生物大分子的电子显微镜技术市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

生物大分子电子显微镜技术第1页n关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类n硕士物大分子意义：理化特征及空间构像与功效硕士物大分子意义：理化特征及空间构像与功效n硕士物大分子方法硕士物大分子方法 物理化学方法探讨理化特征物理化学方法探讨理化特征 X X射线衍射技术分析结晶样品射线衍射技术分析结晶样品 电子显微镜直接观察技术电子显微镜直接观察技术第2页核酸电子显微镜研究技术核酸电子显微镜研究技术n核酸分类核酸分类：n核小体核小体DNA 与蛋白质聚合一起组成染色体单位DNA 双链dsDNA、线性，超螺旋，单链 ssDNARNA 单链 ssRNA 、线性，三叶草形 双链dsRNA第3页核酸分子电镜观察要求核酸分子电镜观察要求:n核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展长链核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展长链;n核酸分子太细需要加粗；核酸分子太细需要加粗；n提升电子反差。提升电子反差。第4页分子长度测量及计算分子长度测量及计算n对已知标准分子进行观察和计算，完整分子长度对已知标准分子进行观察和计算，完整分子长度应相对一致。应相对一致。n观察观察100100个以上分子，拍像统计；个以上分子，拍像统计；n矫正电镜放大倍数；矫正电镜放大倍数；n测量分子，测量分子，5020050200份单分子；份单分子；n统计学方法计算平均值，作出长度分布图；统计学方法计算平均值，作出长度分布图；n用已知标准分子进行对照测算用已知标准分子进行对照测算n经验公式：经验公式：ds 1um=2.07X10ds 1um=2.07X106 6DaDa s s 1um=1.20X10 s s 1um=1.20X106 6DaDa第5页特点和应用n样品量少；操作简便；制备样品时间短。样品量少；操作简便；制备样品时间短。n适合观察核酸分子形状和长度、双链或单链区适合观察核酸分子形状和长度、双链或单链区分、依据长度计算核酸分子量；分、依据长度计算核酸分子量；n进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；体、核酸蛋白质复合体等研究；n基因组织结构、基因片段缺失、断裂基因、插基因组织结构、基因片段缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面研入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面研究。究。第6页蛋白质单分子展层操作n对核酸样品和试剂要求：对核酸样品和试剂要求：1.核酸样品纯度高，去除其它混杂核酸和蛋白质成份；核酸样品纯度高，去除其它混杂核酸和蛋白质成份；2.核酸样品为新鲜制备核酸样品为新鲜制备,并尽可能保持其长链完整性并尽可能保持其长链完整性;3.样品浓度在样品浓度在5ugml以上以上;4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其它污染样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其它污染;5.溶液溶液PH在在610之间之间;6.展层碱性蛋白常选择细胞色素展层碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯电泳纯;7.所用试剂为分析纯所用试剂为分析纯,器具洁净器具洁净,无去污剂等残留无去污剂等残留;8.制备制备RNA样品试剂与器具须高温烘烤样品试剂与器具须高温烘烤,使使RNA酶失活酶失活.第7页染色与投影n染色染色-增加核酸分子电子密度增加核酸分子电子密度 样品展层后样品展层后,粘取至铜网上粘取至铜网上,经过染色和金属投经过染色和金属投影以增强反差影以增强反差.染色液为染色液为12%12%PTA,(PTA,(用用90%90%乙乙醇配制醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml浓硫酸浓硫酸)或醋酸双氧或醋酸双氧铀铀,染色染色10301030秒后秒后.自然晾干自然晾干.n投影投影-使核酸细分子直径加粗使核酸细分子直径加粗 染色后样品以投影角度染色后样品以投影角度59,59,用铂用铂 钯合金进行钯合金进行旋转投影旋转投影,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜,以增加强度以增加强度.