核糖核酸酶进行随机切割，得到随机进行随机切割，得到随机DNA片段，片段，然后进行然后进行PCR扩增，此时随机扩增，此时随机DNA片段互为模版片段互为模版（Template）或引物（）或引物（Primer），直到取得全长基因），直到取得全长基因片段后，进行分离和筛选，以取得高效突变体。片段后，进行分离和筛选，以取得高效突变体。基因家族之间同源重组基因家族之间同源重组本定向进化方法是利用自然界中天然存在基因家族出本定向进化方法是利用自然界中天然存在基因家族出发，利用它们之间同源次序进行重组，这种方法取得发，利用它们之间同源次序进行重组，这种方法取得高效突变几率较大，而且盲目性小，轻易取得理想进高效突变几率较大，而且盲目性小，轻易取得理想进化效果。化效果。研究报道实例：研究报道实例：Stemmer等利用来自等利用来自4种微生物编码头孢菌素酶基因进种微生物编码头孢菌素酶基因进行同源重组进化研究，取得了进化重组体产酶活性提行同源重组进化研究，取得了进化重组体产酶活性提升了升了270倍。倍。2.酶分子定向进化酶工程意义酶分子定向进化酶工程意义酶分子定向进化研究实践表明，酶分子定向进化研究实践表明，在改造、修饰酶蛋白分在改造、修饰酶蛋白分子方面主要表达以下几点：子方面主要表达以下几点：提升酶分子催化活力提升酶分子催化活力 提升酶催化活力一直是酶工程提升酶催化活力一直是酶工程研究最实际、最有价值研究热点之一。研究最实际、最有价值研究热点之一。关于定向进化提升酶催化活力实例前已列举，这里提升关于定向进化提升酶催化活力实例前已列举，这里提升酶催化活力和提升产酶菌株产酶活力概念要加以区分，酶催化活力和提升产酶菌株产酶活力概念要加以区分，酶分子定向进化是经过对酶蛋白分子进行改造来实现酶酶分子定向进化是经过对酶蛋白分子进行改造来实现酶活力提升；但传统在酶工程研究领域，对产酶菌株进行活力提升；但传统在酶工程研究领域，对产酶菌株进行诱变育种、培育，实现产酶活力提升，后者不排除有造诱变育种、培育，实现产酶活力提升，后者不排除有造成酶蛋白分子发生改变可能，但更主要是经过点突变，成酶蛋白分子发生改变可能，但更主要是经过点突变，改变细胞代谢调控机制而实现产酶活力提升。改变细胞代谢调控机制而实现产酶活力提升。改进酶蛋白稳定性：改进酶蛋白稳定性：提升酶蛋白稳定性，尤其是热稳提升酶蛋白稳定性，尤其是热稳定性提升，是酶工程研究另一研究热点。因为在关于生定性提升，是酶工程研究另一研究热点。因为在关于生产中，提升反应温度，能够提升底物溶解度、降低反应产中，提升反应温度，能够提升底物溶解度、降低反应介质黏度，提升酶催化活力，尤其是预防在生产过程中介质黏度，提升酶催化活力，尤其是预防在生产过程中微生物污染。微生物污染。Zhao H 等在对枯草杆菌蛋白酶进行定向进化研究中，等在对枯草杆菌蛋白酶进行定向进化研究中，取得了很大成功，他们利用易错取得了很大成功，他们利用易错PCR 和突变体和突变体DNA 改改组方法，并进行提升温度筛选条件进行重组体筛选，使组方法，并进行提升温度筛选条件进行重组体筛选，使枯草杆菌蛋白酶最适催化温度提升了枯草杆菌蛋白酶最适催化温度提升了17（65）在在最适温度下半衰期增加了最适温度下半衰期增加了200倍。倍。改进酶蛋白底物专一性改进酶蛋白底物专一性 依据酶蛋白在生产中应用特依据酶蛋白在生产中应用特点，能够有目标地经过分子定向进化，提升或降低底物点，能够有目标地经过分子定向进化，提升或降低底物专一性。专一性。经过定向进化，降低经过定向进化，降低Km值实例很多，经过对进化酶蛋值实例很多，经过对进化酶蛋白动力学研究，证实很多经过催化效率进化酶白动力学研究，证实很多经过催化效率进化酶Km值大值大大降低。大降低。经过酶蛋白分子对应用环境适应能力经过酶蛋白分子对应用环境适应能力 许多酶蛋白催化适应环境是在长久生物体内催化环境进化形成，而在使用中，极难模拟体内催化环境，经过定向进化，能够提升酶蛋白对催化环境适应能力。如：在洗涤剂生产中，添加枯草杆菌蛋白酶，以增加洗涤剂去污能力，添加去脂肪酶增加去油渍能力，而这些酶需要有特定金属离子作为配基时，才能发挥良好催化活性，而在洗涤过程中，往往在洗涤剂中都加有去离子熬合剂，对酶蛋白不利，利用定向进化改造酶蛋白适应环境极为必要。