白术叶片DNA提取方法的优化.pdf

白术叶片 DNA 提取方法的优化蒋小刚,王 华,周武先,由金文,张美德(湖北省农业科学院中药材研究所农业农村部中药材生物学与栽培重点实验室,湖北恩施 445000)摘要 目的优化白术叶片 DNA 提取方法,提取高质量DNA,用于分子生物学研究。方法以白术叶片为材料,比较常规 CTAB 法、改良 CTAB 法、SDS 法、试剂盒法提取 DNA 的效果,并对改良 CTAB 法中的裂解温度、裂解时间、核分离液解离次数进行优化,用琼脂糖凝胶电泳和微量核酸测定仪检测 DNA 的浓度和纯度。最后通过 ISSR-PCR 验证优化的改良 CTAB 法提取 DNA 的效果。结果4 种方法中,改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 效果最好。针对叶片的改良 CTAB 法的优化条件为裂解温度 65、裂解时间 20 min、解离次数 2 次;ISSR-PCR 验证结果表明扩增条带清晰稳定,无拖尾。结论优化后的改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 质量高,可用于白术种质资源遗传多样性分析。关键词 白术;DNA;提取方法;改良 CTAB 法中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2023)11-0128-04doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.032 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Optimization of DNA Extraction Method for Atractylodes macrocephala LeavesJIANG Xiao-gang,WANG Hua,ZHOU Wu-xian et al(Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine,Ministry of Agricul-ture and Rural Affairs,Institute of Chinese Herbal Medicines,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Enshi,Hubei 445000)Abstract ObjectiveTo optimize the DNA extraction method of Atractylodes macrocephala leaves and extract high-quality DNA for molecular biology research.MethodA.macrocephala leaves were used as material,the DNA extraction effects of four methods(conventional CTAB,modified CTAB,SDS and Kit method)were compared,and the cracking temperature,cracking time and times of nuclear separation liquid ex-traction in the modified CTAB method were optimized,the concentration and purity of the extracted DNA were detected by agarose gel electro-phoresis and spectrophotometer.Finally,the effects of DNA extracted by the modified CTAB method after optimization was verified by ISSR analysis.ResultAmong the four extraction methods,the modified CTAB method had the best extraction effects of DNA.The optimal extraction conditions of the improved CTAB method of leaves were as follows:cracking temperature was 65,cracking time was twenty minutes,dissocia-tion times was twice.The ISSR-PCR validation results showed that the amplified bands were clear and stable,without any trailing.ConclusionThe optimized CTAB method was effective in extracting DNA of A.macrocephala leaves.And it could be used for genetic diversity analysis of A.macrocephala.Key words Atractylodes macrocephala;DNA;Extraction method;Modified CTAB method基金项目现代农业产业技术体系建设专项(CARS-21);湖北省农业科技创新中心 2020 年重大科技研发项目(2020-620-000-002-04);湖北省重点研发计划项目(2020BCA059);湖北省农业科学院青年科学基金项目(2021NKYJJ19)。作者简介 蒋小刚(1991),男,湖北黄冈人,助理研究员,硕士,从事药用植物栽培与育种研究。通信作者,研究员,博士,从事药用植物栽培与育种研究。