第8页染色与投影n染色染色-增加核酸分子电子密度增加核酸分子电子密度 样品展层后样品展层后,粘取至铜网上粘取至铜网上,经过染色和金属投经过染色和金属投影以增强反差影以增强反差.染色液为染色液为12%12%PTA,(PTA,(用用90%90%乙乙醇配制醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml浓硫酸浓硫酸)或醋酸双氧或醋酸双氧铀铀,染色染色10301030秒后秒后.自然晾干自然晾干.n投影投影-使核酸细分子直径加粗使核酸细分子直径加粗 染色后样品以投影角度染色后样品以投影角度59,59,用铂用铂 钯合金进行钯合金进行旋转投影旋转投影,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜,以增加强度以增加强度.第9页电镜观察要求n染色，投影后，核酸分子直径从染色，投影后，核酸分子直径从20A增至增至80100A，故在，故在10万倍以下能够观察到；万倍以下能够观察到；第10页蛋白质单分子膜展层技术原理蛋白质单分子膜展层技术原理n一些碱性蛋白质在低盐溶液或水表面形成不溶性变性一些碱性蛋白质在低盐溶液或水表面形成不溶性变性薄膜，单浓度和加到溶液表面量适当，该膜就展开成薄膜，单浓度和加到溶液表面量适当，该膜就展开成为单分子层，也就是一个多肽链组成分子网。假如将为单分子层，也就是一个多肽链组成分子网。假如将核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上氨基酸碱性基团核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上氨基酸碱性基团便与核酸分子链上酸性基团以水合键结合，核酸分子便与核酸分子链上酸性基团以水合键结合，核酸分子相对稳定地固着在蛋白质分子上。展层时，核酸分子相对稳定地固着在蛋白质分子上。展层时，核酸分子伴随蛋白质在溶液表面展开而被拉开伸展为弯曲二维伴随蛋白质在溶液表面展开而被拉开伸展为弯曲二维结构。因为蛋白质单分子膜作基础，使核酸分子保持结构。因为蛋白质单分子膜作基础，使核酸分子保持完整性，经捞网，染色，金属投影，电镜观察。完整性，经捞网，染色，金属投影，电镜观察。第11页特点和应用n样品量少；操作简便；制备样品时间短。样品量少；操作简便；制备样品时间短。n适合观察核酸分子形状和长度、双链或单链区适合观察核酸分子形状和长度、双链或单链区分、依据长度计算核酸分子量；分、依据长度计算核酸分子量；n进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；体、核酸蛋白质复合体等研究；n基因组织结构、基因片段缺失、断裂基因、插基因组织结构、基因片段缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面研入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面研究。究。第12页蛋白质单分子展层操作n对核酸样品和试剂要求：对核酸样品和试剂要求：1.核酸样品纯度高，去除其它混杂核酸和蛋白质成份；核酸样品纯度高，去除其它混杂核酸和蛋白质成份；2.核酸样品为新鲜制备核酸样品为新鲜制备,并尽可能保持其长链完整性并尽可能保持其长链完整性;3.样品浓度在样品浓度在5ugml以上以上;4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其它污染样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其它污染;5.溶液溶液PH在在610之间之间;6.展层碱性蛋白常选择细胞色素展层碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯电泳纯;7.所用试剂为分析纯所用试剂为分析纯,器具洁净器具洁净,无去污剂等残留无去污剂等残留;8.制备制备RNA样品试剂与器具须高温烘烤样品试剂与器具须高温烘烤,使使RNA酶失活酶失活.第13页样品配制样品配制n醋酸铵法醋酸铵法:上相液组成上相液组成:醋酸铵醋酸铵 (终浓度终浓度)0.52Mol(PH7.5)核酸样品核酸样品 0.51ugml 总体积总体积50ul 细胞色素细胞色素C 0.050.1mgml下相液下相液:0.050.25M醋酸铵水溶液或双蒸水醋酸铵水溶液或双蒸水甲酰铵法甲酰铵法:上相液组成上相液组成:Tris-Na3EDTA(PH8.5)0.10.01M 核酸样品核酸样品 0.51ugml 细胞色素细胞色素C 0.050.1mgml 甲酰铵甲酰铵 4050%下相液下相液:0.1MTris0.01MNa3EDTA(PH8.5),20%甲酰铵甲酰铵.