Bryant报道利用定向进化方法，对枯草杆菌蛋白酶改造，去除了结合Ca环突结构，取得了一株产不依赖Ca蛋白酶枯草杆菌菌株。第4页Ch6-3 Ch6-3 酶基因定点突变酶基因定点突变酶基因定点突变酶基因定点突变u定定点点突突变变是是对对已已知知序序列列基基因因(或或DNA)DNA)中中任任意意指指定定位位置置进进行行突突变变技技术术，它它又又能能够够分分为为寡寡核核苷苷酸酸诱诱导导和和寡寡核核苷苷酸酸置置换换两两大大类类。分分别别适适合合用用于于不不一一样样类类型型预预先先确确定定突突变氨基酸位置突变试验。变氨基酸位置突变试验。第5页Ch6-3 酶基因定点突变酶基因定点突变1.寡聚核苷酸诱导定点突变寡聚核苷酸诱导定点突变u这项技术主要是利用带有预定突变序列寡核苷酸单链这项技术主要是利用带有预定突变序列寡核苷酸单链引物，在体外与原基因序列退火，诱导合成少许完整引物，在体外与原基因序列退火，诱导合成少许完整突变基因，然后，经过体内增殖得到大量突变基因。突变基因，然后，经过体内增殖得到大量突变基因。这类技术最早应用是这类技术最早应用是HutehisonHutehison和和RazillRazill等人，分别等人，分别用合成寡核苷酸引物诱导了用合成寡核苷酸引物诱导了X174X174单链噬菌体单链噬菌体DNADNA嘌嘌吟点突变。以后，逐步改用吟点突变。以后，逐步改用M13M13单链噬菌体单链噬菌体DNADNA作为基作为基因载体，突变技术也日趋成熟。因载体，突变技术也日趋成熟。定点突变基本操作程序：定点突变基本操作程序：(1)(1)将将酶酶基基因因(包包含含结结构构基基因因和和起起动动基基因因)克克隆隆到到M13(M13(一一个个单单链链DNADNA噬菌体噬菌体)上上(或质粒上或质粒上)，由此得到模板，由此得到模板(以下称以下称“正链正链”)”)。(2)(2)化化学学合合成成含含有有所所需需突突变变次次序序寡寡核核苷苷酸酸引引物物，这这段段“突突变变引引物物”核苷酸次序，除预定突变部位外，其余次序与核苷酸次序，除预定突变部位外，其余次序与“正链正链”互补。互补。(3)(3)合合成成含含突突变变次次序序双双链链M13 M13 DNADNA，即即是是将将合合成成突突变变引引物物5 5端端磷磷酸酸化化后后，与与“正正链链”DNA”DNA退退火火，这这时时突突变变引引物物与与“正正链链”欲欲突突变变部部位位，形形成成含含错错误误配配正正确确双双链链，然然后后加加入入DNADNA聚聚合合酶酶(惯惯用用大大肠肠杆杆菌菌DNADNA聚聚合合酶酶I)I)和和四四种种dNTPdNTP，将将引引物物延延伸伸，合合成成全全部部互互补补双双链链、并并由由T4T4噬噬菌菌体体DNADNA连连接接酶酶封封口口，得得到到共共价价闭闭环环双双链链DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)。并用超离心或凝胶过滤等技术分离纯化双链并用超离心或凝胶过滤等技术分离纯化双链DNADNA。(4)将将双双链链DNA转转染染受受体体菌菌(比比如如大大肠肠杆杆菌菌F株株)使使其其扩扩增增。从从所所得得到到噬噬菌菌斑斑分分离离单单链链DNA。经经印印迹迹转转移移至至硝硝酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜上上，把把上上述述突突变变引引物物标标识识532P作作为为探探针针，进进行行杂杂交交(退退火火)，此此时时突突变变型型单单链链DNA与与探探针针全全部部互互补补，而而野野生生型型(未未突突变变者者)与与探探针针之之间间，存存在在错错误误配配对对，在在高高温温洗洗涤涤时时，这这种种互互补补链链，易易解解链链，探探针针被被洗洗掉，因而留下来互补链，可能是突变酶基因链。掉，因而留下来互补链，可能是突变酶基因链。(5)由由筛筛选选到到含含突突变变酶酶基基因因受受体体菌菌株株，深深入入纯纯化化，分分离离DNA，测测定突变部位次序，与预定序列相符者，即为所要求突变酶基因。