收稿日期 2022-07-08;修回日期 2022-08-12 白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)属于菊科苍术属多年生草本植物,以根茎入药,具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎的功效1。基于分子生物学技术开展药用植物种质资源评价工作尤为重要,而高效提取 DNA 是更好进行分子生物学研究的前提,此外,大多数药用植物组织中富含多糖、多酚等物质,常规方法提取的 DNA 较难满足 PCR、基因克隆、测序等分子生物学需求,因此很多学者开展了药用植物基因组 DNA 提取方法的优化研究,以建立高效提取高质量 DNA 的方法。邵亚林等2以杏黄兜兰叶片为材料,比较了 CTAB 法、改良 CTAB 法、高盐低 pH 法和 SDS 法提取 DNA 的效果,结果表明,改良 CTAB 法优于其他方法,但提取的 DNA 存在一定蛋白质污染,且未进行 PCR 扩增反应验证。郑斯斯等3以壳斗科植物叶片为材料,比较不同方法提取 DNA 效果并对最佳方法进行优化,结果表明,优化后的改良 CTAB 法提取 DNA 浓度和纯度高,适用于 PCR 扩增和酶切反应。针对不同药用植物或药用植物的不同组织,需建立相适应的 DNA提取方法,而有关白术不同组织基因组 DNA 提取方法的研究较少,多采用 CTAB 法。如黄恒等4对改良 CTAB 法和SDS 法提取白术叶片基因组 DNA 的效果进行比较,结果表明,改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 质量高于 SDS 法,可作为模板用于分子标记研究,但提取 DNA 用时较长;王志安等5采用 CTAB 法提取白术幼嫩叶片的基因组 DNA,并构建了 DNA 指纹图谱,结果表明,提取的白术基因组 DNA 适用于 AFLP 指纹图谱分析,但存在一定量蛋白质、多酚等物质污染;曹亮等6采用改良 CTAB 法提取白术、苍术的干种子DNA,并通过多重 PCR 技术对白术、苍术混杂种子进行鉴别,结果表明,提取的 DNA 模板满足于多重 PCR 反应,但提取 DNA 所需时间较长。也有研究采用试剂盒法提取白术DNA,如余亚东等7采用试剂盒法提取白术、苍术根茎 DNA,并建立了鉴别白术、苍术等的 DNA 条形码技术,结果表明,提取的 DNA 模板适用于 PCR 扩增及进一步的种质鉴定研究,但 DNA 提取量较低,且成本高。以上研究,以白术为研究对象,主要采用改良 CTAB 法提取基因组 DNA,基本能满足分子生物学的研究,但存在用时较长、DNA 质量偏低的问题,虽然试剂盒法能有效去除 DNA 中的多糖多酚物质,但成本较高、提取 DNA 量较少,同时伴随一定降解3。该研究以白术幼嫩叶片为材料,比较常规 CTAB 法、改良 CTAB 法、SDS 法、试剂盒法提取 DNA 的效果,并对改良 CTAB 法中的 安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(11):128-131裂解温度、裂解时间、解离次数等因素进行优化,然后用琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸检测仪检测 DNA 浓度和纯度,最后通过 ISSR-PCR 验证优化的改良 CTAB 法提取 DNA 的效果,以便用于白术遗传多样性分析、种质鉴定等研究。1 材料与方法1.1 试验材料 供试材料包括一年生白术幼嫩叶片。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)、核糖核酸 A(RNaseA)、氯仿、异戊醇、异丙醇、DL2000 DNA Marker、琼脂糖,均购自武汉中恩科技有限公司。主要仪器设备包括离心机(SIGMA 3K15)、电泳仪(DYCP-31DN)、超微量核酸蛋白测定仪(Thermo NANODROP ONE)、PCR 仪(DYY-12)。1.2 试验方法 1.2.1不同 DNA 提取方法。采用常规 CTAB 法、改良CTAB 法、SDS 法和试剂盒法提取白术叶片基因组 DNA。1.2.1.1常规 CTAB 法。参照马辉等8的方法并进行改进,具体步骤如下:取 0.2 g 白术幼嫩叶片于预冷研钵中,液氮中迅速研磨后转入 2 mL 离心管中,加入 800 L CTAB 核裂解液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;50 mmol/L EDTA,pH 8.0;1.4 mol/L NaCl;2%CTAB;2%PVP;2%-巯基乙醇)和20 mg/mL 蛋白酶 K 5 L,65 水浴40 min(期间每隔10 min轻轻摇动离心管一次),然后加入等体积的氯仿-异戊醇(241),混匀 30 min,12 000 r/min 离心 15 min,取上清液至 2 mL离心管中,然后加入等体积的预冷异丙醇,混匀,12 000 r/min离心 15 min,弃上清。用 95%乙醇清洗沉淀 2 次,室温风干,加 50 L TE 缓冲液溶解沉淀,加 5 L RNaseA(10 mg/mL)混匀,室温放置 30 min,-20 保存备用。1.2.1.2 改良 CTAB 法。取 0.2 g 白术幼嫩叶片于预冷研钵中,液氮中迅速研磨后转入 2 mL 离心管中,加入 1.5 mL 4 预冷的核分离液混匀,12 000 r/min 离心 10 min,弃上清收集沉淀,将上述收集沉淀按常规 CTAB 法提取。1.2.1.3SDS 法。