第14页第15页展层方法及步骤展层展层1.样品溶液样品溶液(上相溶上相溶液液)2.展层液展层液(下相溶液下相溶液)3.滑石粉滑石粉 4.载玻片载玻片 5.加样器加样器12345.沾网沾网:将铜网膜面朝下将铜网膜面朝下,沾取液面上样品沾取液面上样品脱水与染色脱水与染色铜网以铜网以45角插入角插入无水乙醇片刻无水乙醇片刻,进进行脱水行脱水,以一样方以一样方法在法在2%PTA中染色中染色金属投影金属投影:在真空喷镀仪中在真空喷镀仪中对样品进行重金对样品进行重金属旋转投影属旋转投影.第16页微滴扩散法及单滴展开法适合微量样品操作适合微量样品操作,单滴展开单滴展开法展层样品液只需法展层样品液只需510ul,操作操作方法与展层方法相同方法与展层方法相同,可用可用16孔酶标板代用展层容器孔酶标板代用展层容器第17页一步释放法一步释放法 病毒，噬菌体等含核酸细胞器，不进行提取核酸，利病毒，噬菌体等含核酸细胞器，不进行提取核酸，利用展层上相用展层上相液液（2M2M醋酸铵），下醋酸铵），下相相液液（0.2M醋酸铵或醋酸铵或水溶液）水溶液）盐浓度巨大差异，高盐中病毒碰到低渗溶液而盐浓度巨大差异，高盐中病毒碰到低渗溶液而破裂，核酸分子破裂，核酸分子释放，并与细胞色素释放，并与细胞色素CC结合，伴随单分结合，伴随单分子层展开，所以，释放与展层在一步完成子层展开，所以，释放与展层在一步完成第18页染色与投影n染色染色-增加核酸分子电子密度增加核酸分子电子密度 样品展层后样品展层后,粘取至铜网上粘取至铜网上,经过染色和金属投经过染色和金属投影以增强反差影以增强反差.染色液为染色液为12%12%PTA,PTA,(用用90%90%乙乙醇配制醇配制,100,100mlml染液中含染液中含1 1mlml浓硫酸浓硫酸)或醋酸双氧或醋酸双氧铀铀,染色染色10301030秒后秒后.自然晾干自然晾干.n投影投影-使核酸细分子直径加粗使核酸细分子直径加粗 染色后样品以投影角度染色后样品以投影角度59,59,用铂用铂 钯合金进行钯合金进行旋转投影旋转投影,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜,以增加强度以增加强度.第19页电镜观察要求n染色，投影后，核酸分子直径从染色，投影后，核酸分子直径从20A增至增至80100A，故在，故在10万倍以下能够观察到；万倍以下能够观察到；n样品不进行投影，只染色，分子直径大小改样品不进行投影，只染色，分子直径大小改变不大，在视野中极难寻找。变不大，在视野中极难寻找。第20页无蛋白展层法n用蛋白质单分子展层技术，核酸分子被细胞用蛋白质单分子展层技术，核酸分子被细胞色素色素CC覆盖，再经染色和投影，分子直径从覆盖，再经染色和投影，分子直径从100A100A，不适合观察酶或蛋白质与核酸复合，不适合观察酶或蛋白质与核酸复合体，与核酸结合蛋白质组分被细胞色素体，与核酸结合蛋白质组分被细胞色素CC覆盖，覆盖，故提议用无蛋白展层技术。故提议用无蛋白展层技术。1.1.BACBAC法法 :用铵盐类低分子化合物氯化烃基二甲基苄基用铵盐类低分子化合物氯化烃基二甲基苄基铵代替细胞色素铵代替细胞色素C,C,能在下相液表面形成一层膜吸附核能在下相液表面形成一层膜吸附核酸酸,投影后投影后.核酸分子直径为核酸分子直径为4060A.4060A.2.2.加染料法加染料法:如溴乙啶、二碘丙啶加到如溴乙啶、二碘丙啶加到DNADNA溶液中溶液中,DNA,DNA分子吸附到云母片上分子吸附到云母片上,进行复型、投影进行复型、投影.第21页RNA展层技术第22页第23页从一个非洲蛙卵母细胞核中提取DNA8个基因片段。第24页5SDNA5SDNA部分变性部分变性第25页杂交重复分子第26页X174DNA,长度约1.8 m环状DNA(双链DNA)第27页病毒病毒DNADNA在细菌中复制时，蛋白质结在细菌中复制时，蛋白质结合在病毒合在病毒DNADNA尤其部分，也就是尤其部分，也就是DNADNA复复制开始点。制开始点。第28页能够看到大肠杆菌染色体能够看到大肠杆菌染色体二个片段，下边一个是活二个片段，下边一个是活动中。能够看到动中。能够看到mRNAmRNA转录转录和蛋白质翻译过程。和蛋白质翻译过程。第29页基因上RNA聚合酶第30页杂交杂交DNADNA分子分子 二条二条DNADNA分子分子 经过变性、退火处理形成缺失环和经过变性、退火处理形成缺失环和 置换泡置换泡第31页昆虫病毒核酸分子展层图第32页