定突变部位次序，与预定序列相符者，即为所要求突变酶基因。(6)将将含含有有突突变变酶酶基基因因M13，转转化化高高效效表表示示体体菌菌、溶溶菌菌后后即即可可收收得大量突变酶。得大量突变酶。这个方法有许多主要优点这个方法有许多主要优点:它它能能够够准准确确地地在在基基因因预预定定位位置置导导入入任任何何所所需需突突变变，并有有效筛选伎俩取得突变基因；并有有效筛选伎俩取得突变基因；它它对对目目标标基基因因本本身身结结构构没没有有任任何何附附加加要要求求(如如要要求求它它在在某某处处含含有有某某种种限限制制位位点点之之类类)，能能够够直直接接地地用用于于各各种需要突变基因；种需要突变基因；这这个个方方法法步步骤骤比比较较简简单单、技技术术比比较较成成熟熟，所所以以，当前在蛋白质工程研究中得到了广泛应用。当前在蛋白质工程研究中得到了广泛应用。这个方法也有一些缺点，这个方法也有一些缺点，最最突突出出一一个个缺缺点点是是突突变变基基因因产产率率较较低低，噬噬菌菌体体后后代代带带有有所所需需突突变变比比率率经经常常远远低低于于理理论论值值(50(50)。在在一一些些场场所所，尤尤其其当当需需要要进进行行较较多多突突变变工工作作时时，突突变变率率低低是是很很不不利利，近年来，针对这一缺点，提出了许多改进方案。近年来，针对这一缺点，提出了许多改进方案。第6页Ch6-3 酶基因定点突变酶基因定点突变2.寡聚核苷酸寡聚核苷酸置换置换定点突变定点突变u 寡寡核核苷苷酸酸诱诱导导定定点点突突变变法法，只只适适合合用用于于将将蛋蛋白白质质中中某某一一氨氨基基酸酸，转转变变为为预预定定另另一一个个氨氨基基酸酸。但但假假如如事事先先不不能能确确定定转转变变产产物物，需需将将每每一一个个可可能能代代替替氨氨基基酸酸逐逐一一试试验验时时候候，就就要要同同时时进进行行某某一一位位点点各各种种突突变变。适适合合这类要求突变方法，就是寡核苷酸置换定点突变法。这类要求突变方法，就是寡核苷酸置换定点突变法。u 这这类类方方法法特特点点是是，用用带带有有各各种种所所需需突突变变序序列列寡寡核核苷苷酸酸，在在体体外外直直接接置置换换目目标标基基因因中中欲欲变变部部位位而而实实现现突突变变。因因为为是是直直接接置置换换，所所以以不不需需要要进进行行退退火火和和诱诱导导合合成成。然然而而置置换换过过程程需需要要限限制制性性酶酶切切和和连连接接酶酶连连接接，所所以以必必须须在在双双链链DNADNA之之间间进进行行。寡寡核核苷苷酸酸是是双双链链，目目标标基因及其载体基因及其载体(质粒或质粒或 Phage M13)Phage M13)也是双链。也是双链。盒式突变盒式突变(Cassette mutagenesis)(Cassette mutagenesis)本本方方法法是是这这类类技技术术代代表表。所所谓谓盒盒(Cassette)(Cassette)就就是是指指与与目目标标基基因因欲欲变变部部位位对对应应化化学学合合成成一一系系列列双双链链寡寡核核苷苷酸酸，它它们们带带有有各各种种能能选选取取突突变变序序列列。当当进进行行突突变变处处理理时时，依依据据试试验验需需要要把把各各种种突突变变“盒盒”插插入入目目标标基基因因中中，如如同同把把盒盒式式录录音音带带插插入入录录音音机机一一样样，非非常常灵灵活活方方便便，用用此此技技术术可可使使蛋蛋白白质质中中某某种种氨氨基基酸酸残残基基一一次次分分别别为为各各种种氨氨基基酸酸取取代。代。实例：实例：枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶(Subtilisin)(Subtilisin)活活性性中中心心包包括括Ser-221Ser-221残残基基，与与其其邻邻近近是是Met-222Met-222。因因为为Met-222Met-222存存在在，使使该该酶酶易易被被氧氧化化失失活活。因因为为事事先先无无法法确确定定哪哪种种氨氨基基酸酸取取代代Met-222Met-222后后会会既既改改进进对对氧氧化化稳稳定定性性，又又不不致致猛猛烈烈降降低低酶酶活活力力，故故采采取取这种盒式突变技术对该酶进行修饰。这种盒式突变技术对该酶进行修饰。