参照王景雪等9的方法稍作改动,具体步骤如下:取 0.2 g 白术幼嫩叶片于预冷研钵中,液氮中迅速研 磨 后 转 入 2 mL 离 心 管 中,加 入 800 L 溶 液 I(500 mmol/L NaCl;50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;50 mmol/L EDTA;2%PVP;2%-巯基乙醇),置于室温数分钟至解冻;加入 280 L 10%SDS,轻轻混匀,4565 水浴 2040 min(期间每隔 10 min 轻轻摇动离心管一次);取出后立即置于冰上,并加入 120 L 5 mol/L 醋酸钾于冰上反应 30 min,在 12 000 r/min、4 下离心20 min;取上清液,加入等体积异丙醇,轻轻混匀后,-20 放置 1 h,于 4 下离心 20 min;弃上清液,用 500 L TE 缓冲液溶解沉淀,向其中加入 2/3体积的氯仿-异戊醇(24 1)混匀后,4、12 000 r/min 离心5 min;取上清液,向其中加入等体积的异丙醇和 1/10 体积的 3 mol/L NaCl,于-20 放置 1 h,于 4、12 000 r/min 离心 20 min;弃上清,用 95%乙醇洗涤沉淀 1 次,室温风干;加 50 L TE 缓 冲 液 溶 解 沉 淀,加 5 L RNaseA(10 mg/mL)混匀,室温放置 30 min,然后置于-20 保存备用。1.2.1.4 试剂盒法。采用天根生化科技(北京)有限公司生产的新型植物基因组提取试剂盒(DP320-02)。具体步骤如下:取植物新鲜组织100 mg 或干重组织20 mg 加入液氮充分 碾 磨;加 入 400 L 缓 冲 液 LP1 和 6 L RNaseA(10 mg/mL)旋涡振荡 1 min,室温放置 10 min;加入130 L 缓 冲 液 LP2,充 分 混 匀 旋 涡 振 荡 1 min,然 后12 000 r/min 离心 5 min,将上清移至新的离心管中;加入1.5 倍体积的缓冲液 LP3,立即充分振荡混匀 15 s,此时可能会出现絮状沉淀;将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中,然后12 000 r/min 离心30 s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CB3 放入收集管中;向吸附柱 CB3 中加入 600 L 漂洗液 PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),然后 12 000 r/min 离心 30 s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CB3 放入收集管中;重复操作步骤;12 000 r/min离心 2 min,倒掉废液,将吸附柱 CB3 室温放置 2 min 彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;将吸附柱 CB3 转入新的1.5 mL 离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加 50200 L洗脱缓冲液 TE,室温放置 2 min,12 000 r/min 离心 2 min,将溶液收集到离心管中。1.2.2 改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 的优化试验。1.2.2.1 裂解温度优化。采用改良 CTAB 法提取白术叶片DNA,裂解温度设为45、55、65,其他条件不变,详见“1.2.1.2”。1.2.2.2 裂解时间优化。采用改良 CTAB 法提取白术叶片DNA,裂解时间设为 20、30、40 min,其他条件不变,详见“1.2.1.2”。1.2.2.3 核分离液解离次数优化。采用改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA,解离次数设为 0、1、2 次,其他条件不变,详见“1.2.1.2”。1.2.3 DNA 提取浓度和纯度检测。1.2.3.1 超微量核酸蛋白测定仪检测。取 2 L DNA 提取液,用超微量核酸测定仪检测 DNA 浓度(ng/L)和纯度。DNA 提取量(mg/g)=DNA 浓度5010-6/组织鲜重或干重;DNA 质量判定标准:当 OD260/OD280=1.80 时,纯 DNA;当OD260/OD280为 1.802.00 时,属于正常范围;当 OD260/OD2802.00 时,说明有大量 RNA 污染;当 OD260/OD2801.80 时,说明有蛋白质、酚类等污染。1.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测。用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的 DNA 质量,并用凝胶成像系统检测拍照。1.2.3.3 改良 CTAB 法优化后的效果验证。采用优化的改良 CTAB 法提取白术叶片基因组 DNA,并以此为模板,用中药材条形码引物 ITS2(F:5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3,R:5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3)和 ISSR 引物UBC845(5-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3)进行扩增。PCR反应体系:20 L 反应体系中,2Taq Master Mix 10 L,模板DNA 1 L,引物 2 L,ddH2O 7 L。PCR 程序:94 预变性5 min;94 变性 0.50 min,56 退火 0.75 min,72 延伸92151 卷 11 期 蒋小刚等 白术叶片 DNA 提取方法的优化1.0 min,35 个循环;72 延伸 10 min,4 保存。用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。2 结果与分析2.1 不同方法提取白术叶片 DNA 的效果比较用常规CTAB 法、改良 CTAB 法、SDS 法和试剂盒法提取白术叶片基因组 DNA,结果如表 1 所示。