完完整整枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶基基因因在在质质粒粒PS4.5一一个个1.5KbEcoR I-BamHI消化消化片段中。片段中。将将此此片片段段连连接接到到噬噬菌菌体体M13mp9上上，组组成成一一个个单单链链重重组噬菌体组噬菌体DNA(M13mp9 SUBT)。合合成成一一个个38体体寡寡聚聚脱脱氧氧核核苷苷酸酸引引物物，该该引引物物缺缺失失包包含含Met-222在在内内10个个核核苷苷酸酸，并并在在其其两两侧侧分分别别创创造造了了限限制酶制酶Kpn I和和Pst I新切点。新切点。以以此此核核苷苷酸酸为为引引物物，以以M13mp9SUBT为为模模板板，在在DNA聚聚合合酶酶I(Klenow)和和T4 DNA连连接接酶酶催催化化下下体体外外复复制制成新突变成新突变DNA分子。分子。用用EcoRI-BamH I 消消化化后后取取得得DNA片片段段，再再克克隆隆到穿梭质粒到穿梭质粒pBS42上，取得质粒上，取得质粒p222。用用限限制制酶酶Kpn I和和Pst I消消化化这这个个质质粒粒，形形成成切切口口，将将5种种双双链链25体体寡寡核核苷苷酸酸混混合合物物(库库)在在连连接接酶酶催催化化下下插插入入切口，形成五种不一样重组质粒。切口，形成五种不一样重组质粒。用用此此混混合合质质粒粒转转化化大大肠肠杆杆菌菌，培培养养后后提提取取质质粒粒。分分离离单单菌菌落落质质粒粒DNA，测测定定DNA序序列列，筛筛选选突突变变质质粒粒即即取得了目标基因。取得了目标基因。第7页Ch6-4 杂合酶杂合酶1.杂合酶定义：杂合酶定义：杂合酶（杂合酶（hybrid enzyme）：又可翻译成杂交酶。）：又可翻译成杂交酶。杂合酶是由两种以上酶成份组成，把来自不一样酶杂合酶是由两种以上酶成份组成，把来自不一样酶分子中结构单元（单个功效基团、或功效域）、或分子中结构单元（单个功效基团、或功效域）、或是整个酶分子进行组合或交换而产生含有所需要酶是整个酶分子进行组合或交换而产生含有所需要酶性质优化杂合体。这一点和酶家族基因同源重组有性质优化杂合体。这一点和酶家族基因同源重组有些类似。些类似。杂合酶取得包含非合理设计方法（经过构建基杂合酶取得包含非合理设计方法（经过构建基因库进行杂交重组，然后定向筛选）；合理设计方因库进行杂交重组，然后定向筛选）；合理设计方法（对操作对象结构和功效研究详尽后，有目标地法（对操作对象结构和功效研究详尽后，有目标地克隆基因片段进行重组）。克隆基因片段进行重组）。研究杂合酶意义：研究杂合酶意义：处理天然酶在不一样工业化应用环境条件处理天然酶在不一样工业化应用环境条件下稳下稳 定定 性问题；性问题；处理在应用过程中酶蛋白对蛋白酶水解作处理在应用过程中酶蛋白对蛋白酶水解作用敏感性问题；用敏感性问题；提升酶催化效率或比活力；提升酶催化效率或比活力；经过杂交取得含有新酶学性质酶；经过杂交取得含有新酶学性质酶；经过杂交技术研究酶酶蛋白结构与功效关经过杂交技术研究酶酶蛋白结构与功效关系。系。第8页Ch6-抗体酶抗体酶抗体酶（抗体酶（Abzyme）：）：指在抗体易变区赋予酶催化活性后免疫球蛋白，指在抗体易变区赋予酶催化活性后免疫球蛋白，又叫催化抗体（又叫催化抗体（Catalytic Antibody）最最 初初 是是 Schtlltz等等 人人(1986年年)和和 Lerner小小 组组(1986年年)利利用用半半抗抗原原接接上上载载体体蛋蛋白白，然然后后经经过过培培养养单单克克隆隆抗抗体体，而而取取得得含含有有酶酶活活性性抗抗体体。在在酶酶学学、酶酶工工程程、分分子子生生物物学学中中，抗抗体体酶酶出出现现含含有有划划时时代代意义。意义。从从理理论论上上讲讲，抗抗体体酶酶打打破破了了酶酶和和抗抗体体之之间间绝绝然然不不一一样样界界限限。自自1986年年以以来来，已已经经制制成成抗抗体体酶酶达达50种之多；包含了种之多；包含了6大类反应类型几十种反应。大类反应类型几十种反应。抗体酶制备方法抗体酶制备方法 拷贝法：引入法 诱导法抗体酶研究热点问题：第9页第10页第11页第12页