4 种方法中,改良 CTAB 法的DNA 提取量最高,为 0.015 1 mg/g;试剂盒法的 DNA 提取量仅次于改良 CTAB 法;SDS 法提取量最低,仅为0.005 0 mg/g。除试剂盒法外的其他 3 种方法叶片 DNA 的 OD260/OD280在正常范围(1.802.00)。综上所述,改良 CTAB 法为提取白术叶片 DNA 的最优方法。表 1 不同方法提取白术叶片基因组 DNA 的效果比较Table 1 Comparison of the effects of different methods for extracting genomic DNA from A.macrocephala leaves提取方法Extraction methodDNA 提取量DNA extractionmg/gOD260/OD280常规 CTAB 法 Conventional CTAB method0.006 40.000 3 c1.880.01 a改良 CTAB 法 Modified CTAB method0.015 10.000 2 a1.960.06 aSDS 法 SDS method0.005 00.000 5 d1.840.02 ab试剂盒法 Kit method0.010 10.000 4 b1.710.10 b 注:同列不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P0.05).2.2 裂解温度对改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 效果的影响 由表 2 可知,裂解温度在 4555,随着裂解温度升高,改良 CTAB 法的白术叶片 DNA 提取量呈现升高的趋势。裂解温度为 65 时,DNA 提取量最高,达到了 0.027 7 mg/g。不同裂解温度下,白术叶片 DNA OD260/OD280在 1.921.96,表明不同裂解温度对改良 CTAB 法 DNA 提取纯度无明显影响。综上可知,改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 的最适裂解温度为 65。表 2 不同裂解温度下改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 的效果比较Table 2 Comparison of the effects of modified CTAB method extrac-ting DNA of A.macrocephala leaves at different cracking tem-perature裂解温度 Cracking temperatureDNA 提取量 DNA extractionmg/gOD260/OD28045 0.021 40.000 6 c1.940.05 a550.025 20.000 8 b1.960.01 a650.027 70.000 3 a1.920.01 a 注:同列不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P0.05).2.3 裂解时间对改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 效果的影响 由表 3 可知,裂解时间在 2040 min,随着裂解时间增加,白术叶片 DNA 提取量呈现不断下降的趋势,裂解时间为20 min 时,叶片 DNA 提取量最高(0.024 0 mg/g)。裂解时间为 20、30 min 时,叶片 DNA OD260/OD280为 1.951.97,DNA较为干净,无明显蛋白质、RNA 污染,而裂解时间为 40 min时,叶片 DNA OD260/OD280仅为 1.63,DNA 含有少量杂质,存在一定蛋白质、酚类物质污染。综上所述,改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 的最佳裂解时间为 20 min。表 3 不同裂解时间下改良 CTAB 法提取白术叶片基因组 DNA 的效果比较Table 3 Comparison of the effects of modified CTAB method extrac-ting DNA of A.macrocephala leaves in different cracking time裂解时间Cracking timeminDNA 提取量DNA extractionmg/gOD260/OD280200.024 00.000 4 a1.950.02 a300.011 30.000 5 b1.970.01 a400.010 10.000 5 b1.630.18 b 注:同列不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P0.05).2.4核分离液解离次数对改良 CTAB 法提取白术叶片DNA 效果的影响由表 4 可知,随着核分离液解离次数增加,叶片 DNA 提取量呈现逐渐增加的趋势,即叶片 DNA 提取量最大时的解离次数为 2 次。不同解离次数下,叶片 DNA OD260/OD280在正常范围(1.80 2.00)。综上所述,改良CTAB 法提取白术叶片 DNA 的最佳解离次数为 2 次。表 4 不同解离次数对改良 CTAB 法提取白术叶片基因组 DNA 的效果比较Table 4 Comparison of the effects of modified CTAB method extrac-ting DNA of A.macrocephala leaves under different dissocia-tion times解离次数Dissociation times次DNA 提取量DNA extractionmg/gOD260/OD28000.008 60.000 7 c1.890.01 a10.013 80.000 3 b1.900.06 a20.020 20.000 5 a1.930.15 a 注:同列不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P0.05).2.5 优化的改良 CTAB 法提取 DNA 的效果验证 用优化的改良 CTAB 法提取白术叶片基因组 DNA,以此为模板,用中药材条形码引物 ITS2 和引物 UBC845 进行扩增,验证提取DNA 的效果,结果如图 1 所示,扩增条带清晰稳定、无杂带,优化的改良 CTAB 法提取的白术叶片基因组 DNA 可用于后续白术遗传多样性分析、种质鉴定等研究。3 讨论与结论目前的研究多采用改良 CTAB 法的试剂盒法提取白术叶片、根茎、种子的基因组 DNA5-7,且仅有黄恒等4以白术叶片为材料比较了改良 CTAB 法、SDS 法提取 DNA 效果。该研究以白术叶片为材料,比较了常规 CTAB 法、改良 CTAB法、SDS 法、试剂盒法提取 DNA 效果,发现相比常规 CTAB法、SDS 法,改良 CTAB 法提取叶片 DNA 质量较高,与黄恒等4研究认为改良 CTAB 法提取白术叶片效果优于 SDS 法的结论一致。该研究中,改良 CTAB 法的 DNA 提取量略高于试剂盒法,且试剂盒法提取 DNA 成本较高。综合来看,改良 CTAB 法为提取白术叶片 DNA 的最佳方法。目前,改良031 安徽农业科学 2023 年注:M 为 DL 2 000 bp Marker;1-3 分别表示叶片样品。Note:M indicates DL 2 000 bp Marker;1-3 indicates leaf samples.图 1 引物 UBC845 和 ITS2 对白术叶片基因组 DNA 扩增结果Fig.1 Amplification results of genomic DNA of A.macrocephala leaves by primers UBC845 and ITS2CTAB 法已广泛应用于提取油菜等作物10-13的基因组 DNA,提取效果较好。针对特定的分子水平的研究,往往需要提取植物特定组织的 DNA,而不同组织或细胞结构、成分的差异导致同一方法提取不同组织 DNA 效果差异较大,因此需要优化适应于植物不同组织的 DNA 提取方法14。水浴裂解时间对于DNA 提取效果非常重要,裂解时间过短,DNA 不能释放完全,导致提取率较低,而裂解时间过长,DNA 会发生降解15。该研究通过分析改良 CTAB 法中裂解时间对白术叶片 DNA提取效果的影响,发现裂解时间为 20 min 时,叶片 DNA 的提取量最高,低于以白术叶片、种子为材料的研究采用的裂解时间5,7,9,表明该研究对白术改良 CTAB 法的裂解时间的优化效果较好。细胞质中多酚类等次生代谢物质会影响 DNA 提取量,PVP 能有效去除 DNA 中的多酚物质;-巯基乙醇能有效防止酚氧化成醌类物质,避免褐变,使酚易被去除;因此通过在核分离液中加入 PVP 和-巯基乙醇,经过核分离液除去多酚类物质,可有效提高 DNA 的提取量8,16-17。该研究通过分析改良CTAB 法中核分离液解离次数对白术叶片 DNA 提取效果的影响,发现白术叶片解离 2 次,DNA 提取量最高。优化后的改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 效果好,可用于白术遗传多样性分析、种质资源鉴定、分子辅助育种等。但该研究仅对改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 的主要影响因素进行优化,针对特定分子试验需求,还需做进一步改进,以更好开展后续白术分子生物学研究,为白术遗传多样性分析、种质鉴定等奠定基础。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020 年版 一部S.北京:中国医药科技出版社,2020:107.2 邵亚林,司俊波,常玮,等.杏黄兜兰基因组 DNA 提取方法比较J.园艺学报,2019,46(12):2449-2454.3 郑斯斯,李颖,黄清俊,等.壳斗科植物叶片高纯度基因组 DNA 提取方法的优化J.分子植物育种,2020,18(20):6725-6733.4 黄恒,王晓丽.采用 CTAB 与 SDS 法提取白术 DNA 的研究J.安徽农业科学,2013,41(7):2860-2861.5 王志安,徐行,沈晓霞,等.白术种质 AFLP 指纹图谱分析体系的建立和应用J.中药材,2008,31(4):483-487.6 曹亮,蒋超,彭华胜,等.白术、苍术种子位点特异性 PCR 鉴别方法研究J.中国中药杂志,2013,38(16):2567-2570.7 余亚东,石林春,马晓冲,等.白术与苍术及其混伪品 DNA 条形码鉴定研究J.中国中药杂志,2014,39(12):2194-2198.8 马辉,张智俊,罗淑萍,等.药用植物白术 DNA 提取方法的研究J.新疆农业大学学报,2007,30(2):13-16.9 王景雪,孙毅,高武军.一种简便实用的植物总 DNA 提取方法J.山西大学学报(自然科学版),2000,23(3):271-272.10 谢景梅,刘晓兰,曲存民,等.甘蓝型油菜成熟籽粒DNA 快速提取方法探讨J.作物杂志,2012(1):17-21.11 王惠,郭峰,关超,等.适用于 SSR 分析的半粒水稻干种子 DNA 快速提取J.科技导报,2013,31(25):58-60.12 丁海燕,丁晨.小麦籽粒 DNA 提取方法的比较及 SSR 反应体系的优化研究J.麦类作物学报,2016,36(3):287-291.13 董永军,王陆军,郝建平,等.玉米干种子基因组DNA 提取方法的改进J.山西农业科学,2017,45(12):1903-1906.14 BURAGOHAIN J,KONWAR B K.An efficient and reliable method of DNA 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